Đang tải... (xem toàn văn)
Khảo sát khả năng sinh amylase của một số chủng vi khuẩn sinh bào tử
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC –&— LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH AMYLASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN SINH BÀO TỬ GVHD: ThS Nguyễn Kim Minh Tâm SVTH: Hồ Thị Mỹ Linh MSSV: 60701279 Tp HCM, tháng 01 năm 2012 LỜI CẢM ƠN Luận văn đề tài “Khảo sát khả sinh amylase ngoại bào số chủng vi khuẩn sinh bào tử” thực từ tháng 9/2011 đến tháng 1/2012 Trong suốt trình làm luận văn nhiều giúp đỡ của: Thạc sĩ Nguyễn Kim Minh Tâm – Bộ môn Công nghệ Sinh học trường đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh gợi ý đề tài, tận tình hướng dẫn, cung cấp tài liệu động viên tinh thần để hoàn thành tốt luận văn Các thầy cô giáo môn Công nghệ Sinh học thầy cô giáo khoa Kỹ thuật Hóa học Đại học Bách Khoa TpHCM tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức để hoàn thành tốt luận văn Cán phòng thí nghiệm 102, 108 117 Bộ môn công nghệ Sinh học, trường Đại học Bách Khoa TpHCM tạo điều kiện thuận lợi để sử dụng trang thiết bị dụng cụ thí nghiệm Cán phòng thí nghiệm Hữu – Bộ môn Kỹ thuật Hóa hữu cơ, Đại học Bách khoa TpHCM cho mượn số dụng cụ thí nghiệm Cha, mẹ, anh em động viên tinh thần, giúp đỡ mặt kinh tế để an tâm thực luận văn Các bạn thân bạn sinh viên lớp HC07BHS – Đại học Bách Khoa TpHCM – học tập, trao đổi kinh nghiệm giúp đỡ trình làm việc Xin gửi đến người lời cảm ơn chân thành! i TÓ M TẮ T Enzyme amylase giúp phân hủy tinh bột hay glycogen, hữu ích nhiều lĩnh vực công nghiệp thực phẩm, dệt, giấy y học… Amylase thu nhận từ nhiều nguồn: động vật, thực vật vi sinh vật, amylase từ vi sinh vật sử dụng nhiều Trong đất, có nhiều loài vi sinh vật có ích có khả sinh amylase Do đó, việc phân lập chúng bước đầu quan trọng hỗ trợ cho nghiên cứu sau Bằng trình thực nghiệm, phân lập chủng vi khuẩn sinh bào tử có khả sinh amylase từ đất khảo sát hoạt tính enzyme amylase chúng Kết thu cho thấy chủng vi khuẩn sinh trưởng phát triển tốt 370C môi trường pH7 Thời gian nuôi cấy để lượng enzyme sinh cao 24 giờ, môi trường có 2% tinh bột, nhiệt độ hoạt động tối ưu enzyme khoảng 50-700C ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN I TÓM TẮT II MỤC LỤC III DANH MỤC BẢNG VI DANH MỤC HÌNH .VII DANH MỤC BIỂU ĐỒ VIII MỞ ĐẦU TỔNG QUAN ĐỊNH NGHĨA VỀ ENZYME 1.1 Enzyme ngoại bào 1.2 Enzyme nội bào ENZYME AMYLASE 2.1 Định nghĩa 2.2 Phân loại 2.3 Một số enzyme amylase phổ biến NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE 11 ỨNG DỤNG CỦA AMYLASE TRONG THỰC TẾ ĐỜI SỐNG VÀ SẢN XUẤT 12 4.1 Ứng dụng amylase công nghệ thực phẩm 12 4.2 Ứng dụng ngành công nghiệp khác 14 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP AMYLASE Ở VI SINH VẬT 15 5.1 Nhiệt độ 15 5.2 pH môi trường 16 5.3 Độ thông khí 16 iii 5.4 Thành phần môi trường 16 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH AMYLASE CỦA VI SINH VẬT 17 6.1 Nhiệt độ 17 6.2 pH 18 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA AMYLASE 18 7.1 Xác định hoạt tính amylase phương pháp Wolhgemuth 19 7.2 Phương pháp Heinkel 19 7.3 Phương pháp xác định đường khử tạo thành (phương pháp Nelson) 19 PHÂN LẬP VI KHUẨN SINH BÀO TỬ CÓ KHẢ NĂNG SINH AMYLASE 20 8.1 Phân lập vi khuẩn 20 8.2 Đặc điểm chi vi khuẩn cần phân lập 20 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 23 1.1 Đối tượng nghiên cứu 23 1.2 Môi trường thí nghiệm 23 1.3 Vật liệu thử hoạt tính sinh học 24 1.4 Dụng cụ thí nghiệm 25 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 26 2.1 Giai đoạn 27 2.2 Giai đoạn 27 2.3 Giai đoạn 27 2.4 Giai đoạn 28 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1 Phương pháp phân lập 28 3.2 Phương pháp kiểm tra khả sinh amylase vi khuẩn 30 3.3 Phương pháp khảo sát khả thích nghi vi khuẩn 31 iv 3.4 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn để thu amylase 31 3.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme amylase ngoại bào vi khuẩn 31 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23 PHÂN LẬP VI KHUẨN SINH AMYLASE 35 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH AMYLASE CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN 39 KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ HOẠT ĐỘNG TỐI ƯU CỦA AMYLASE 45 BÀN LUẬN 47 KẾT LUẬN 35 PHỤ LỤC 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 54 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 55 v DANH MỤC BẢNG Bảng Cách thực giai mẫu để xác định đường chuẩn tính hoạt độ amylase 32 Bảng Các bước pha mẫu để xác định hoạt độ amylase 33 Bảng Khả sinh amylase ngoại bào khả thích nghi với môi trường số chủng vi sinh vật phân lập 35 Bảng Kết khảo sát thay đổi hoạt tính amylase chủng vi khuẩn 19 theo thời gian 39 Bảng Kết khảo sát thay đổi hoạt tính amylase chủng vi khuẩn 20 theo thời gian 40 Bảng Kết khảo sát thay đổi hoạt tính amylase chủng vi khuẩn 21 theo thời gian 41 Bảng Kết khảo sát thay đổi hoạt tính amylase chủng vi khuẩn 24 theo thời gian 42 Bảng Kết khảo sát thay đổi hoạt tính amylase chủng vi khuẩn 25 theo thời gian 43 Bảng So sánh hoạt tính amylase cực đại chủng vi khuẩn 44 Bảng 10 Kết khảo sát hoạt tính amylase từ chủng 20 tinh bột nhiệt độ khác 46 vi DANH MỤC HÌNH Hình Sơ đồ cấu trúc không gian α–amylase Hình Sơ đồ cấu trúc không gian β – amylase Hình Sơ đồ cấu trúc không gian enzyme γ – amylase 10 Hình Kết khảo sát sơ khả sinh amylase ngoại bào số chủng vi khuẩn 37 Hình Khảo sát phát triển chủng vi khuẩn môi trường có pH khác 37 Hình Khảo sát phát triển chủng vi khuẩn nhiệt độ khác 38 Hình Kết so sánh khả sinh amylase ngoại bào chủng vi khuẩn 38 vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Đường chuẩn định lượng tinh bột phương pháp Heinkel 33 Biểu đồ Hoạt tính amylase chủng 19 theo thời gian 40 Biểu đồ Hoạt tính amylase chủng 20 theo thời gian 41 Biểu đồ Hoạt tính amylase chủng 21 theo thời gian 42 Biểu đồ Hoạt tính amylase chủng 24 theo thời gian 43 Biểu đồ Hoạt tính amylase chủng 25 theo thời gian 44 Biểu đồ Hoạt tính amylase cực đại chủng vi khuẩn khảo sát 45 Biểu đồ Hoạt tính amylase chủng vi khuẩn 20 nhiệt độ khác 46 viii MỞ Đ ẦU Hồ Thị Mỹ Linh Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012 3.0819 Hoạt tính enzyme 3.2 2.4 1.6 1.463 1.4183 0.7495 0.8 0.4778 19 20 21 24 Chủng vi khuẩn 25 Biểu đồ Hoạt tính amylase cực đại chủng vi khuẩn khảo sát w Nhận xét chủng vi khuẩn khảo sát có khả sinh amylase ngoại bào môi trường chứa 5% tinh bột tốt môi trường 2% tinh bột phải từ 48 h trở lên amylase vi khuẩn đạt hoạt tính cực đại Riêng chủng 20, amylase thu đạt hoạt tính cực đại nhanh (24 h) cao môi trường (2 5% tinh bột) Từ kết này, chọn chủng 20 để tiếp tục khảo sát tính bền với nhiệt enzyme KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ HOẠT ĐỘNG TỐI ƯU CỦA AMYLASE Chủng 20 nuôi môi trường chứa 2% tinh bột 37oC, lắc 150 vòng/phút; thu dịch enzyme hai thời điểm 24 28 sau bắt đầu nuôi cấy; thực phản ứng thủy phân tinh bột nhiệt độ 30, 50, 70 90oC Kết nghiên cứu 45 Hồ Thị Mỹ Linh Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012 Bảng 10 Kết khảo sát hoạt tính amylase từ chủng 20 tinh bột nhiệt độ khác Nhiệt độ (oC) Thời gian 30 50 70 90 24 h 2.3797 2.4215 2.526 2.4842 28 h 2.4215 2.7559 2.8186 2.0035 Hoạt tính 2.5 24H 28H 1.5 30 50 70 90 Nhiệt độ Biểu đồ Hoạt tính amylase chủng vi khuẩn 20 nhiệt độ khác w Nhận xét Kết thu cho thấy amylase chủng vi khuẩn 20 bền với nhiệt, hoạt động tới nhiệt độ 900C Nhiệt độ hoạt động tối ưu enzyme 700C (hoạt tính thời điểm 24 2.526 µg/ml, 28giờ 2.8161 µg/ml) Sau 700C, hoạt tính enzyme bắt đầu giảm Khi tăng nhiệt độ lên đến 70oC amylase thu thời điểm 28 có hoạt tính cao enzyme thu thời điểm 24h Tuy nhiên, nhiệt độ vượt Kết nghiên cứu 46 Hồ Thị Mỹ Linh Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012 70oC hoạt tính amylase T28 giảm hẳn enzyme thu T24 gần không thay đổi hoạt tính BÀN LUẬN Khả tích tụ amylase loài vi sinh vật khác thời gian nuôi cấy chúng để thu lượng amylase cực đại khác Có loài vi khuẩn sinh amylase cực đại pha tăng trưởng, có loài sinh amylase cực đại pha cân Do phạm vi đề tài nghiên cứu tiến hành nuôi vi khuẩn khảo sát hoạt tính amylase theo thời gian (dựng đường cong enzyme) để tìm thời gian nuôi cấy đạt lượng amylase cao ứng với loài vi sinh vật Theo kết nên trên, chủng 20 cần nuôi 24 để đạt amylase cực đại, chủng lại hầu hết phải nuôi cấy đến 48 Lượng amylase thu từ chủng 20 có hoạt tính cao chủng 19, 21, 24 25 Theo lý thuyết, đường cong enzyme có dạng đường cong sinh trưởng Mỗi chủng vi sinh vật có đường cong sinh trưởng đường cong enyzme khác Với chủng vi khuẩn 20 đường cong enzyme khảo sát phân biệt rõ rệt pha thích nghi (0-16 giờ), pha tăng trưởng (16-24 giờ), pha cân (24-28 giờ) bước đầu pha suy vong (sau 28 giờ) Tuy nhiên, chủng lại đường cong enzyme mà dựng rõ Đường cong enzyme chủng 19 có điểm cực đại sau hoạt tính enzyme giảm xuống rõ rệt Tương tự chủng 21, 24 25 Kết nhiều nguyên nhân: - Hoạt tính enzyme vi khuẩn không bền, dễ trình khảo sát hoạt tính kết có phần không xác - Chưa bố trí thí nghiệm để khảo sát hoạt tính enzyme khoảng cách thời gian ngắn để thấy rõ kéo dài pha Kết nghiên cứu 47 Hồ Thị Mỹ Linh Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012 - Thành phần môi trường hay điều kiện nuôi cấy chưa phải tối ưu cho tất chủng vi khuẩn Việc sản sinh amylase phụ thuộc vào chủng vi khuẩn, thành phần môi trường, phương pháp nuôi cấy, phát triển tế bào vi khuẩn, nhu cầu dinh dưỡng, ion kim loại, pH, nhiệt độ thời gian nuôi cấy Do có hạn chế điều kiện thời gian, đề tài khảo sát ảnh hưởng nồng độ tinh bột thời gian nuôi cấy đến khả sinh amylase ngoại bào chủng vi khuẩn Tinh bột nguồn chất cảm ứng vi khuẩn sinh amylase Vi khuẩn phát triển, nguồn dinh dưỡng dễ hấp thu môi trường cạn kiệt dần, đến lúc vi khuẩn phải tiết amylase phân hủy tinh bột thành hợp chất đơn giản cho vi khuẩn hấp thụ tiếp Cơ chất cảm ứng kích thích sinh nhiều amylase, giai đoạn đầu nồng độ chất tăng, vận tốc phản ứng tăng, vận tốc phản ứng đạt cực đại có tăng chất, vận tốc phản ứng tăng thêm Trong bài, việc bổ sung chất (tinh bột) không tỷ lệ thuận so với việc tăng lượng enzyme amylase Cụ thể theo kết thí nghiệm: với nồng độ tinh bột môi trường 2% 5% hoạt tính enzyme cao chủng vi khuẩn là: - Chủng 19: 0.9013 µg/ml 0.9852 µg/ml - Chủng 21: 0.4151 µg/ml 0.7495 µg/ml - Chủng 24: 0.1852 µg/ml 0.4151 µg/ml - Chủng 25: 0.3942 µg/ml 0.4778 µg/ml Riêng chủng 20 nồng độ 2% tinh bột lại điều kiện tốt cho sinh enzyme vi khuẩn: 2%: 3.082 µg/ml 5%: 2.443 µg/ml Đôi nồng độ chất cảm ứng cao nguyên nhân gây ức chế trình sản sinh amylase vi khuẩn Dựa vào kết nêu trên, ta thấy chọn nuôi cấy vi khuẩn môi trường có bổ sung 2% tinh bột kinh tế hợp lý Kết nghiên cứu 48 Hồ Thị Mỹ Linh Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012 Tuy nhiên, trình thí nghiệm có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết xác định hoạt tính amylase phương pháp Heinkel (phương pháp so màu) - Do điều kiện thí nghiệm, tiến hành lập đường chuẩn máy đo quang mẫu đem xác định hoạt tính lại đo máy đo quang khác, nên kết không xác tuyệt đối - Việc dùng cuvet nhựa có ảnh hưởng đến kết đo Để hạn chế sai số trường hợp này, tiến hành đo tất mẫu cuvet đo từ mẫu nhạt (mẫu thí nghiệm) đến mẫu đậm (mẫu kiểm tra) Từ kết xây dựng đường cong enzyme, xác định thời gian sinh amylase cực đại chủng 20 24 (chủng 20 chủng sản sinh enzyme có hoạt tính cao nhất) Dựa sở đó, thí nghiệm thiết kế thử hoạt tính enzyme nhiệt độ từ 30 đến 900C để thấy ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme Trong trình thực nghiệm, khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động enzyme thu thời điểm 24 28 Enzyme thu có độ bền nhiệt cao, chứng hoạt tính enzyme trì từ 2.7 đến 2.8 µg/ml nhiệt độ khoảng từ 50 đến 70oC Lên đến 90oC, hoạt tính enzyme giữ mức 2.0µg/ml Theo lý thuyết enzyme có khoảng nhiệt độ hoạt động thích hợp Khi nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng tăng theo Tuy nhiên, tăng vượt mức (nhiệt độ tối ưu) hoạt tính enzyme giảm giảm nhanh Hiện tượng có quan hệ mật thiết với cấu trúc enzyme Bản chất enzyme protein Khi tăng nhiệt độ, lúc đầu vận tốc phản ứng tăng cấu trúc không gian enzyme phù hợp với cấu trúc không gian chất Khi vượt giới hạn nhiệt độ, cấu trúc không phù hợp nữa, enzyme giảm hoạt tính bị triệt tiêu Enzyme amylase vi khuẩn 20 đề tài enzyme bền nhiệt Kết nghiên cứu 49 Hồ Thị Mỹ Linh Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012 Phương pháp đo hoạt tính góp phần vào việc thu kết tốt: - Trong phương pháp đo có bổ sung thêm NaCl chất hoạt hóa enzyme amylase, hỗ trợ cho việc xác định hoạt tính enzyme - Theo nghiên cứu trước hoạt tính amylase vi khuẩn phụ thuộc vào pH Trong chọn dung dịch đệm pH thích hợp cho hoạt động amylase vi khuẩn Ngoài ra, yếu tố lại chất amylase: amylase vi khuẩn có hàm lượng Ca cao cấu trúc enzyme, tăng khả hoạt động vi khuẩn nhiệt độ tăng Hoạt lực amylase vi khuẩn lại bền hoạt lực amylase nấm mốc Kết nghiên cứu 50 K ẾT L U Ậ N Hồ Thị Mỹ Linh Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012 Đất môi trường thuận lợi cho nhiều vi sinh vật phát triển, bao gồm sinh vật có lợi có hại Phân lập từ đất vi khuẩn sinh bào tử có khả sinh amylase nghiên cứu để sử dụng có hiệu amylase thu nhận Amylase enzyme phân hủy tinh bột, đóng vai trò quan trọng công nghiệp công nghệ sinh học Có thể thu nhận amylase từ nhiều nguồn động vật, thực vật vi sinh vật, đó, amylase từ vi sinh vật nguồn dồi Đặc biệt, amylase vi khuẩn chịu nhiệt dễ dàng ứng dụng nhiều lĩnh vực Nhiệt độ pH tối ưu cho phát triển vi khuẩn sinh amylase tương ứng 370C 7.0 Thời gian thu amylase cực đại 24 nuôi cấy, nhiệt độ hoạt động tối ưu amylase 700C Kết luận 51 PH Ụ L ỤC Hồ Thị Mỹ Linh Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012 Bảng 11 Hình thái số chủng vi khuẩn phân lập Kích thước khuẩn lạc (mm) Bề mặt Rìa Chủng Màu sắc Hình dạng khuẩn lạc trắng đục không định 0.5 – nhám trơn vàng nâu không định 1–3 nhăn nhăn vàng nâu không định 1–2 nhăn nhăn da người tròn 1.5 trơn trơn vàng nâu nhạt không định 1–3 nhăn nhăn vàng nâu không định trơn nhăn cam nhạt không định trơn láng trơn trắng đục không định 1–3 nhăn nhăn trắng đục không định trơn, láng trơn 10 vàng nâu không định trơn nhăn 11 trắng sữa tròn nhăn, khô nhăn 12 cam nhạt không định trơn trơn 13 cam tròn nhám nhăn 14 cam tròn 1–3 nhám nhăn 15 vàng nâu nhạt không định 0.5 – trơn nhăn 16 màu da không định nhám nhăn 17 trắng sữa không định trơn nhăn 18 hồng không định 0.5 – trơn nhăn, 19 cà phê sữa không định 0.5 trơn nhăn 20 vàng nâu nhạt không định trơn nhăn 21 vàng nghệ tròn trơn nhăn 22 hồng cam tròn 1–2 trơn trơn 23 vàng nghệ không định trơn nhăn Phụ lục 52 Hồ Thị Mỹ Linh Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012 Kích thước khuẩn lạc (mm) Bề mặt Rìa Chủng Màu sắc Hình dạng khuẩn lạc 24 vàng nghệ tròn trơn nhăn 25 vàng nghệ tròn 0.5 trơn nhăn 26 màu da tròn 0.5 – trơn trơn 27 trắng sữa không định 0.5 nhám nhăn 28 trắng sữa tròn – 2.5 có núm nhăn nhăn 29 trắng +vàng nhạt tròn trơn nhăn 30 trắng sữa tròn trơn nhăn 45 nâu đất tròn nhám trơn 54 trắng sữa tròn trơn nhăn 55 vàng nhạt không định 0.5 nhám nhăn 56 vàng nâu nhạt không định nhám nhăn 57 vàng nhạt không định nhám nhăn 71 cam nhạt không định 1–3 nhám nhăn 73 vàng nhạt không định trơn láng nhăn 75 vàng nhạt tròn trơn trơn 76 trắng ngà tròn trơn láng trơn 79 trắng ngà tròn 1.5 trơn nhăn Phụ lục 53 T À I L IỆ U THAM KHẢO Hồ Thị Mỹ Linh Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Nguyễn Đức Lượng, 2006 Công nghệ Vi Sinh Vật tập 1, Cơ sở vi sinh vật công nghiệp Nhà xuất Đại học Quốc gia, Tp.HCM 2006 [2] Nguyễn Đức Lượng, 2002 Công nghệ Vi sinh vật tập 2, Vi sinh vật học công nghiệp Nhà xuất Đại học Quốc gia, Tp.HCM [3] Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), 2004 Công nghệ enzyme Nhà xuất Đại học Quốc gia, Tp.HCM [4] Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, 2003 Thí nghiệm Công nghệ Sinh học tập 1Thí nghiệm hóa sinh học Nhà xuất Đại học Quốc gia, Tp.HCM [5] Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2003 Thí nghiệm Công nghệ Sinh học tập – Thí nghiệm vi sinh vật học Nhà xuất Đại học Quốc gia, Tp.HCM 2003 [6] Huỳnh Ngọc Oanh, Vũ Thanh Thảo, 2007 Khảo sát trình cố định enzyme α- amylase (Termamyl) chất mang CMC – Alginate Science and Technology Development, Vol 10, No.12 [7] Nguyễn Kim Minh Tâm, 2000 Góp phần nghiên cứu khả sinh protease ngoại bào số chủng vi sinh vật Luận văn Thạc sĩ Dược học, ĐH Y Dược Tp.HCM [8] Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà, Vũ Minh Đức, Chu Văn Mẫn, 2009 Nghiên cứu hoạt tính enzyme ngoại bào số chủng Bacillus phân lập khả ứng dụng chúng xử lý nước thải Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ , 25: 101-106 [9] Trần Thị Ánh Tuyết, Trương Quốc Huy, 2010 Khảo sát điều kiện nuôi cấy phương pháp tách chiết enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis Tuyển tập Báo cáo Hội Nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7, Đại học Đà Nẵng Tài liệu tham khảo 54 Hồ Thị Mỹ Linh Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012 TÀI LIỆU TIẾNG ANH [10] Ajayi, Adedayo Olajide and Fagade, Obasola Ezekiel, 2007 Heat activation ang stability of amylases from Bacillus species African Journal of Biotechnology Vol.6 (10): 1181-1184 [11] Belma ASLIM, Necdet Saglam, Yavuz Beyatli, 2002 Determination of some properties of Bacillus isolated from soil Turk J Biol, Vol 26: 41-48 [12] Carlos Eduardo de Suoza Teodoro, Meire Lelis Leal Martins Culture conditions for the production of thermostable amylase by Bacillus sp Bzarilian Journal of Microbiology, Vol 31, pp 298-202 [13] E Sarikaya and Cirakoglu, 1989 Investigation of alpha – amylase production from Bacillus subtilis in different media Commun Fac, Sci Univ Ank Serie C, Vol 7: 31-37 [14] M Asgher, M Javaid Asad, S U Rahman, R L Legge A thermostable αamylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing Joural of Food Engineering, 79 (2007), 950-955 [15] Mohsne Fathi Najafi, Dileep Deobagkar, Deepti Deobagakar, 2005 Purification and characterization of an extracellular anpha amylase from Bacillus subtilis AX20 Protein Expression and Purification 41: 349-354 [16] Mukesh D Nimkar, N G Deogade and Meghna Kawale, 2010 Production of α- amylase from Bacillus subtilis & Aspergillus niger using different agro waste by solid state fermentation Asiatic Joural of Biotechnology Resources, Vol 1: 23-28 [17] Nadia Riaz, Ikram-UL-Haq and M.A Qadeer, 2003 Characterizatin of αamylase by Bacillus subtilis International Journal of Agricultire and Biology, Vol 5, No 3, 2003 Tài liệu tham khảo 55 Hồ Thị Mỹ Linh Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012 [18] N T Mai, D T Giang, N T N Minh and V T Thảo Thermophilic amylaseproducing bacteria from Vietnamese soil World Joural of Microbiology and Biotechnology, Vol 8, page 505-508 [19] N.S Reddy, Annapoorrna Nimmagadda and K R S Sambasiva Rao,2003 An overview of the microbial anpha amylase family African Journal of Biotechnolgy Vol (12): 645-648 [20] Nurullah Akcan, Fikret Uyar, Aysel Guven Alpha- amylase production by Bacillus subtilis RSKK96 in submerged cultivation Kafkas Univ Vet Fak Dreg, 17: 17-22, 2011 [21] R Vidyalakshmi, R Paranthaman and J Indhumathi, 2009 Amylase production on Submerged Fermentation by Bacillus spp World Journal of Chemiscal (1): 89-91 [22] Sasmita Mishra and Niranjan Behera, 2008 Amylase activity of a starch degrading bacteria isolated from soil receiving kitchen wastes African Journal of Biotechnology, Vol.7 (18), 3326-3331 [23] S Thippeswamy, K Girigowda and V H Mulimani, 2006 Isolation and identification of anpas amylase producing Bacillis sp From dhal industry waste Indian journal of Biochemistry & Biophysics, Vol 43: 295-298 [24] V P Zambare, 2011 Optimization pf amylase production from Bacillus sp Using statistics base experimental design Center for Bioprocessing Research and Development, South Dakota School of Mines and Technology, Vol 23, No 1, page 37-47 [25] Wenbo Zhi, Jiangnan Song, Jingxiu Bi, Fan Ouyang, 2004 Partial purification of anpha amylase from culture supernatant of Bacillus subtilis in aqueous two- phase system Bioprocess and Biosystems Engineering Tài liệu tham khảo 56 [...]... lập và khảo sát khả năng sinh amylase của một số chủng vi khuẩn sinh bào tử, xác định hoạt tính amylase thu được để làm tiền đề cho các nghiên cứu về sau w Nội dung nghiên cứu Bao gồm nội dung chính: - Phân lập và tuyển chọn các chủng sinh bào tử có khả năng sản sinh amylase hoạt tính cao trong môi trường đất - Nghiên cứu hình thái khuẩn lạc, hình thái bào tử của các chủng tuyển chọn - Khảo sát thời... trưc khuẩn Gram dương, thường xếp thành cặp hay thành chuỗi, có một bào tử duy nhất Bào tử hình bầu dục giúp vi khuẩn chống lại điều kiện khắc nghiệt của môi trường, nhưng bào tử không ngăn sự tiếp xúc với không khí Các loài vi khuẩn Bacillus được chia thành ba nhóm dựa trên hình thái của bào tử và vỏ bào tử như sau: - Nhóm 1: Gram dương, hình thành bào tử ở trung tâm hay ở cuối, hình elip, bào tử hình... động của enzyme trong phương pháp này được định nghĩa là lượng enzyme có thể phân giải được tinh bột trong 30 phút ở 300C cho ra lượng đường khử tương đương 1µmol glucose 8 PHÂN LẬP VI KHUẨN SINH BÀO TỬ CÓ KHẢ NĂNG SINH AMYLASE 8.1 Phân lập vi khuẩn [5][7] Phân lập một vi sinh vật là quá trình tách riêng vi sinh vật đó từ mẫu hay từ quần thể vi sinh vật ban đầu để thu nhận giống thuần khiết Giống vi sinh. .. TÍNH AMYLASE CỦA VI SINH VẬT [3][10][20] 6.1 Nhiệt độ Amylase có khoảng nhiệt độ hoạt động tương đối rộng Amylase của nấm hoạt động ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ của amylase vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn chịu nhiệt có thể hoạt động ở 95 – 1050C.[3] Nhiệt độ tối ưu của vi khuẩn Bacillus trong khoảng 70 – 750C.[3] Amylase của vi khuẩn là bền nhiệt hơn cả, nó có thể chịu được nhiệt độ 920C, trong khi đó amylase. .. TRÌNH SINH TỔNG HỢP AMYLASE Ở VI SINH VẬT [2][3] 5.1 Nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp của vi sinh vật cũng như tính chất của enzym được tổng hợp Mỗi loài vi sinh vật có một khoảng nhiệt độ hoạt động thích hợp khác nhau Nói chung đa số vi sinh vật tổng hợp enzym không bền với nhiệt và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp, enzyme của vi khuẩn. .. cường cảm ứng sinh amylase, một số khác lại ức chế quá trình này 5.4.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng Các nguyên tố vi lượng và đa lượng có ảnh hưởng lớn tới sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme amylase của vi sinh vật Trong các cấu tử vô cơ trong môi trường nuôi cấy B subtilis và vi sinh vật khác cho hoạt lực amylase cao cần có muối của mangan, kẽm cùng một số nguyên tố vi lượng khác 6 CÁC YẾU TỐ... thành trên bề mặt môi trường các đĩa này, giống vi sinh vật được xem là thuần khiết nếu có duy nhất một khuẩn lạc có hình thái y hệt các khuẩn lạc được phân lập ở đĩa thứ nhất (đĩa phân lập) 8.2 Đặc điểm của chi vi khuẩn cần phân lập [1][5][7] Do các ưu điểm của amylase từ vi sinh vật đã nêu ở trên, người ta tiến hành thu amylase từ vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn Bacillus Tổng quan 20 Hồ Thị Mỹ Linh Luận... là enzyme amylase Trước đây, người ta sử dụng enzyme a -amylase của malt hay pancreatic amylase Để phá hủy nhanh lượng tinh bột thừa, người ta đưa nhiệt độ đến nhiệt độ sôi sau đó làm giảm xuống 50°C hay 60°C và cho enzyme amylase vào Ngày nay người ta sử dụng a -amylase của vi khuẩn Enzyme amylase của vi khuẩn chịu nhiệt cao, chúng hoạt động mạnh ở nhiệt độ 85°C-90°C Một số enzyme amylase của Bacillus... kết bên trong của chuỗi polysaccharide Exoamylase gồm có β -amylase và γ -amylase Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide 2.3 Một số enzyme amylase phổ biến [3][20] 2.3.1 Enzym α amylase (EC 3.2.1.1) hay 4-α-D-glucan glucanohydrolase Hình 1 Sơ đồ cấu trúc không gian của α amylase [20] α -amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng phân hủy... này, theo đề nghị của Duclo, enzyme phân giải tinh bột được gọi là amylase [3] Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn [3] Trong đó, amylase từ vi sinh vật được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất nhờ những đặc điểm ưu vi t của chúng Những nghiên cứu về amylase vi sinh vật đặt nền móng cho vi c sản xuất các chế ... lập chủng vi khuẩn sinh bào tử có khả sinh amylase ngoại bào - Giai đoạn 2: Khảo sát khả sinh trưởng chủng vi khuẩn phân lập điều kiện nhiệt độ pH khác - Giai đoạn : Chọn lọc chủng có khả sinh amylase. .. sát sơ khả sinh amylase ngoại bào số chủng vi khuẩn 37 Hình Khảo sát phát triển chủng vi khuẩn môi trường có pH khác 37 Hình Khảo sát phát triển chủng vi khuẩn nhiệt... enzyme amylase ngoại bào vi khuẩn 31 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23 PHÂN LẬP VI KHUẨN SINH AMYLASE 35 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH AMYLASE CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN