1 ĐẶT VẤN ĐỀ Sự thành công chu kỳ thụ tinh ống nghiệm phụ thuộc nhiều yếu tố, vấn đề lựa chọn phôi chuyển thách thức với nhà phôi thai học Đã có nghiên cứu áp dụng sàng lọc di truyền trước chuyển phôi hay đánh giá sản phẩm chuyển hóa phôi để lựa chọn phôi chuyển Nhưng nay, lựa chọn phôi chuyển dựa vào đặc điểm hình thái phôi xem phương pháp dễ áp dụng, trung tâm thụ tinh ống nghiệm Việt nam Trên giới có công trình nghiên cứu xây dựng quy trình tiêu chuẩn chặt chẽ mục đích lựa chọn từ đến phôi có tiềm sử dụng cho chuyển phôi Tại Việt nam có nghiên cứu công bố đặc điểm hình thái phôi người nuôi cấy ống nghiệm ngày 1, 3, chưa có công trình nghiên cứu hình thái phôi ngày (giai đoạn phôi túi) cách đầy đủ hệ thống Hơn nữa, chưa có nghiên cứu xác định mối liên quan mặt hình thái phôi nuôi cấy ngày phôi ngày 5, để làm sở xây dựng hệ thống đánh giá lựa chọn phôi có tính liên tục cho phép lựa chọn phôi tiềm nhằm nâng cao tỉ lệ thành công giảm nguy đa thai Vì thực đề tài: “Nghiên cứu hình thái đánh giá liên tục phôi ngày tuổi bệnh nhân thụ tinh ống nghiệm” Với mục tiêu: Xác định đặc điểm hình thái phôi nuôi cấy ngày phôi nuôi cấy ngày ống nghiệm 2 Đánh giá mối liên quan đặc điểm hình thái phôi nuôi cấy ngày với ngày bước đầu đánh giá kết áp dụng phân loại phôi liên tục nuôi cấy phôi ngày ngày Những đóng góp luận án Nghiên cứu thực 181 chu kỳ thụ tinh ống nghiệm với 1323 phôi ngày 184 phôi ngày 5, công bố thông tin đo đạc đặc điểm hình thái đặc trưng phôi ngày ngày Đề tài xây dựng phương trình tương quan đường kính, chiều dày màng suốt phôi ngày với đặc điểm hình thái phôi Đề tài cho thấy có mối tương quan hình thái phôi ngày hình thái phôi ngày Đây tài liệu tham khảo hữu ích lĩnh vực phôi thai học, hỗ trợ sinh sản đặc biệt lĩnh vực nuôi cấy phôi ống nghiệm người Đề tài sở để khuyến cáo áp dụng phương pháp phân loại phôi liên tục nuôi cấy phôi lựa chọn phôi chuyển Phương pháp cho phép lựa chọn phôi có tiềm nhất, góp phần làm tăng hiệu kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm người Nghiên cứu có tính cấp thiết, có ý nghĩa khoa học, có tính thực tiễn cao Bố cục luận án Luận án gồm 140 trang: Đặt vấn đề trang, tổng quan 34 trang, đối tượng phương pháp nghiên cứu 22 trang, kết nghiên cứu 41 trang, bàn luận 37 trang, kết luận trang, kiến nghị trang, hướng nghiên cứu trang, danh mục báo trang, 110 tài liệu tham khảo (10 tài liệu tiếng Việt, 100 tài liệu tiếng Anh) Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Hình thái phôi giai đoạn phôi phân cắt phôi túi 1.1.1 Mối liên quan yếu tố hình thái phôi ngày kết thụ tinh ống nghiệm Nhìn chung việc phân loại chất lượng phôi ngày dựa hoàn toàn đặc điểm: (1) Số lượng phôi bào phôi nuôi cấy (2) Tỉ lệ mảnh vỡ bào tương so với thể tích phôi (3) Sự đồng mặt kích thước cân đối phôi bào (4) Tình trạng phôi bào đa nhân Số lượng phôi bào tiêu chí dự báo vô cần thiết cho phép đánh giá kết phôi làm tổ tỉ lệ có thai chu kỳ thụ tinh ống nghiệm Mức độ mảnh vỡ bào tương xác định theo loại: - Mức độ nhẹ: tỉ lệ MVBT 25% thể tích phôi Năm 2012, Prados F J đưa tiêu chí đánh giá đồng phôi bào Theo phôi bào có mức độ chênh lệch mặt đường kính không vượt 20% đường kính phôi bào lớn coi đồng kích thước 1.1.2 Hình thái phôi nuôi cấy ngày Phân loại phôi túi dựa tiêu chí quan trọng, là: - Sự phát triển xoang túi phôi - Lá nuôi tế bào (TE- Trophectoderm) - Nụ phôi (ICM - Inner Cell Mass) Tốc độ phát triển xoang túi phôi có liên quan đến kết thành công chu kỳ chuyển phôi túi Hình thái nụ phôi có vai trò quan trọng việc đánh giá tiên lượng kết tỉ lệ thai sinh sống tiên lượng sảy thai sớm 4 Lá nuôi (Trophectoderm – TE) tế bào có kích thước nhỏ so với tế bào nụ phôi nằm bọc phía sát với màng suốt Có vai trò hỗ trợ phôi thoát màng giúp cho phôi làm tổ vào niêm mạc tử cung mẹ Cả nụ phôi nuôi chia thành loại dựa vào số lượng tế bào gắn kết tế bào Năm 2011, Ahlstrom A cho nuôi có vai trò quan trọng so với hình thái nụ phôi việc dự đoán tỉ lệ làm tổ phôi tiên lượng tỉ lệ thai sinh sống 1.2 Những nghiên cứu đánh giá phân loại phôi liên tục Lựa chọn phôi liên tục tập hợp liệu mang tính hệ thống thông số phát triển phôi nuôi cấy từ thụ tinh đến chuyển phôi, sử dụng đặc điểm hình thái đặc trưng phôi Việc áp dụng đánh giá phân loại phôi liên tục cho phép lựa chọn phôi tiềm cho chuyển phôi để đạt hiệu cao Một số nghiên cứu hạn chế sử dụng đơn độc tiêu chuẩn hình thái hợp tử hay phôi ngày để định phôi chuyển Từ kết nghiên cứu này, câu hỏi đặt phải nên sử dụng kết hợp liệu mang tính liên tục, xâu chuỗi đặc điểm hình thái phôi riêng biệt nuôi cấy từ ngày thứ 1đến ngày chuyển phôi để lựa chọn xác phôi tối ưu Chính khoảng năm gần có nhiều nghiên cứu ủng hộ cho việc sử dụng hệ thống tủ cấy time-lapse phương pháp tiên tiến việc nuôi cấy, theo dõi lựa chọn phôi chuyển Nhìn chung hệ thống cho phép thu thập thông tin đầy đủ trình phát triển phôi ống nghiệm để có nhìn tổng quan lựa chọn phôi chuyển Tuy nhiên, vấn đề có nên áp dụng tủ cấy time-lapse nuôi cấy phôi hay không nhiều tranh cãi Một vấn đề tài chính, so sánh giá tủ cấy time-lapse tủ cấy thường Đây vấn đề cần cân nhắc với trung tâm thụ tinh ống nghiệm nước phát triển có Việt nam Tại Việt nam chưa có nghiên cứu đánh giá ưu điểm hay cách kết hợp áp dụng đánh giá phân loại phôi liên tục để lựa chọn phôi chuyển ngày hay giai đoạn phôi túi Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng Gồm 1323 phôi ngày 184 phôi túi 181 bệnh nhân Trung tâm đào tạo nghiên cứu công nghệ phôi, Học viện Quân y thời gian từ năm 2012 đến năm 2014 Các bệnh nhân chia thành nhóm khác thời điểm chuyển phôi cách lựa chọn phôi chuyển, cụ thể: - Nhóm 1: Gồm 441 phôi 61 bệnh nhân chuyển phôi ngày 3, không phân loại phôi liên tục (PLPLT) - Nhóm 2: Gồm 452 phôi 61 bệnh nhân chuyển phôi ngày có PLPLT - Nhóm 3: Gồm 184 phôi túi nuôi cấy kéo dài từ 430 phôi ngày 59 bệnh nhân chuyển phôi ngày có PLPLT Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu - Chọn bệnh nhân ≤ 35 tuổi - Các bệnh nhân có niêm mạc tử cung ngày chuyển phôi từ 8mm đến 14mm siêu âm - Có noãn thu ngày chọc hút noãn - Có có phôi có 7-8 phôi bào nuôi cấy đến ngày Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân nghiên cứu - Các bệnh nhân không đủ điều kiện nêu - Có bệnh lý dị dạng tử cung âm đạo - Các trường hợp xin noãn hay xin phôi 6 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu Trung tâm Công nghệ Phôi – Học viện Quân y 2.1.3 Thời gian nghiên cứu Từ tháng 12 năm 2011 đến tháng năm 2014 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu Sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả tiến cứu có so sánh 2.2.2 Cỡ mẫu chọn mẫu * Sử dụng công thức tính cỡ mẫu so sánh tỉ lệ Trong đó: n: cỡ mẫu tối thiểu cần thiết cho nhóm Zα/2: Là hệ số tin cậy, với độ tin cậy 95% Zα/2 = 1,96 Zβ: Là giá trị ứng với lực mẫu, lực mẫu 80% Z β = 0,84 p1: Tỷ lệ có thai chuyển phôi nuôi cấy ngày p2: Tỷ lệ có thai chuyển phôi nuôi cấy ngày p = (p1+ p2)/2 ∆ = p1- p2 Tỉ lệ có thai chuyển phôi ngày ngày 43,5% 69,2% (Frattarelli 2003): p1 = 0,435 p2 = 0,692 Thay số vào công thức ta có n = 57,6 Như số lượng bệnh nhân tối thiểu cho nhóm nghiên cứu 58 * Để đánh giá tỉ lệ hình thành phôi túi Sử dụng công thức tính cỡ mẫu ước tính tỉ lệ n= ( Z1−α ) p (1 − p ) d2 Trong đó: n : cỡ mẫu nghiên cứu tối thiểu phải có Z1- α/2 : hệ số tin cậy, ứng với độ tin cậy 95% Z1- α/2 = 1,96 p: Tỉ lệ hình thành phôi túi từ nhóm phôi nuôi cấy ngày 7 Cỡ mẫu lớn tỉ lệ 50% (p = 0,5) d: sai số tuyệt đối 5% Như vậy, số lượng phôi nuôi cấy ngày tối thiểu phải có 385 phôi 2.2.3 Phương pháp, kỹ thuật Chọc hút noãn: Noãn lấy chọc hút hướng dẫn siêu âm qua đường âm đạo sau tiêm thuốc trưởng thành nang noãn khoảng thời gian từ 34 đến 35 Kỹ thuật IVF ICSI - Đối với kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm, noãn sau chọn cấy vào hộp cấy giếng có tinh trùng chuẩn bị sẵn - Đối với kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn, noãn làm khối tế bào nang cố định kim giữ Tinh trùng hút kim tiêm, tiêm vào bào tương noãn Chuyển phôi: Sử dụng thống tiêu chuẩn phân loại phôi theo đồng thuận để đánh giá chất lượng phôi chuyển Cụ thể:  Nhóm 1: Chỉ sử dụng đánh giá phân loại phôi thời điểm chuyển phôi ngày 3, không phân loại phôi liên tục (PLPLT)  Nhóm 2: Sử dụng PLPLT để lựa chọn phôi chuyển ngày  Nhóm 3: Sử dụng PLPLT để lựa chọn phôi chuyển ngày Thời điểm đánh giá chất lượng phôi nuôi cấy: Chất lượng hợp tử đánh giá thời điểm 17 ± giờ; chất lượng phôi ngày đánh giá thời điểm 68 ± phôi túi đánh giá thời điểm 116 ± tính từ tinh trùng tiếp xúc với noãn 2.2.4 Đánh giá hình thái cấu trúc phôi Toàn hình thái phôi phân loại theo tiêu chuẩn đồng thuận đánh giá chất lượng noãn phôi ALPHA năm 2011 2.2.5 Thu thập số liệu Toàn 1323 phôi ngày 184 phôi túi nhóm nghiên cứu chụp ảnh đo đạc phần mềm chuyên dụng đo đạc RI hãng Research Instruments (Anh quốc) 8 * Các tiêu nghiên cứu - Các tiêu đặc điểm mẫu nghiên cứu: tuổi, số năm vô sinh, phân loại vô sinh, phân loại nguyên nhân vô sinh, nồng độ FSH, LH, E2 đầu chu kỳ kinh, phác đồ kích thích buồng trứng, tổng liều FSH sử dụng, số nang, số noãn thu được, kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm - Các tiêu hình thái phôi nuôi cấy: hình thái phôi giai đoạn hợp tử, hình thái phôi ngày (đường kính phôi, chiều dày màng suốt, số lượng phôi bào, tỉ lệ MVBT ), hình thái phôi ngày (đường kính phôi túi, chiều dày màng suốt, phân loại túi phôi, hình thái nụ phôi, nuôi) - Các tiêu kết chuyển phôi: số lượng phôi chuyển, định lượng βhCG sau chuyển phôi 14 ngày, số túi ối, số thai, số tim thai, số lượng thai sinh sống 2.2.6 Phân tích xử lý số liệu Các số liệu xử lý chương trình SPSS 13.0 for Window 2.2.7 Vấn đề đạo đức nghiên cứu - Các thủ tục hành nghiên cứu tuân thủ theo qui định luật pháp Việt Nam ban hành lĩnh vực Hỗ trợ sinh sản - Đối tượng nghiên cứu đồng ý tự nguyện tham gia, tự nguyện có đơn xin hỗ trợ sinh sản cam kết thực kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm - Đo kích thước theo tiêu nghiên cứu thực ảnh, thời gian chụp ảnh khống chế phút nhằm đảm bảo không ảnh hưởng đến chất lượng phôi Chương 3: KẾT QUẢ 3.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu * Tuổi số năm vô sinh trung bình Bảng 3.1 Tuổi thời gian vô sinh trung bình nhóm bệnh nhân nghiên cứu Nhóm Nhóm Nhóm p Tuổi 29,9 ± 2,9 30,9 ± 2,4 30,2 ± 2,5 >0,05 Số năm VS 5,4 ± 2,3 5,9 ± 3,05 5,8 ± 2,8 >0,05 p tính theo so sánh phương sai ANOVA yếu tố Không có khác biệt tuổi, số năm vô sinh trung bình nhóm nghiên cứu (p>0,05) * Đặc điểm kích thích buồng trứng Bảng 3.5 Đặc điểm kích thích buồng trứng Nhóm nghiên cứu p Thông số Nhóm Nhóm Nhóm Tổng liều 1392,2 ± 280,5 1444,7 ± 253,7 1425,0 ± 295,8 >0,05 FSH(IU) E2N8 1451,3 ± 862,2 1407,2 ±1103,4 1571,7 ± 980,9 >0,05 (ng/mL) Số nang 14,39 ± 7,41 14,33 ± 6,13 15,07 ± 5,22 >0,05 trứng Số noãn 10,28 ± 2,80 10,39 ± 2,49 10,42 ± 2,47 >0,05 chọc hút p tính theo so sánh phương sai ANOVA yếu tố Không có khác biệt so sánh giá trị trung bình nồng độ E2 ngày 8, tổng liều FSH sử dụng, số nang số noãn trung bình nhóm bệnh nhân nghiên cứu (p>0,05) 3.2 Hình thái phôi nuôi cấy ngày 3.2.1 Các đặc điểm hình thái phôi nuôi cấy ngày * Phân loại chất lượng phôi ngày nhóm nghiên cứu Bảng 3.9 Phân loại chất lượng phôi nuôi cấy ngày Nhóm nghiên cứu Phân loại Tổng chất lượng Nhóm Nhóm Nhóm Tốt 125 130 119 374 10 (28,4 %) (28,8 %) (27,6 %) (28,3 %) 188 200 186 574 Trung bình (42,6 %) (44,2 %) (43,3 %) (43,4 %) 128 122 125 375 Xấu (29,0 %) (27,0 %) (29,1 %) (28,3 %) 441 452 430 1323 Tổng (100 %) (100 %) (100 %) (100 %) p1,2; p1,3; p2,3 so sánh nhóm 1, tính theo kiểm định χ2 Không có khác biệt chất lượng phôi ngày nhóm nghiên cứu (p>0,05) 3.2.2 Các thông số đo đạc phôi nuôi cấy ngày * Đường kính chiều dày ZP nhóm nghiên cứu Bảng 3.11 So sánh đường kính phôi chiều dày ZP nhóm nghiên cứu Nhóm n Đường kính (μm) Nhóm 441 154,0 ± 2,5 Nhóm 452 154,4 ± 2,7 nghiên cứu p Chiều dày ZP (μm) p 15,7 ± 1,4 >0,05 15,6 ± 1,3 >0,05 Nhóm 430 154,1 ± 2,6 15,7 ± 1,4 p tính theo so sánh phương sai ANOVA yếu tố Không có khác biệt giá trị trung bình chiều dày màng suốt đường kính phôi nuôi cấy ngày 181 bệnh nhân nhóm nghiên cứu (p>0,05) * Mối tương quan số lượng phôi bào với đường kính, chiều dày màng suốt (ZP) Phương trình tương quan đường kính phôi số lượng phôi bào (Pearson's r = 0,67): 11 Đường kính phôi (μm) = 145,65 + (Số lượng phôi bào) x 1,31 Phương trình tương quan chiều dày ZP số lượng phôi bào (Pearson's r = - 0,4): Chiều dày ZP (μm) = 18,38 - (Số lượng phôi bào) x 0,41 * Mối tương quan tỉ lệ MVBT với đường kính, chiều dày ZP Phương trình tương quan đường kính phôi với tỉ lệ MVBT (Pearson's r= -0,55): Đường kính phôi (μm) = 155,96 - (% MVBT) x 0,11 Phương trình tương quan chiều dày ZP với tỉ lệ MVBT (r=0,3): Chiều dày màng suốt (μm) = 15,19 + (% MVBT) x 0,03 * Mối tương quan chất lượng phôi ngày với đường kính, chiều dày ZP Bảng 3.13 So sánh kích thước phôi phôi có chất lượng khác theo tiêu chuẩn phân loại đồng thuận Alpha Phân loại Tốt Trung bình Xấu r n 374 574 375 Đường kính phôi(μm) 155,8 ± 1,6 154,5 ± 2,3 152,1 ± 2,5 0,54 Chiều dày ZP(μm) 15,1 ± 1,4 15,7 ± 1,2 16,1 ± 1,3 -0,29 p[...]... nụ phôi của 162 phôi túi (gồm: 159 phôi độ 3 và 3 phôi độ 4) Bảng 3. 14 Mối liên quan hình thái lá nuôi và nụ phôi Hình thái nụ phôi Hình thái Tổng lá nuôi A B C p ... lượng phôi ngày chất lượng phôi ngày 3. 5 Bước đầu đánh giá phân loại phôi liên tục (PLPLT) nuôi cấy phôi ngày ngày 3. 5. 1 Bước đầu phân loại phôi liên tục nuôi cấy phôi ngày Bảng 3. 25 Phân bố 452 phôi. ..2 Đánh giá mối liên quan đặc điểm hình thái phôi nuôi cấy ngày với ngày bước đầu đánh giá kết áp dụng phân loại phôi liên tục nuôi cấy phôi ngày ngày Những đóng góp luận án Nghiên cứu thực... - Nhóm 3: Gồm 184 phôi túi nuôi cấy kéo dài từ 430 phôi ngày 59 bệnh nhân chuyển phôi ngày có PLPLT Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu - Chọn bệnh nhân ≤ 35 tuổi - Các bệnh nhân có