BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HÀ THỊ DUNG NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH ACID PHYTIC TỪ CÁM GẠO VÀ ỨNG DỤNG CHỐNG OXY HÓA LIPID TRONG THỊT CÁ XAY LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HÀ THỊ DUNG NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH ACID PHYTIC TỪ CÁM GẠO VÀ ỨNG DỤNG CHỐNG OXY HÓA LIPID TRONG THỊT CÁ XAY LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành Công Nghệ Sau Thu hoạch Mã số 60.54.10 Quyết định giao đề tài: 1726/QĐ-ĐHNT ngày 04/12/2012 Quyết định thành lập hội đồng Ngày bảo vệ: Người hướng dẫn khoa học: TS HUỲNH NGUYỄN DUY BẢO Chủ tịch hội đồng: PGS.TS TRANG SĨ TRUNG Khoa Sau đại học KHÁNH HÒA - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quảcủa đềtài: “Nghiên cứu chiết tách acid phytic từ cám gạo ứng dụng chống oxy hóa lipid thịt cá xay”là công trình nghiên cứu cá nhân chưa công bố công trình khoa học khác thời điểm Nha Trang, Ngày 20 tháng 12 năm 2015 Tác giả luận văn Hà Thị Dung iii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực đề tài, nhận giúp đỡ quý phòng ban trường Đại học Nha Trang tạo điều kiện tốt cho hoàn thành đề tài Đặc biệt hướng dẫn tận tình TS Huỳnh Nguyễn Duy Bảo giúp hoàn thành tốt đề tài Qua đây, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giúp đỡ Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Công Nghệ Thực Phẩm đặc biệt Bộ Môn Công Nghệ Sau Thu Hoạch tận tình truyền đạt kiến thức cho suốt khóa học Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Thí nghiệm Thực hành, Trường Đại học Nha Trang giúp đỡ chuyên môn thiết bị thí nghiệm Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình tất bạn bè giúp đỡ, động viên suốt trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 20 tháng 12 năm 2015 Tác giả luận văn Hà Thị Dung iv MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC v DANH MỤC BẢNG ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xii MỞ ĐẦU xiv CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN 1.1 Acid phytic dạng tồn acid phytic cám gạo 1.1.1 Đặc điểm cấu tạo nguồn gốc tự nhiên acid phytic ……………… 1.1.2 Vai trò cuả acid phytic……………………………………………………… 1.1.3 Tác dụng chống oxy hóa acid phytic…………………………………… 1.1.4 Ứng dụng acid phytic…………………………………………………… 1.2 Cám gạo phương pháp chiết tách acid phytic từ cám gạo 1.2.1 Đặc điểm công dụng cám gạo………………………………………….5 1.2.2 Phương pháp chiết tách acid phytic từ cám gạo dung môi yếu tố ảnh hưởng đến hiệu tách chiết………………………………………………… 1.2.2.1.Khái niệm………………………………………………………………… 1.2.2.2 Bản chất trình chiết tách …………………………………… 1.2.2.3 Một số phương pháp chiết tách acid phytic từ cám gạo………………….8 1.3 Một số nghiên cứu nước chiết tách xác định hàm lượng acid phytic 11 1.4 Tổng quan bảo quản lạnh thủy sản 15 1.4.1 Cơ sở bảo quản lạnh thủy sản……………………………………………… 15 1.4.2 Các phương pháp bảo quản lạnh thủy sản …………………………… 16 1.4.3 Những biến đổi động vật thủy sản trình bảo quản lạnh……… 17 1.5 Cá tra biến đổi oxy hóa lipid chất béo 19 1.5.1 Cá tra…………………………………………………………………………19 1.5.2 Quá trình oxy hóa lipid chất béo…………………………………………… 20 1.5.3 Một số nghiên cứu ứng dụng khả chống oxy hóa acid phytic thực phẩm ………………………………………………………………………….22 v CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1.Nguyên liệu hóa chất sử dụng 25 2.1.1 Nguyên liệu………………………………………………………………… 25 2.1.2 Hóa chất sử dụng…………………………………………………………….25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phương pháp thu mẫu xử lý mẫu…………………………………………25 2.2.2 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát………………………………………………….26 2.2.3.Xác định thành phần hóa học cám gạo ………………………27 2.2.4 Xác định loại dung môi điều kiện thích hợp để chiết tách acid phytic từ cám gạo tám……………………………………………………………………… 27 2.2.4.1.Quy trình dự kiến chiết tách acid phytic từ cám gạo…………………… 27 2.2.4.2.Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thích hợp để chiết tách acid phytic từ cám gạo dung môi HCl loãng…………………………………………… 28 2.2.4.3 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thích hợp để chiết tách acid phytic từ cám gạo dung môi H2SO4 loãng………………………………………… 30 2.2.4.4 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thích hợp để chiết tách acid phytic từ cám gạo dung môi TCA loãng………………………………………….… 33 2.2.4.5 Lựa chọn dung môi thích hợp cho chiết tách acid phytic từ cám gạo tám……………………………………………………………………………… 35 2.2.4.6 Xác định điều kiện thích hợp để chiết tách acid phytic từ cám gạo dung môi thích hợp với hỗ trợ siêu âm………………………………… 35 2.2.5 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết acid phytic từ cám gạo… 37 2.2.6.Ứng dụng chống oxy hóa lipid cho thịt cá tra xay dịch chiết acid phytic từ cám gạo……………………………………………………………… ……… 38 2.3 Các phương pháp phân tích 40 2.3.1 Xác định thành phần hóa học cám gạo tám, thịt cá xay…………40 2.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng acid phytic………………………………40 2.3.3 Phương pháp đánh giá khả chống oxy hóa acid phytic……………40 2.3.4 Phương pháp đánh giá khả chống oxy hóa lipid thịt cá xay acid phytic…………………………………………………………………… 40 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 40 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41 vi 3.1.Thành phần hóa học cám gạo tám 41 3.2 Xác định loại dung môi điều kiện thích hợp để chiết tách acicd phytic từ cám gạo 41 3.2.1 Xác định điều kiện thích hợp để chiết tách acid phytic từ cám gạo dung môi acid HCl loãng…………………………………………………………………41 3.2.2 Xác định điều kiện thích hợp để chiết tách acid phytic từ cám gạo dung môi acid H2SO4 loãng………………………………………………………………45 3.2.3 Xác định điều kiện thích hợp để chiết tách acid phytic từ cám gạo dung môi acid TCA loãng ………………………………………………………… 47 3.2.4 Lựa chọn dung môi thích hợp cho chiết tách acid phytic ………………50 3.2.5 Xác định điều kiện thích hợp để chiết tách acid phytic từ cám gạo dung môi acid HCl loãng có hỗ trợ siêu âm 52 3.3 Đề xuất quy trình chiết tách acid phytic từ cám gạo 55 3.4 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa acid phytic chiết tách từ cám gạo 58 3.4.1 Khả khử gốc tự DPPH acid phytic chiết từ cám gạo tám………58 3.4.2.Khả khử hydroperoxide acid phytic chiết từ cám gạo tám…………59 3.4.3 Phân tích hoạt tính chống oxy hóa acid phytic chiết từ cám gạo tám mô hình phản ứng fenton hệlipid/myoglobin/H2O2………………………… 60 3.4.4.Khả chống oxy hóa acid phytic chiết từ cám gạo phương pháp Ferric Thiocyanate (FTC)………………………………………………………… 62 3.5 Ảnh hưởng bổ sung acid phyticdịch chiết acid phytic từ cám gạo tám đến oxy hóa lipid thịt cá tra xay trình bảo quản lạnh 65 3.5.1 Thành phần hóa học thịt cá tra………………………………………… 65 3.5.2 Ảnh hưởng bổ sung dịch chiết acid phytic từ cám gạo tám đến biến đổi thịt cá tra xay trình bảo quản lạnh……………………………………….66 3.5.3 Ảnh hưởng bổ sung dịch chiết acid phytic từ cám gạo tám đến hàm lượng lipid mẫu trước sau trình bảo quản ………………………… .69 3.5.4.Ảnh hưởng bổ sung dịch chiết acid phytic từ cám gạo tám đến số TBARS mẫu thịt cá tra xay trình bảo quản lạnh……………… 71 3.5.5.Ảnh hưởng bổ sung dịch chiết acid phytic từ cám gạo tám đến số peroxyt thịt cá tra xay trình bảo quản lạnh ………………………74 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AOAC :AssociationofOfficialAnalytical Chemists AOCS : American Oil Chemist’s Society BPS : Bathophenanthroline BHT : Butylhidroxianizol CPSX VÀ TM : Cổ phần sản xuất thương mại DHA : Docosahexaaenoic DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ĐC : Mẫu đối chứng EPA : Eicosapentaenoic FTC : Ferric Thiocyanate FRAP :Ferric Reducing Antioxidant Power HCl : Acid clohydric H2SO4 : Acid Sunfuric HESO : Hydroperoxyde-enriched soybean oil HPLC : High Performance Liquid Chromatography MDA : Malonaldehyde IC : Sắc ký trao đổi ion IP : myo-inositol 1,2,3,4,5,6 hexakisphotphat PA : Acid Phytic PAE : Phytic acid extract PV : Peroxyt RFIC :Hệ Thống Reagent-Free™ IC SD : Standard Deviation TCA : Trichloracetic TBA : thiobarbituric TBARS : Thiobarbituric acid reactive substances Thuốc thử Wade : Hỗn hợp bao gồm 0.15 g FeCl3·6H2O 1.5 g sulphosalicylic acid 500 mL nước TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Ứng dụng siêu âm lượng cao ngành công nghiệp thực phẩm Bảng 1.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động enzyme lipase 18 Bảng 1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến thời gian sinh trưởng vi sinh vật 19 Bảng 1.4 Thành phần hóa học cá tra 19 Bảng 1.5 Thành phần dinh dưỡng, phần ăn cá tra cá basa 19 Bảng 3.1 Thành phần hóa học cám gạo tám 41 Bảng 3.2 Kết so sánh hàm lượng acid phytic thu theo hai phương pháp siêu âm không siêu âm 55 Bảng 3.3 Kết đánh giá khả chống oxy hóa dịch chiết acid phytic chiết từ cám gạo dựa vào phương pháp FTC 63 Bảng 3.4 Kết đánh giá khả chống oxy hóa acid phytic chuẩn dựa vào phương pháp FTC 63 Bảng 3.5 Thành phần hóa học thịt cá tra 65 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc acid phytic Hình 1.2 Dạng tồn phức hợp acid phytic thực vật (phytate) Hình 1.3 Cấu tạo hạt thóc Hình 1.4 Cám gạo Hình 2.1 Cám gạo tám 25 Hình 2.2 Hình ảnh cá tra 25 Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát đề tài 26 Hình 2.4 Sơ đồ nghiên cứu quy trình tách chiết acid phytic từ cám gạo dự kiến 28 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thích hợp để chiết tách acid phytic từ cám gạo dung môi HCl loãng 29 Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thích hợp để chiết tách acid phytic từ cám gạo dung môi H2SO4 loãng 31 Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thích hợp để chiết tách acid phytic từ cám gạo dung môi TCA loãng 33 Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí xác định điều kiện thích hợp để chiết tách acid phytic từ cám gạo dung môi thích hợp với hỗ trợ siêu âm 36 Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết acid phytic từ cám gạo acid phytic chuẩn 38 Hình 2.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khả chống oxy hóa lipid dịch chiết acid phytic từ cám gạo bảo quản thịt cá tra xay 39 Hình 3.1.Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (a), nồng độ dung dịch HCl (b); nhiệt độ (c) thời gian chiết (d) đến hàm lượng acid phytic 42 Hình 3.2.Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (a), nồng độ dung dịch H 2SO4 (b); nhiệt độ (c) thời gian chiết(d) đến hàm lượng acid phytic 45 Hình 3.3.Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (a), nồng độ dung dịch TCA (b); nhiệt độ (c) thời gian chiết(d) đến hàm lượng acid phytic 48 Hình 3.4 Hàm lượng acid phytic chiết tách từ cám gạo tám dung môi HCl, H2SO4và TCA điều kiện chiết thích hợp dung môi 51 Hình 3.5.Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (a), nồng độ dung dịch HCl (b); nhiệt độ (c) thời gian siêu âm(d) đến hàm lượng acid phytic 53 x Nhiệt độ chiết (oC) Thời gian chiết (h) 30oC 1,1c ± 0,05 0,25h 0,683a ± 0,029 40oC 1,2d ± 0,05 0,5h 1,083d ± 0,03 50oC 0,933b ± 0,057 0,75h 1,283e ± 0,029 60oC 0,967b ± 0,029 1h 0,917c ± 0,057 70oC 0,817a ± 0,029 1,25h 0,817b ± 0,057 Bảng 1.3 Kết quả thí nghiệm xác định thông số thích hợp cho trình chiết acid phytic từ cám gạo dung môi TCA Tỷ lê dung môi/nguyên liệu (ml/g) Hàm lượng acid phytic (g/100g) Nồng độ TCA(%) Hàm lượng acid phytic (g/100g) 5/1 0,68a± 0,03 3% 0,733a± 0,029 10/1 0,817b± 0,029 5% 0,8a± 0,05 15/1 1d± 0,05 7% 0,9b± 0,05 20/1 1,1e± 0,05 9% 1,067c± 0,029 25/1 0,917c± 0,029 11% 0,933b± 0,029 Nhiệt độ chiết (oC) Thời gian chiết (h) 30oC 0,983c ± 0,029 2h 0,798b ± 0,05 40oC 1,167d ± 0,029 2,5h 0,967d ± 0,029 50oC 0,967c ± 0,032 3h 1,067e ± 0,03 60oC 0,871b ± 0,026 3,5h 0,891c ± 0,014 70oC 0,767a ± 0,029 4h 0,633a ± 0,057 Bảng 1.4 Kết quả thí nghiệm tách chiết acid phytic từ cám gạo theo thông số thích hợp của loại dung môi Loại dung môi Hàm lượng acid phytic (g/100g) HCl 1,251b ± 0,003 H2SO4 1,247b ± 0,002 TCA 1,14a ± 0,004 Bảng 1.5 Kết quả thí nghiệm xác định thông số thích hợp cho trình chiết siêu âm acid phytic từ cám gạo dung môi HCl Tỷ lê dung môi/nguyên liệu (ml/g) Hàm lượng acid phytic (g/100g) Nồng độ HCl (%) Hàm lượng acid phytic (g/100g) 5/1 0,433a± 0,076 2% 0,817b± 0,057 10/1 1b± 0,05 2,5% 1,233e± 0,044 15/1 1,267c± 0,029 3% 1,133d± 0,029 20/1 1,233c± 0,029 3,5% 0,983c± 0,029 25/1 1b± 0,05 4% 0,633a± 0,03 Thời gian chiết Nhiệt độ chiết (oC) (phút) 30oC 0,583a ± 0,029 10 phút 0,733a ± 0,03 40oC 1,267e ± 0,057 20 phút 1,333d ± 0,056 50oC 1,083d ± 0,029 30 phút 1,18c ± 0,05 60oC 0,917c ± 0,03 40 phút 1,167c ± 0,029 70oC 0,817b ± 0,032 50 phút 1,067b ± 0,03 Bảng 1.6.1 Kết quả đánh giá khả khử DPPH của dịch chiết acid phytic từ cám gạo tám acid phytic chuẩn Nồng độ acid phytic(mg/ml) Khả khử DPPH của dịch chiết acid phytic từ Khả khử DPPH của acid phytic chuẩn (nM) cám gạo (nM) 0,2 0,017a± 0,0009 0,0182a± 0,0005 0,4 0,026b ±0,001 0,029c± 0,001 0,6 0,032d ±0,0002 0,036e± 0,001 0,8 0,038e ±0,0004 0,042f± 0,0004 1,0 0,046g ±0,004 0,049h± 0,001 Bảng 1.6.2 Kết quả đánh giá khả khử H2O2 của dịch chiết acid phytic từ cám gạo tám acid phytic chuẩn Nồng độ acid phytic(mg/ml) 0,2 Khả khử H2O2 của dịch chiết acid phytic từ Khả khử H2O2 của acid phytic chuẩn (%) cám gạo (%) 17,541b± 0,186 a 15,5412 ±0,186 0,4 26,035238c± 0,154 0,6 36,976418e±0,338 0,8 50,421847g±0,287 1,0 63,4499i±0,595 29,902d± 0,076 41,376f± 0,192 54,422h± 0,287 69,45j± 0,59 Bảng 1.6.3 Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết acid phytic từ cám gạo tám acid phytic chuẩn mô hình phản ứng Fenton hệ lipid/myoglobin/H2O2 Nồng độ acid phytic(mg/ml) Hoạt tính chống oxy hóa của Hoạt tính chống oxy hóa của acid dịch chiết acid phytic từ cám phytic chuẩn dựa vào mô hình gạo dựa vào mô hình phản ứng phản ứng fenton hệ fenton hệ lipid/myoglobin/H2O2(%) lipid/myoglobin/H2O2 (%) 16,112b ± 0,152 0,2 12,978a±0,056 0,4 25,43936c± 0,3 27,339d± 0,152 0,6 34,169e±0,1 38,502f± 0,522 0,8 45,47882g±0,1 49,812h± 0,648 1,0 56,357i± 0,4 63,157j± 0,497 Bảng 1.7 Kết quả đánh giá cảm quan của thịt cá tra thời gian bảo quản Nồng độ acid phytic(mM) Sau ngày Mẫu ĐC Mẫu PA chiết 0,3mM Mẫu PA chuẩn 0,3mM Sau ngày Sau ngày 17,85a± 0,53 15,11a± 0,32 13,46a±0,4 12,63a± 0,38 20b ± 19,03b ±0,26 17,57b ±0,09 15,79b ±0,11 15,49b ±0,13 19,9b± 0,17 19,17b ±0,1 17,71b ±0,27 16,27c ±0,08 15,61b ±0,06 0,1 mM 0,2mM Sau ngày 20b± Mẫu PA chiết Mẫu PA chiết Sau ngày 19,92b ±0,17 19,31bc ±0,08 18,13c ±0,43 17d ±0,42 15,64b ±0,2 19,752a±0,04 19,66c±0,31 19,28d±0,18 17,38e ±0,14 16,57c±0,21 Bảng1.8 Kết quả xác định hàm lượng lipid tổng thịt cá tra trước sau ngày bảo quản Nồng độ acid Trước phytic bảo quản Mẫu ĐC (mM) Sau bảo 7,14f± 2,23a± quản 0,02 0,03 Mẫu PA Mẫu PA Mẫu PA Mẫu PA chiết chiết chiết chuẩn 0,1mM 0,2mM 0,3mM 0,3mM 5,58b± 0,09 5,78c ±0,03 6,07d ±0,02 6,18e± 0,03 Bảng 1.9 Kết quả xác định số TBARS của thịt cá tra thời gian bảo quản lạnh Nồng độ acid Sau ngày Sau ngày Sau ngày Sau ngày phytic(mM) (nM MAD) (nM MAD) (nM MAD) (nM MAD) (nM MAD) Mẫu ĐC Mẫu PA chiết 0,1 mM Mẫu PA chiết 0,2mM Mẫu PA chiết 0,3mM Mẫu PA chuẩn 0,3mM Sau ngày 5,22b± 0,04 7,50e±0,02 11,92d±0,13 14,17c±0,02 15,38e±0,01 5,23b±0,04 5,66d ±0,02 7,54c ±0,01 9,13b ±0,05 10,86d±0,12 5,07a±0,02 5,47c ±0,02 6,53b±0,08 9,04b±0,01 10,49c ±0,02 4,98a ±0,01 5,30b ±0,01 6,13a ±0,01 8,23a ±0,11 10,20b ±0,09 4,96a± 0,11 5,26a±0,03 6,12a±0,02 8,10a±0,15 9,35a± 0,07 Bảng 1.10 Kết quả xác địnhchỉ số Peroxyt của thịt cá tra thời gian bảo quản Nồng độ acid Sau ngày Sau ngày Sau ngày phytic(mM) (meq/kg) (meq/kg) (meq/kg) (meq/kg) (meq/kg) Mẫu ĐC 0,67a± 0,02 1,56b±0,08 3,16c±0,04 4,53d± 0,08 5,56c± 0,09 0,68a ±0,02 0,8a± 0,02 1,51b ±0,08 2,63c ±0,06 3,27b±0,07 0,68a ±0,02 0,73a± 0,03 1,11a ±0,04 2,31b ±0,04 3,13b ±0,02 0,68a ±0,02 0,71a ±0,04 0,91a ±0,04 2,11ab±0,08 2,42a ±0,05 0,68a± 0,02 0,69a± 0,04 0,91a± 0,04 2,04a± 0,08 Mẫu PA chiết 0,1 mM Mẫu PA chiết 0,2mM Mẫu PA chiết 0,3mM Mẫu PA chuẩn 0,3mM Sau ngày Sau ngày 2,36a± 0,05 Phụ lục 2: Các phương pháp phân tích 2.1 Xác định hàm lượng acid phytic a Xây dựng đường chuẩn acid phytic: Cách xác định phương trình đường chuẩn theo phương pháp Phesatcha cộng [51], Norhaizan cộng sư [47] , Gao cộng [29] Cách xác định nhưsau Hòa tan 0,1g acid phytic chuẩn (P8810-10G, sigma Aldrich) 100ml nước cất Pha loãng acid phytic nồng độ từ 10 đến 200 µg/ml (bước nhảy 10) Hút 3ml dịch nồng độ vào ống nghiệm có dán nhãn Thêm vào ống nghiệm 1ml thuốc thử Wade Mỗi nồng độ lặp lại lần Sau mang ly tâm 3000 vòng 10 phút Thu dịch ly tâm đem đo độ hấp thụ bước sóng 500nm Kết xây dựng đường chuẩn thể hình 2.1 0.3 Độ hấp thụ (500nm) 0.25 0.2 0.15 0.1 y = -0.0012x + 0.257 R² = 0.9969 0.05 0 20 40 60 80 100 Nồng độ acid phytic (µg/ml) 120 140 Hình 2.1 Phương trình đường chuẩn acid phytic b Phương pháp xác định hàm lượng acid phytic: Được xác định theo phương trình đường chuẩn Lấy 3ml dịch cho vào ống nghiệm thêm vào ml thuốc thử Wade Đem ống nghiệm Vorhtex Sau ly tâm 3000 rpm 10 phút 100C Thu dịch chiết đem đo UV- VIS bước sóng 500nm Tính kết hàm lượng acid phytic theo phương trình đường chuẩn 2.2 Các phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết 2.2.1.Phân tích hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic dựa vào khả khử gốc tự DPPH Khả khử gốc tự DPPH phân tích theo phương pháp Fu cộng [28] a Cách tiến hành Cho vào ống nghiệm 2ml dung dịch chất chống oxy hóa với nồng độ tương ứng từ 0,2 đến 1mg/ml, 1ml methanol 1ml dung dịch DPPH 0,1mM Trộn hỗn hợp để phản ứng xảy bóng tối nhiệt độ thường Sau 30 phút phản ứng, đem hỗn hợp đo độ hấp thụ bước sóng 517nm quang phổ kế UV/VIS Mẫu đối chứng tiến hành tương tự thay 2ml chất chống oxy hóa dung môi PA hòa tan nước nên 2ml dung môi nước cất b Tính kết quả: Khả khử gốc tự DPPH tính dựa vào phương trình đường chuẩn DPPH Hình 2.2 Đường chuẩn DPPH 2.2.2 Phân tích hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic dựa vào khả khử hydroperoxide Khả khử hydroperoxide acid phytic phân tích theo phương pháp Nabavi cộng [45] a Cách tiến hành Cho vào ống nghiệm ống 0,5ml dung dịch acid phytic có nồng độ tương ứng 0,2mg/ml; 0,4mg/ml; 0,6 mg/ml; 0,8mg/ml; 1,0mg/ml Sau cho vào ống nghiệm 2,5ml H2O2 đệm phosphate pH = 7,4 1ml dung dịch đệm phosphate pH = 7,4 Lắc để nhiệt độ phòng 10 phút sau đem đo độ hấp thụ bước sóng 230nm máy UV-Vis Sau lần đo mẫu auto zero lại mẫu pha: 1ml mẫu + 3ml đệm Mẫu đối chứng pha cách cho: 0,5ml nước cất+ 1ml đệm + 2,5ml H2O2 Mẫu auto zero mẫu đối chứng pha cách cho 1ml nước cất + ml đệm Mỗi thí nghiệm lặp lại lần b Tính kết quả: Kết tính dựa vào công thức sau: [H2O2] bị khử (%) =[(A0-A)/A0]*100 Trong đó: A0: Giá trị hấp thụ mẫu đối chứng bước sóng 230nm A: Giá trị hấp thụ mẫu acid phytic bước sóng 230nm 2.2.3 Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic mô hình phản ứng Fenton hệlipid/myoglobin/H2O2 Phân tích hoạt tính chống oxy hóa acid phytic mô hình phản ứng Fenton hệlipid/myoglobin/H2O2 tiến hành theo phương pháp Huỳnh Nguyễn Duy Bảo cộng [2] a Cách tiến hành Cho vào ống nghiệm chịu nhiệt có nắp đậy 40µl myoglobin 100µM 40µl H2O2 100µM Lắc để phản ứng xảy phút nhiệt độ phòng, sau cho tiếp vào ống nghiệm 80µl EPA Tween, 40µl acid phytic nồng độ từ 0,2mg/ml đến 1,0mg/ml (bước nhảy 0,2) Đậy nắp ống nghiệm, lắc đem ủ nhiệt độ 37oC 30 phút Sau đó, cho thêm vào 0,3ml KCl 1,15%, 4,5ml H3PO4 1%, 1ml thiobarbituric (TBA) 0,6% Đậy nắp ống nghiệm, lắc đem ủ nhiệt độ 95oC 45 phút Sau đó, làm nguội nhanh vòi nước chảy đến nhiệt độ phòng để yên 10 phút Dùng pipet hút lớp dung dịch bên đem đo độ hấp thụ bước sóng 535nm quang phổ kế UV-VIS Mẫu đối chứng tiến hành tương tự thay 0,2ml chất chống oxy hóa 0,2ml nước cất b Cách tính kết quả: Hoạt tính chống oxy hóa (%) = [(Ao – A)/Ao]*100 Ao: Độ hấp thụ mẫu đối chứng bước sóng 535nm A: Độ hấp thụ mẫu có chứa chất chống oxy hóa bước sóng 535nm 2.2.4 Phân tích hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic phương pháp Ferric Thiocyanate (FTC) Phương pháp FTC xác định theo phương pháp Nohaizan cộng [48]với vài thay đổi nhỏ a Cách tiến hành Hỗn hợp thí nghiệm gồm có: 0,1 mL dịch chiết có nồng độ tương ứng 0,2÷1mg/ml (bước ngày 0,2), 65 µlEPA pha Tween, mL đệm phosphat 0,04 M; mL EtOH 75%, mL nước cất giữ 45°C, bóng tối Hỗn hợp chuẩn bị thêm phản ứng chất chống oxy hóa để làm đối chứng Sau 24h lấy mL mẫu, thêm mL EtOH 75%, 0,5 mL NH4SCN 30%, 0,5 mL FeCl2 0,02M HCl 3,5% tương ứng Sau mẫu có màu đỏ, độ hấp thu đo bước sóng 500nm Sử dụng ethanol để hiệu chỉnh máy quang phổ vạch b Tính kết quả Hoạt tính chống oxy hóa (%) = [(Ao – A)/Ao]*100 Ao: Độ hấp thụ mẫu trắng đo bước sóng 500nm A: Độ hấp thụ mẫu bổ sung chất chống oxy hóa đo bước sóng 500nm 2.3 Phương pháp xác định độ ẩm của cám gạo tám  Nguyên lý Dùng nhiệt độ cao để làm bay mẫu thử, sau dựa vào hiệu số khối lượng mẫu thử trước sau sấy tính hàm lượng nước thực phẩm  Tiến hành - Lấy cốc sấy đũa sấy đem sấy nhiệt độ 100-1050C đến khối lượng không đổi, nghĩa sai khác sau hai lần cân liên tiếp không 5.10-4g, lần lấy cốc cân phải để nguội bình hút ẩm sau đem cân cân phân tích - Cân 5g mẫu cám gạo tám cân phân tích cho vào cốc sấy đến khối lượng không đổi Đưa cốc vào tủ sấy, sấy 60-800C vòng 30 phút Sau nâng nhiệt độ lên 100-1050C, sấy liên tục 3h Chú ý trình sấy sau 1h tiến hành đảo mẫu lần Mỗi lần kiểm tra khối lượng mẫu, lấy mẫu để nguội bình hút ẩm, sau đem cân cân phân tích - Hàm ẩm tính theo công thức: X= G1-G2 G1-G *100% Trong đó: G: Khối lượng cốc sấy G1: Khối lượng cốc sấy mẫu thử trước sấy G2: Khối lượng cốc sấy mẫu thử sau sấy X: Độ ẩm (hàm lượng nước thực phẩm) 2.4 Các phương pháp đánh giá chất lượng thịt cá xay sau thời gian bảo quản 2.4.1 Phương pháp đánh giá cảm quan Đánh giá cảm quan chất lượng thịt cá tra xay dựa vàoTCVN 5090-90, TCVN 5277-90, TCVN 2068-1993 Tiến hành xây dựng thang điểm đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm thịt cá xaynhư sau Bảng 2.1 Các tiêu cảm quan của thịt cá tra xay Chỉ tiêu Hệ số quan trọng Trạng thái 1,1 màu sắc 1,2 Mùi 0,9 Vị 0,8 Điểm cảm quan chung: 1,1 * điểm trạng thái + 1,2* điểm màu sắc + 0,9 * điểm mùi + điểm vị *0,8 Bảng 2.2 Thang điểm đánh giá trạng thái của thịt cá mối xay sau thời gian bảo quản Bậc Điểm chưa đánh có trọng giá lượng - Thịt cá xay có độ đồng đều, bóp nhẹ có độ dính, dẻo dai, đàn hồi tốt - Thịt cá có độ đồng đều, bóp nhẹ có độ dẻo dai, đàn hồi 3 - Bề mặt thịt cá xay có nhiều lỗ bọt khí , bóp nhẹ có độ dẻo dai, đàn hồi Cơ sở đánh giá Thịt cá xay bóp nhẹ thấy rời rạc, đàn hồi - - Bề mặt thịt cá không đồng nhất, đóng cục, bóp nhẹ thấy rời rạc, đàn hồi Bề mặt thịt cá xay không đồng nhất, chảy nhiều nước, đàn hồi kém, Bảng 2.3 Thang điểm đánh giá màu sắc thịt cá mối xay sau ngày bảo quản Bậc đánh giá Điểm chưa có Cơ sở đánh giá trọng lượng Màu sắc sáng, màu tự nhiên thịt cá Màu sắc sáng, 3 Màu trắng hơiđục bạc màu Màu trắng xám Màu xám Màu xanh Bảng 2.4 Thang điểm đánh giá vị của thịt cá xay sau ngày bảo quản Bậc đánh Điểm chưa có giá trọng lượng - Khi hấp chín có vị đặc trưng đạm cá, vị lạ - Khi hấp chín có vị đạm, vị lạ 3 - Khi hấp chín có vị nhẹ đạm - Khi hấp chín có vị đạm xen lẫn vị lạ - Không vị đặc trưng thịt cá xay, xuất vị lạ Cơ sở đánh giá hấp chin - Không vị đặc trưng thịt cá xay, xuất vị lạ khó chịu Bảng 2.5 Thang điểm đánh giá mùi của thịt cá xay sau ngày bảo quản Bậc đánh Điểm chưa có giá trọng lượng Cơ sở đánh giá Thịt cá trước luộc có mùi thịt cá tươi Sau luộc có mùi thơm thịt cá Thịt cá trước luộc có mùi thịt cá tươi Sau luộc có mùi thơm nhẹ thịt cá 3 Mùi thơm đặc trưng thịt cá trước luộc giảm Sau luộc có mùi thơm nhẹ thịt cá Thịt cá không mùi thơm tự nhiên Khi luộc chín không mùi thơm thịt cá Không mùi thịt cá Sản phẩm có mùi lạ Sản phẩm có mùi lạ xuất có dấu hiệu hư hỏng 2.4.2 Xác định số peroxyt theo phương pháp theo phương pháp chuẩn AOCS Official Method Cd 8b – 90 [19] a Định nghĩa Chỉ số peroxyt lượng chất có mẫu thử, tính mili đương lượng oxy hoạt tính làm oxy hóa KI kilogam mẫu thử điều kiện thao tác qui định b Nguyên tắc Phần mẫu thử hòa tan chloroform acid acetic băng bổ sung kali iodua Iod giải phóng peroxyt xác định cách chuẩn độ iod với chất thị hồ tinh bột dung dịch chuẩn natri thiosunfat Điểm kết thúc chuẩn độ xác định phương pháp chuẩn độ iod (quan sát mắt thường) c Dụng cụ hóa chất: Dụng cụ: - Cân phân tích xác 0,01g - Bình tam giác cổ nhám nút mài 250ml - Burrette 25ml có khoảng chia độ 0,1ml - Pipet thẳng 0,5ml - Tủ host Hóa chất: - Dung dịch Cloroform: acid acetic băng(2:3) - Dung dịch hồ tinh bột 1%: cân 1g tinh bột cho vào 20ml nước cất, cho hỗn hợp vào 80ml nước sôi, đun tiếp đến dung dịch suốt dừng -Dung dịch Na2S2O3 0,1N -Dung dịch KI bão hòa, pha làm Iodat Iot tự Để kiểm tra dung dịch KI bão hòa, thêm giọt hồ tinh bột vào 0,5ml dung dịch KI 30ml dung dịch CH3COOH : CHCl3 theo tỉ lệ : Nếu thêm giọt Na2S2O3 0,01N có màu xanh bỏ dung dịch KI chuẩn bị dung dịch KI d.Tiến hành xác định: Hòa tan 3g mẫu thử 30ml dung dịch acid Acetic : Cloroform (3:2), lắc cho mẫu tan Sau thêm 0.5 ml KI bão hòa Đậy bình Lắc phút để yên xác phút nơi tối Thêm 30ml nước cất, lắc mạnh, thêm vài giọt hồ tinh bột làm chất thị Chuẩn độ với dung dịch Na2S2O3 0,1N đến màu xanh Tiến hành thử mẫu trắng song song mẫu thử Nếu kết mẫu trắng vượt 0,1ml dung dịch Na2S2O3 0,1N thay đổi hóa chất pha hóa chất không tinh khiết e Tính kết quả: Chỉ số peroxyt tính mili đương lượng oxy hoạt tính kg mẫu thử theo công thức: PV = (V1-V0)*N*1000/m Trong đó: V1 :thể tích Na2S2O3 tiêu tốn cho mẫu thử (ml) V0 :thể tích Na2S2O3 tiêu tốn cho mẫu trắng (ml) N : Nồng độ dung dịch chuẩn Na2S2O3 sử dụng (mol/l) m :khối lượng mẫu thử (g) 2.4.3 Xác định hàm lượng lipit theo phương pháp Soxhlet (TCVN 3703_90) a Nguyên tắc : Các dung môi hữu có khả hòa tan rút chất béo khỏi mẫu phân tích Sau tách chất béo khỏi mẫu ,đun đuỗi dung môi hữu khỏi chất béo Chiết lipit khỏi mẫu dung môi hữu este etylic b Dụng cụ ,thiết bị hóa chất: Cân phân tích độ xác 0.0002g, chiết lipit Soxhlet, tủ sấy điện, bếpcách thủy, khử lipit; ester etylic(KTPT), bình hút ẩm, giấy lọc c Tiến hành thử: Cân g mẫu thử với xác 0.0002g , nghiền nhỏ cho tơi hoàn hoàn đem sấy khô Gói mẫu làm khô vào ống giấy lọc hình trụbằng giấy lọc Dùng lau cối chày sứ cho vào gói Cho gói mẫu vào ống chiết thiết bị Lắp kín thiết bị (Bình cầu trước sấy khô, để nguội cân) Cho ete vào khoảng 2/3 thể tích bình cầu Cho nước qua ống sinh hàn Đun từ từ bình cầu nồi cách thủy để chiết lipid liên tục 8-12h, tốc độ ete tràn từ ống trụ chiết bình cầu không 8-10 lần/h không 5-6 lần/h tốt Quá trình chiết lipit kết thúc giọt ete etylic từ ống hồi lưu trở xuống làm loan giấy lọc bay hết ete.Cất thu hồi ete etylic bình cầu Đặt bình cầu tủ sấy trì nhiệt độ 100-105o C,sấy đến khổi lượng không đổi Để nguội 30 phút bình hút ẩm ,cân bình cầu để xác định hàm lượng lipit có mẫu d Tính kết quả Hàm lượng lipt có mẫu tính % khối lượng theo công thức : X(%) =(m1-m0/m)x100 m1:khối lượng bình cầu chứa hàm lượng lipit mẫu,tính gam m0:khối lượng bình cầu tính gam; m:khối lượng mẫu ban đầu tính gam 2.4.4 Xác định số TBARS Xác định số TBARS theo phương pháp Mihara Uchiyama [43] a Nguyên tắc: Trong hệ lipid/myoglobin/H2O2, phản ứng oxy hóa lipid bị kích hoạt bỡi gốc tự ferrylmyoglobin (ferrylMb) tạo thành từ phản ứng metmyoglobin (metMb) H2O2 Cơ chế phản ứng xảy sau: MbFe(III) + H2O2 → *MbFe(IV)=O + H2O MbFe(IV)=O + RH → MbFe(IV)=O + R* + H+ * R* + O2 → ROO* ROO* + RH → ROOH + R* R* + R* → R-R R* + ROO* → ROOR ROO* + ROO* → ROOR + O2 Lipid hydroperoxide tạo thành bị phân hủy tạo thành malondialde (MDA) phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) tạo thành màu đỏ son hấp thụ cực đại bước sóng 535nm Cơ chế phản ứng xảy sau: → Lipid hydroperoxideMDA + → MDA TBA Phức (màu đỏ son) Khi cho chất chống oxy hóa vào hệ phản ứng ức chế oxy hóa lipid nên cường độ màu đỏ giảm Dựa vào thay đổi cường độ màu đỏ để phân tích hoạt tính chất chống oxy hóa b Tiến hành: Lấy 0,5g mẫu thịt cá cho vào ống nghiệm, thêm vào 4,5ml KCl 1,15% mang ống nghiệm đồng hóa Hút 0,5ml dịch ống nghiệm đồng hóa cho vào ống nghiệm khác thêm vào 0,3ml H2SO4 1% 1ml 2- thiobarbituric 0,6% Hỗn hợp đưa vortex Sau đêm ổn định với nhiệt độ 950C bể ổn nhiệt 45 phút Lấy ống nghiệm làm nguội vòi nước chảy 10 phút Hút 4ml n_Butanol vào ống nghiệm đem vortex Sau mang ống nghiệm ly tâm 1700 vòng 10 phút Hút tách lớp butanol bên trên, mang ống nghiệm đem đo độ hấp thụ bước sóng 535nm quang phổ kế UV-VIS Tính kết đo hàm lượng MDA(nM) dựa phương trình đường chuẩn c Phương trình đường chuẩn: 25 y = 20.742x + 0.1439 R2 = 0.9985 Nồng độ MDA (nM) 20 15 10 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Độ hấp thụ bước sóng 535 Hình 2.3.Đường chuẩn xác định hàm lượng MDA (nM) [...]... chiết tách acid phytic từ cám gạo và ứng dụng chống oxy hóa lipid trong thịt cá xay là điều cần thiết Mục tiêu của đề tài chính là xây dựng được quy trình thích hợp chiết tách acid phytic từ cám gạo sau đó thử nghiệm khả năng chống oxy hóa lipid trong thịt cá xay của acid phytic chiết tách từ cám gạo Cám gạo được đem chiết với từng loại dung môi acid loãng như HCl, H2SO4, TCA với các điều kiện chiết. .. việc thu nhận và ng dụng chưa được phổ biến.Chính vì những lý do trên mà đề tài: Nghiên cứu chiết tách acid phytic từ cám gạo và ứng dụng chống oxy hóa lipid trongthịt cá xay là điều cần thiết xiv 2 Mục tiêu - Xây dựng quy trình chiết tách acid phytictừ cám gạo - Ứng dụng acid phytic vào chống oxy hóa lipid trong thịt cá xaybảo quản lạnh 3 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu xác định các thông số thích... đồ quy trình chiết tách acid phytic từ cám gạo 56 Hình 3.7 Khả năng khử gốc tự do DPPH của acid phytic chiết từ cám gạo tám và acid phytic chuẩn 58 Hình 3.8 Khả năng khử H2O2 của PA chiết tách từ cám gạo và PA chuẩn 59 Hình 3.9 Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết acid phytic chiết từ cám gạo và acid phytic chuẩn phân tích dựa vào mô hình phản ứng fenton trong hệ lipid/ myoglobin/H2O2... trình chiết tách acid phytic từ cám gạo - Chiết tách acid phytic theo quy trình chiết thích hợp - Đánh giá khả năng chống oxy hóa của acid phytic thu được - Đánh giá tác dụng chống oxy hóa lipid của acid phytic trên thịt cá xay sau thời gian bảo quản 4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 4.1 Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài là dẫn liệu khoa học về tách chiết acid phytic từ cám gạo và. .. oxy hóa của dịch chiết acid phytic từ cám gạo so sánh với acid phytic chuẩn ở cùng nồng độ qua các phương pháp khử gốc tự do DPPH, khả năng khử H202, mô hình phản ứng fenton trong hệ lipid/ myoglobin/H202 và phương pháp FTC Sau đó, thử nghiệm khả năng chống oxy hóa lipid trong thịt cá xay của dịch chiết acid phytic từ cám gạo Kết quả nghiên cứu đã xác định được thành phần hóa học cơ bản của cám gạo. .. của mẫu dịch chiết acid phytic từ cám gạo là 63,5% và 69,45% đối với mẫu acid phytic chuẩn Hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic chiết từ cám gạo bằng mô hình phản ứng fenton trong hệ lipid/ myoglobin/H2O2 là 72,4% Với phương pháp khử FTC thì hoạt tính chống oxy hóa tăng dần theo thời gian kiểm tra mẫu Bước đầu nghiên cứu thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết acid phytic từ cám gạo từ 0,1÷0,3mM... được trong nghiên cứu này góp phần nâng cao giá trị cho việc sử dụng cám gạo, thu nhận thêm được chất chống oxy hóa tự nhiên có nhiều hoạt tính sinh học ít được biết đến như acid phytic Kết quả còn mở ra tiềm năng có thể ứng dụng dịch chiết acid phytic từ cám gạo có hoạt tính chống oxy hóa trong lĩnh vực chế biến và bảo quản thực phẩm thủy sản Từnhững kết quả đạt được cần nghiên cứu tinh sạch acid phytic. .. hoạt tính chống oxy hóa của acid phytic Những dẫn liệu này là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo sâu hơn và rộng hơn về những công dụng của acid phytic, như nghiên cứu sản xuất, tinh chế và sử dụng làm thực phẩm chức năng cho con người 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu tách chiết acid phytic sẽ góp phần làm tăng giá trị sử dụng của cám gạo Bên cạnh đó, acid phytic là chất chống oxy hóa tự nhiên... sản xuất acid phytic tối ưu Canan và cộng sự [21] đã nghiên cứu chiết tách và tinh sạch acid phytic từ cám gạo Bằng phương pháp bề mặt đáp ứng, tác giả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách acid phytic là nồng độ cám gạo (0,1g/ml), nồng độ HCl (từ 0,7÷1,8M), nhiệt độ (xung quanh 250C) và thời gian chiết (từ 30÷45 phút và so sánh với 1h) Bên cạnh đó, giá trị pH khác nhau (pH từ 7÷9)... việc thu nhận acid phytic từ cám gạo chưa nhiều Chỉ một số công trình nghiên cứu tách chiết một số chất từ cám gạo: Nguyễn Đức Tiến và cộng sự tại Viện Cơ điện nông nghiệp và công nghệ sau thu hoạch, đã nghiên cứu thành công công nghệ sản xuất Gamma Oryzanol từ cám gạo, và đưa sản phẩm ra ngoài thị trường [67] Trần Quang Hải và Lê Thị Vân [68] nghiên cứu chiết xuất dầu biodiesel từ cám gạo Theo ước ... tách acid phytic từ cám gạo ứng dụng chống oxy hóa lipid trongthịt cá xay điều cần thiết xiv Mục tiêu - Xây dựng quy trình chiết tách acid phytictừ cám gạo - Ứng dụng acid phytic vào chống oxy. .. tách acid phytic từ cám gạo sau thử nghiệm khả chống oxy hóa lipid thịt cá xay acid phytic chiết tách từ cám gạo Cám gạo đem chiết với loại dung môi acid loãng HCl, H2SO4, TCA với điều kiện chiết. .. nhỏ, trộn xay nhỏ máy xay thịt (TA 57D, Ytalia) Thịt cá xay sử dụng nghiên cứu khả chống oxy hóa lipid thịt cá xay acid phytic chiết từ cám gạo 2.2.2 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát Cám gạo Xác định