Kinh nghiệm xây dựng phát triển PCR/real-time PCR số kỹ thuật sinh học phân tử khác nghiên cứu chẩn ñoán Từ yêu cầu thực tế phải tiếp cận y học ñại chẩn ñoán ñiều trị Cần giải pháp toàn diện chẩn ñoán sinh học phân tử bệnh viêm gan virus B viêm gan virus C mạn tính Bệnh viêm gan virus B viêm gan virus C mạn tính hậu tình trạng nhiễm virus viêm gan B (HBV=Hepatitis B virus) virus viêm gan C (HCV=hepatitis C virus) gây Bệnh nhân bị nhiễm HBV HCV qua ñường máu tiêm chích, truyền máu, nhổ răng, châm cứu, làm móng, hay thủ thuật xâm lấn dụng cụ bị nhiễm virus Ngoài ra, nhiễm trùng HBV HCV xãy qua ñường tình dục, mẹ truyền qua sinh nở Theo thông tin từ Tổ Chức Y Tế Thế Giới số nhà nghiên cứu nước, Việt Nam quốc gia ñứng hàng ñầu tần suất nhiễm HBV qua xét nghiệm phát kháng nguyên bề mặt virus (HBsAg) máu, với tỷ lệ người bình thường có HBsAg dương tính 10-30% Thường diễn tiến tự nhiên người bị nhiễm HBV ña số tự khỏi hệ thống miễn dịch tạo ñược kháng thể bảo vệ kháng thể ñặc hiệu HBsAg Chỉ có số ít, hệ thống miễn dịch thể họ nhận diện ñược kháng nguyên bề mặt virus kháng nguyên lạ ñể tạo ñược ñáp ứng miễn dịch mà người bị mang HBV thể lâu dài lúc xét nghiệm phát HBsAg dương tính Nếu tác nhân nguy gây tổn hại tế bào gan (như uống rượu, béo phì, gan nhiễm S
ñ 4: Hướng dẫn ñịnh xét nghiệm ñể ñiều trị theo dõi hiệu ñiều trị ñặc hiệu bệnh nhân bị bệnh viêm gan virus B mạn tính 146 mở, hay bị tác nhân lý hoá khác) HBV nhân thành virus không hoàn chỉnh (chỉ có vỏ capsid mà lõi DNA) tạo ñược số lượng giới hạn virus hoàn chỉnh, họ người lành mang HBV mà (carrier) không phát triển thành viêm gan mạn tính Tuy nhiên có nguy thương tổn tế bào gan xãy HBV phát triển nhiều tế bào gan, lượng virus hoàn chỉnh ñược phóng thích nhiều vào máu (≥105 copies/1ml máu) ñồng thời gây tổn hại tế bào gan ñể trở thành bệnh viêm gan mạn tính Nếu không kiểm soát ñược nhân HBV viêm gan mạn tính dẫn ñến hậu khó tránh khỏi xơ gan dẫn ñến ung thư gan hay ñi thẳng ñến ung thư gan Do vậy, trước người có xét nghiệm HBsAg dương tính nhà lâm sàng thiết phải cho ñịnh làm thử nghiệm xác ñịnh xem máu người nhiễm có mang HBV hoàn chỉnh hay không nghiệm PCR phát HBV-DNA, dương tính phải biết số lượng HBV hoàn chỉnh có 105 copies/1ml hay không xét nghiệm qPCR ñể ñịnh lượng HBV-DNA Nếu lượng HBV máu 105 không cần thiết phải ñiều trị HBV nhân giới hạn tế bào gan chưa gây tổn hại tế bào gan Nhưng lượng virus ≥105 cần phải xem xét gan có bị tổn thương chưa thông qua xét nghiệm men gan ALT Nếu lượng ALT vượt bình thường (1,5 hay tối ña lần bình thường, nam bình thường 33UI nữ bình thường 19IU) phải cho ñịnh ñiều trị thuốc kháng virus lamivudine, adefovir, entecavir, interferon hay sử dụng từ ban ñầu liệu pháp kết hợp lamivudine với adefovir, với entecavir, hay với interferon Nếu lượng ALT bình thường phải làm sinh thiết gan ñể làm xét nghiệm giải phẩu bệnh xem gan có bị thương tổn mô học không, hay không muốn làm sinh thiết gan làm fibroscan gan bệnh nhân giá trị fibroscan cho biết tình trạng tổn hại mô gan dù không xác sinh thiết gan Ngoài ra, cần thiết phải làm thêm thử nghiệm ñịnh lượng AFP (alpha foeto-protein) bệnh nhân cần có chứng mô học có tổn thương gan hay lượng AFP vượt giới hạn bình thường phải cho ñịnh ñiều trị bệnh nhân thuốc kháng virus Hiện nhà ñiều trị không ảo vọng trị ñược HBV khỏi thể bệnh nhân nhiễm HBV dễ dàng bị tái phát sau ngưng ñiều trị Lý yếu HBV tồn nhân tế bào gan dạng cccDNA (covalently closed circular 147 DNA) ñể làm nguồn gốc di truyền virus, dạng không bị tác ñộng thuốc kháng virus nucleosides analogs Tuy nhiên có nhiều chứng cho thấy không kiểm soát mà ñể lượng HBV hoàn chỉnh máu lên cao bệnh viêm gan mạn tính có nguy diễn tiến ñến suy gan bù, hay xơ gan tiến triển ung thư gan Do vậy, sau ñã bắt ñầu ñiều trị bệnh nhân bị viêm gan virus B mạn tính, nhà ñiều trị phải thường xuyên theo dõi hiệu ñiều trị ñặc hiệu mà họ ñã cho bệnh nhân cách phải ñịnh kỳ tháng cho bệnh nhân làm xét nghiệm qPCR ñịnh lượng HBV-DNA (nếu lượng HBV-DNA ñịnh lượng ñược) hay PCR ñịnh tính phát HBV-DNA (nếu HBV-DNA ngưỡng phát ñịnh lượng) cho ñến lượng HBV-DNA ngưỡng phát Quan ñiểm nhà ñiều trị phải liên tục trì liệu pháp kháng virus ñể khống chế lượng virus mức phát mà phải theo dõi tái xuất virus xét nghiệm PCR phát HBV-DNA máu bệnh nhân ñịnh kỳ tháng Nếu sau thời gian ñiều trị ñặc hiệu (thường tháng) mà lượng virus không giảm log (100 lần), hay không ñạt ñến ngưỡng 103/ml, hay trình ñiều trị, xét nghiệm HBV-DNA dương tính trở lại, bác sĩ ñiều trị phải nghĩ ñến khả virus kháng thuốc, ñặc biệt kháng lamivudine Lúc xét nghiệm sinh học phân tử mà bác sĩ nên ñịnh thực bệnh nhân xét nghiệm ñịnh genotype phát ñột biến kháng lamivudine, adefovir entecavir virus HBV bệnh nhân ñể tuỳ thuộc vào genotype ñột biến mà ñiều chỉnh liệu pháp kháng virus thích hợp Trước ñây, nhà lâm sàng thường ñánh giá hiệu ñiều trị ñặc hiệu qua xét nghiệm miễn dịch cho biết có dấu hiệu chuyển ñảo huyết bệnh nhân, S
ñ 5: Sơ ñồ hướng dẫn ñịnh theo dõi hiệu ñiều trị ñặc hiệu bệnh nhân viêm gan virus C mạn tính 148 nghĩa HBeAg (kháng nguyên tiết HBV - thông số cho biết có tình trạng virus nhân bản) trở nên âm tính xuất kháng thể kháng HBe Tuy nhiên HBV có ñột biến precore làm cho virus tạo ñược kháng nguyên HBe mà có ñược kháng thể kháng HBe nên muốn xác ñịnh ñược chắn có chuyển ñảo huyết thật hay không nhà lâm sàng phải ñịnh xét nghiệm phát ñột biến precore bệnh nhân HBeAg [-], có kháng thể kháng HBeAg, mà HBVDNA [+] Ngoài ra, nghiên cứu gần ñây cho biết ñột biến precore (vị trí 1896) ñặc biệt core-promoter (vị trí 1762/64) có liên quan ñến diễn tiến viêm gan mạn tính, xơ gan, ung thư gan bệnh nhân Do xét nghiệm sinh học phân tử phát ñột biến precore yêu cầu thực tiến từ nhà ñiều trị Sơ tóm tắt qui trình cho ñịnh xét nghiệm ñể ñiều trị theo dõi ñiều trị viêm gan B mạn tính Ngoài viêm gan B, nhiễm viêm gan virus C vấn ñề cần ñược quan tâm nay, ñặc biệt Việt Nam Theo ghi nhận tình hình nhiễm viêm gan C tỷ lệ người bình thường Việt Nam nhiễm virus viêm gan C khoảng 2-10%, xem thuộc nhóm quốc gia có tỷ lệ nhiễm virus viêm gan C cao thứ nhì giới Khác với nhiễm viêm gan B với ña số trường hợp người nhiễm tạo ñược kháng thể bảo vệ loại trừ ñược virus số trở thành người lành mang trùng; có ñến 85% người nhiễm viêm gan virus C miễn dịch bảo vệ, dù có xuất kháng thể ñặc hiệu (anti-HCV [+]), bị diễn tiến ñến viêm gan mạn tính ñến xơ gan với 20% số ñó có nguy diễn tiến ñến ung thư gan Do mà dù tỷ lệ người nhiễm viêm gan C Việt Nam thấp nhiễm viêm gan B tình trạng bệnh tật nhiễm virus viêm gan C mang lại cao, không thua mà chí viêm gan B Nguy hiểm bệnh viêm gan C mạn tính lại bệnh mà ánh sáng y học ñại lại bệnh chữa khỏi ñược hoàn toàn với xác suất thành công ñến 60% Tuy nhiên, ñể cho ñược ñịnh ñiều trị ñặc hiệu viêm gan C mạn tính interferon α phối hợp với ribavirin phát ñồ chuẩn nay, bác sĩ cần phải xác ñịnh bệnh nhân ñang mang virus viêm gan C máu xét nghiệm ñịnh tính HCV-RNA xét nghiệm anti-HCV xét nghiệm sàng lọc cho truyền máu xét nghiệm chẩn ñoán lâm sàng, người có kết anti-HCV [+] không mang 149 virus viêm gan C mà kết tình trạng nhiễm mầm bệnh trước ñó ñã khỏi Sau xác ñịnh ñược người bệnh dương tính HCV-RNA, trước cho ñịnh ñiều trị bác sĩ cần phải làm thêm hai xét nghiệm ñịnh lượng HCV-RNA ñịnh genotype virus Lý bác sĩ cần phải ñánh giá hiệu ñiều trị mà ñã cho bệnh nhân sau tháng sau tháng ñiều trị phương pháp ñánh giá ñịnh lượng lại HCV-RNA Nếu kết ñịnh lượng cho thấy virus biến sau tháng ñiều trị ñây ñáp ứng siêu vi nhanh với dự hậu thành công ñiều trị tốt Nếu lượng virus giảm 100 lần (trên hay log) sau tháng bắt ñầu ñiều trị ñây ñáp ứng siêu vi sớm ñánh giá ñiều trị ñã cho hiệu tiếp tục Nếu lượng virus không giảm log phương pháp ñiều trị ñã cho bệnh nhân không hiệu cần phải cân nhắc ñể ñiều chỉnh (dùng loại interferon α khác có dược ñộng dược lực tốt hơn, bắt buộc bệnh nhân phải tuân thủ ) Để ñịnh thời gian ñiều trị bác sĩ cần phải biết genotype HCV bệnh nhân, genotype cần phải trì thời gian ñiều trị 48 tuần hay hơn, thuộc genotype khác thời gian ñiều trị ngắn 24 tuần Sau hoàn tất thời gian cần phải ñiều trị bệnh nhân, trước ñịnh ngưng ñiều trị, bác sĩ cần phải xác ñịnh xem bệnh nhân ñã HCV-RNA chưa xét nghiệm ñịnh tính HCV-RNA ngưng ñiều trị HCV-RNA hoàn toàn âm tính Sau ñã ngưng ñiều trị bệnh nhân ñã virus, bác sĩ phải khuyến cáo bệnh nhân làm xét nghiệm ñịnh ñính HCV-RNA tháng lần ñể theo dõi xem bệnh nhân có bị tái phát không Bất lúc HCV-RNA dương tính lại ñó dấu hiệu tái phát bác sĩ phải xem xét ñiều trị lại cho bệnh nhân phải theo thực lại qui trình xét nghiệm Sơ ñồ tóm tắt qui trình nêu Cần xét nghiệm kịp thời nhạy cảm ñể chẩn ñoán phát tác nhân vi sinh gây bệnh mà phương tiên vi sinh hay miễn dịch không hữu hiệu Bên cạnh bệnh viêm gan mạn tính virus B virus C, y học Việt Nam phải ñối phó với bệnh nhiễm trùng khác mà vấn ñề phát tác nhân vi sinh gây bệnh cần thiết phải có phương tiện xét nghiệm nhạy cảm hơn, kịp thời hơn, an toàn Theo ñánh giá tổ chức y tế giới, Việt Nam 22 nước mang gánh nặng nhiễm lao cao giới Ngoài với tình trạng gia tăng tỷ lệ 150 nhiễm HIV/AIDS Việt Nam (có thể 300.000 theo dự ñoán Bộ Y Tế) nguy phải ñối phó với tình trạng nhiễm lao tăng cao cộng ñồng Do mà vấn ñề nâng cao lực phòng thí nghiệm lâm sàng xét nghiệm phát lao vấn ñề mà y học Việt Nam phải ñặt với phương pháp nhuộm tìm trực khuẩn kháng acid (AFB), ñộ nhạy phát ñạt 64% lao phổi, 27% lao phổi, 9% lao màng não; nhuộm kháng acid bị phụ thuộc nhiều vào kỹ người ñọc lame kết xác ñịnh ñược bệnh nhân có thật nhiễm lao hay không có nhiều trực khuẩn kháng acid khác vi khuẩn lao diện bệnh phẩm Với phương pháp nuôi cấy ñộ nhạy cao 77% lao phổi, 67% lao phổi 39% lao màng não thời gian ñể có ñược kết trước tuần sử dụng phương pháp cấy nhanh với môi trường MGITT hay phải tháng sử dụng phương pháp cấy với môi trường Lowenstein Jensen Chính nên bệnh viện hay phòng khám, có nhiều trường hợp bệnh nhân có dấu hiệu lâm sàng X-quang nghi ngờ lao phổi, hầu hết trường hợp lâm sàng chẩn ñoán nghi ngờ lao phổi hay lao màng não mà kết xét nghiệm bác sĩ nhận ñược thường soi không thấy, cấy không Thực tế ñã ñòi hỏi nhà lâm sàng phải yêu cầu xét nghiệm PCR phát lao bệnh phẩm khác theo nhiều nghiên cứu giới, PCR ñã cải thiện ñáng kể ñộ nhạy phát lao không lao phổi mà lao phổi lao màng não Hơn kết PCR cho phép xác ñịnh nhiễm lao mà không cần phải làm thêm xét nghiệm vi sinh xác ñịnh ñối với phương pháp nhuộm kháng acid hay nuôi cấy, với PCR người làm xét nghiệm phát ñoạn DNA ñích ñặc hiệu cho vi khuẩn lao cho mycobacteria khác lao Một bệnh nhiễm khác mà thực tế ñòi hỏi phải triển khai xét nghiệm khuếch ñại nucleic acid sở kỹ thuật PCR ñể phát tác nhân gây bệnh, ñó bệnh sốt Dengue gây sốt xuất huyết Dĩ nhiên việc chẩn ñoán lâm sàng bệnh nhân có phải ñang bị sốt Dengue gây sốt xuất huyết hay không thật không khó bệnh nhân ñã xuất bất thường số lượng tiểu cầu (giảm tiểu cầu) dung tích hồng cầu (tăng dung tích hồng cầu) hay ñã có triệu chứng ñi vào shock Tuy nhiên 151 ñể phát ñược bệnh nhân có phải sốt Dengue hay sốt xuất huyết Dengue ngày ñầu bệnh thật vấn ñề nan giải giai ñoạn sớm mặt lâm sàng hay cận lâm sàng, bệnh nhân biểu ñặc hiệu sốt siêu vi Thử nghiệm miễn dịch học phát kháng thể ñặc hiệu Dengue, chí kháng thể IgM, bắt ñầu dương tính vào ngày thứ hay bệnh lúc kết xét nghiệm không hữu dụng lâm sàng biểu lâm sàng sốt Dengue hay sốt xuất huyết Dengue ñã rõ Vì chẩn ñoán xác ñịnh ñược sốt Dengue hay sốt xuất huyết Dengue ngày ñầu bệnh nên có hai tình huống: (1) Hoặc bệnh nhân không ñược theo dõi ñể ñiều trị kịp thời vào ñến bệnh viện ñã vào bệnh cảnh shock nặng bác sĩ phải vất vả cứu ñược bệnh nhân hay trở tay không kịp; (2) Hoặc mùa dịch sốt xuất huyết bệnh viện bị tràn ngập bệnh nhân lâm sàng nghi ngờ sốt xuất huyết mà chưa có cớ chứng minh bệnh nhân ñang bị sốt Dengue hay sốt xuất huyết Dengue Do thực tế ñòi hỏi phòng thí nghiệm lâm sàng phải có phương tiện ñủ sức ñể chẩn ñoán phát Dengue sớm ngày ñầu bệnh, phương tiện khác thử nghiệm RTPCR phát RNA virus Dengue máu bệnh nhân nhờ lượng virus xuất cao máu ngày ñầu bệnh, chí ngày ñầu tiên bệnh Trong sản phụ khoa nay, nhà lâm sàng nghiên cứu y học cần thiết phải có kết phát xác ñịnh ñược genotype HPV từ quệt hay sinh thiết cổ tử cung ñể phát sớm nguy sinh ung thư cổ tử cung phụ nữ khoa học ñã chứng minh ñược tác nhân gây ung thư cổ tử cung phụ nữ số genotype HPV nguy cao (như 16, 18 ) Xét nghiệm thực ñược phương pháp tế bào học hay mô học mà phải ñược thực kỹ thuật sinh học phân tử khuếch ñại ñoạn DNA ñặc hiệu vùng gene L1 virus sau ñó xác ñịnh trình tự ñặc hiệu genotype virus, ñó kỹ thuật PCR theo sau lai phân tử Hiện ngành y tế phải ñối phó thêm với bệnh có nguy gây dịch cao cúm gà H5N1, biện pháp ñể ñối phó với dịch bệnh người phải phát sớm tác nhân H5N1 mẫu 152 bệnh lấy từ người nghi ngờ nhiễm bệnh ñể bệnh nhân sớm ñược ñiều trị ñặc hiệu sớm phát ñược ổ dịch lây cho người ñể sớm cách ly ñối phó Tuy nhiên phát H5N1, xây dựng phương pháp virus học nuôi cấy phòng thí nghiệm lâm sàng ñiều không hữu dụng lâm sàng kết nuôi cấy có nhanh ñược, ñồng thời không an toàn khó có phòng thí nghiệm lâm sàng ñạt ñược cấp ñộ an toàn sinh học Do xét nghiệm thích hợp hữu dụng ñể thực ñược phòng thí nghiệm lâm sàng khác xét nghiệm RT-PCR phát H5N1 xét nghiệm ñòi hỏi phải thực phòng thí nghiệm có trang bị an toàn sinh học cấp kết xét nghiệm không nhạy cảm mà ñến tay lâm sàng vòng không sau lấy mẫu Để ñối phó với ñại dịch HIV/AIDS, việc phổ biến kiến thức tránh lây nhiễm hay tránh hành vi có nguy cao bị lây nhiễm cộng ñồng, vấn ñề ñiều trị ñặc hiệu có hiệu cho bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS vấn ñề mà nhà quản lý y tế cần phải thực có ñược ñiều trị ñặc hiệu hiệu bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS trở lại với cộng ñồng giảm thiểu nguy lây nhiễm nhờ lượng virus máu dịch thể bệnh nhân bị khống chế ngưỡng phát Để ñiều trị ñược cách hiệu cho bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS, nhà y học cần phải có phương tiện xét nghiệm ñịnh lượng ñược virus máu bệnh nhân ñể thay ñổi phát ñồ ñiều trị lượng virus tăng lên hay xuất trở lại trình ñiều trị Do xét nghiệm ñịnh lượng virus HIV xét nghiệm cần thiết phải triển khai kỹ thuật dễ tiếp cận ñể thực xét nghiệm kỹ thuật real-time PCR Ngoài việc theo dõi hiệu ñiều trị ñặc hiệu, xét nghiệm phát ñịnh lượng HIV có giá trị chẩn ñoán cho trẻ sơ sinh ñể phát cháu có bị nhiễm bệnh từ mẹ truyền qua không, yêu cầu mà phương pháp miễn dịch phát kháng thể ñặc hiệu HIV ñáp ứng ñược trẻ có kết HIV [+] qua miễn dịch kháng thể ñặc hiệu HIV phát máu trẻ kháng thể từ mẹ truyền qua thời kỳ bào thai Với tiến ghép tạng Việt Nam, xét nghiệm phát CMV xét nghiệm cần thiết phải thực người cho quan ñể tránh nguy người 153 nhận bị nhiễm bùng phát bệnh ñang phải nhận liệu pháp ức chế miễn dịch sau ghép Nếu dựa vào xét nghiệm phát kháng thể ñặc hiệu CMV huyết người cho tạng kết chắn không ñủ ñặc hiệu ñể nói lên ñược người cho mang CMV truyền tác nhân gây bệnh sang người nhận kháng thể tồn lâu sau bệnh nhên khỏi bệnh Do cần phải có xét nghiệm phát trực tiếp tác nhân CMV bạch cầu máu người cho, xét nghiệm ñáp ứng ñược yêu cầu xét nghiệm PCR/real-time phát hiện/ñịnh lượng CMV-DNA Ngoài ra, thực tế y học ñại mà ñang tiếp cận ñòi hỏi nhà lâm sàng ñược phục vụ yêu cầu xét nghiệm phát và/hay ñịnh lượng nhiều tác nhân gây bệnh khác phương pháp khuếch ñại nucleic acid sở kỹ thuật PCR real-time PCR Ví dụ ñể phát nguyên muộn phụ nữ, nhà lâm sàng cần phải có xét nghiệm PCR phát C trachomatis N gonorrhoeae mẫu quệt cổ tử cung nước tiểu Để phát tác nhân viêm não màng não virus, xét nghiệm PCR phát HSV hay RT-PCR phát Enterovirus 71 dịch não tuỷ cần ñược triển khai Để phát H pylori mẫu sinh tiết vết loét dày tá tràng xét nghiệm PCR phát tác nhân xét nghiệm thiếu ñược Hay giám sát nhiễm khuẩn bệnh viện, xét nghiệm PCR phát S aureus kháng methicillin (MRSA) từ tay quệt mũi trước nhân viên y tế người chăm sóc bệnh nhân xét nghiệm cần thiết phải ñược thực ñộ nhạy cảm cao qui trình thực ñơn giản kết có ñược nhanh nhiều so với xét nghiệm vi sinh truyền thống Đế thực tế triển khai kỹ thuật PCR, real-time PCR Các rào c n Vậy thực tế ñã ñòi hỏi nhà khoa học, ñặc biệt nhà y học phải nhanh chóng phát triển ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử ñại, PCR real-time PCR vào chẩn ñoán hổ trợ cho theo dõi ñiều trị bệnh nhân Việt Nam Tuy nhiên cho ñến nhiều nhà khoa học quản lý y tế nước ngần ngại với khả Các lý họ cho là: (1) thử nghiệm khó thực ñược cách chuẩn mực phòng thí nghiệm lâm sàng; (2) giá 154 nghiệm cao vượt khả người bệnh Chúng ta thử phân tích có ñúng không? Th nghiệm PCR real-time PCR có th t khó thực ñ c cách chuẩn mực phòng thí nghiệm lâm sàng? PCR real-time PCR kỹ thuật nhân DNA ống nghiệm dựa vào chu kỳ nhiệt ñộ nhờ nguyên liệu dNTP, enzyme polymerase chịu nhiệt, cặp mồi ñoạn oligonucleotide ñơn dài khoảng 20-25 base có trình tự bổ sung ñặc hiệu với hai ñầu ñoạn DNA ñích cần nhân Nhờ chu kỳ nhiệt mà ñoạn DNA ñích ñược nhân theo cấp số nhân ñể sau 30 ñến 40 chu kỳ, ñoạn DNA ñích ñược nhân thành hàng tỷ dễ dàng ñược phát Với phương pháp PCR (ngày ñược gọi PCR kinh ñiển), kết PCR ñược phát dựa vào ñiện di ñể xác ñịnh kích thước và/hay dựa vào lai với dò ñặc hiệu ñể xác ñịnh trình tự ñặc hiệu sản phẩm khuếch ñại xem có trùng khớp với kích thước và/hay trình tự ñoạn DNA ñích không Với phương pháp real-time PCR kết PCR ñược ñọc trình chạy PCR mà không cần phải thực giai ñoạn phân tích sau PCR nhờ khả phát huỳnh quang ống phản ứng trình chạy PCR có sản phẩm khuếch ñại xuất PCR mix Huỳnh quang sớm xuất số lượng ñoạn DNA ñích ban ñầu mẫu thử cho vào PCR mix nhiều, nhờ nguyên lý mà real-time PCR không ñược dùng ñể phát mà ñể ñịnh lượng ñược DNA ñích ban ñầu có mẫu thử Nhờ khuếch ñại phát nên PCR real-time PCR ñạt ñược ñộ nhạy nói cho ñến chưa có kỹ thuật so sánh nổi: Giới hạn thấp phát ñược phân tử Chính vậy, PCR real-time PCR công cụ hữu dụng phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh Tuy nhiên câu hỏi ñược nhiều người ñặt liệu PCR real-time PCR có ñặc hiệu không ñạt ñược ñộ nhạy cao vậy? Vì theo lý luận thống kê thông thường xét nghiệm ñạt ñộ nhạy cao ñộ ñặc hiệu thấp xuống Để trả lời ñược câu hỏi này, phải so sánh ñộ ñặc hiệu PCR so với nuôi cấy phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh Nuôi cấy xét nghiệm ñặc hiệu ñể phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh có nuôi cấy xác ñịnh ñược diện tác nhân vi sinh vật gây bệnh có mặt mẫu thử Qua nhìn phân tử thấy nuôi 155 cấy chẳng qua phân lập khuếch ñại gen vi sinh vật gây bệnh từ thành hàng tỷ sau ñó xác ñịnh gen ñược khuếch ñại vi sinh vật dựa vào kiểu hình sinh vật hoá học mà gen ñó qui ñịnh Xét nghiệm PCR realtime PCR phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh không khác nuôi cấy, nuôi cấy gen mà ñoạn gen ñặc hiệu vi sinh vật gây bệnh (không phải môi trường phân lập nuôi cấy vi sinh phức tạp khác mà ñơn giản ống phản ứng chứa PCR mix) thành hàng tỷ sau ñó ñịnh danh xem có ñúng vi sinh vật muốn tìm không dựa vào kích thước và/hay trình tự nucleotide Do ñó, ñã thừa nhận nuôi cấy ñặc hiệu phải thừa nhận PCR ñặc hiệu chẳng khác nuôi cấy mà lại nhạy cảm nuôi cấy nhiều nuôi cấy bị phụ thuộc nhiều khâu lấy mẫu, chuyên chở mẫu, thời gian trì hoãn từ lấy mẫu ñến bắt ñầu tiến hành nuôi cấy, ñặc biệt phải chọn lựa cho ñúng môi trường thích hợp cho khâu phân lập; mà yếu tố lại thường ñược thực cách chuẩn mực phòng thí nghiệm lâm sàng quốc gia có thu nhập thấp Vậy lại ngần ngại phát triển ứng dụng xét nghiệm PCR real-time phòng thí nghiệm lâm sàng ñể phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh cho khó thực ñược xét nghiệm cách chuẩn mực? Trong xét nghiệm PCR real-time PCR lại dễ thực chuẩn mực xét nghiệm vi sinh nhiều vì: (1) Khi không làm xét nghiệm không cần phải ñược giữ môi trường chuyên chở thời gian có hạn vi sinh, bệnh phẩm xét nghiệm PCR giữ ñiều kiện lạnh 2-8oC hay giữ ñông thời gian chuyên chở ñến phòng thí nghiệm, giữ -70oC mẫu thử nguyên giá trị ñể làm xét nghiệm PCR sau nhiều năm (2) Nếu thuốc thử ñều ñược cung cấp hay ñược pha chế dạng kit bước làm xét nghiệm PCR ñơn giản dễ chuẩn hoá: Trước hết tách chiết nucleic acid từ mẫu thử kit tách chiết thích hợp; sau ñó cho tách chiết vào ống phản ứng chứa PCR mix thích hợp ñể thực chu kỳ nhiệt cho khuếch ñại nucleic acid ñích; cuối phát sản phẩm khuếch ñại nucleic acid ñích (nếu real-time PCR bước nầy ñược thực trình chạy PCR) Trong ñó, trình làm xét nghiệm vi sinh phức tạp 156 khó chuẩn hóa nhiều ñòi hỏi người làm xét nghiệm phải có ñủ kiến thức ñể chuẩn bị, lựa chọn qui trình với thuốc thử môi trường nuôi cấy thích hợp cho vi sinh vật ñích, ñặc biệt phải có kiến thức kinh nghiệm ñể bắt ñược vi sinh vật ñích diện bệnh phẩm PCR real-time PCR có nhiều ưu ñiểm vượt trội khác so với xét nghiệm vi sinh như: (1) Kết chung ñến tay bác sĩ lâm sàng nhanh xét nghiệm vi sinh, không kể từ bắt ñầu làm xét nghiệm (2) Phát ñược tác nhân vi sinh vật gây bệnh mà phòng thí nghiệm lâm sàng khả phát với xét nghiệm vi sinh hay miễn dịch truyền thống tác nhân virus (HCV, HBV, HPV ), tác nhân vi sinh triển khai nuôi cấy ñược phòng thí nghiệm lâm sàng khả gây dịch cao (H5N1) hay khó nuôi cấy (C trachomatis, L pneumophila), hay có mặt bệnh phẩm (M tuberculosis lao phổi, tác nhân viêm màng não mủ cụt ñầu ), tác nhân nuôi cấy ñược thời gian có kết chung lâu (M tuberculosis) Ngoài ra, mối lo ngại mà nhiều người quan tâm, ñó vấn ñề ngoại nhiễm sản phẩm khuếch ñại, dễ xãy phòng xét nghiệm lâm sàng nguy tích tụ dễ dàng dẫn ñến ngoại nhiễm vào thuốc thử bệnh phẩm qua dụng cụ qua tay người làm xét nghiệm Ngày nay, nhờ sử dụng hệ thống chống ngoại nhiễm sản phẩm khuếch ñại men UNG dUTP cho vào PCR mix (ñể làm cho sản phẩm khuếch ñại có nhiều vị trí T bị thay U nhờ mà bị khác biệt với DNA nguyên thuỷ ñể bị men UNG phá huỷ trước ñi vào trình khuếch ñại) mà thử nghiệm PCR real-time PCR dễ dàng triển khai thực ñược phòng thí nghiệm lâm sàng cần bố trí vùng làm việc tách biệt, không cần phải phòng tách biệt trước ñây nghiệm PCR real-time PCR có th t t ti n không? Trang bị ñắt tiền cho phòng thí nghiệm lâm sàng làm ñược xét nghiệm PCR real-time PCR máy PCR máy real-time PCR Tuy nhiên nhờ công nghệ ngày tiến ngày có nhiều công ty cung cấp máy nên thiết bị ngày có nhiều tính hoạt ñộng hữu hiệu mà giá thành lại ngày rẽ hơn, không vượt khả trang bị nhiều phòng thí 157 nghiệm lâm sàng Nếu tính khấu hao thiết bị giá thành xét nghiệm tháng khoảng 800USD với thời gian sử dụng thiết bị năm Vậy xét nghiệm PCR real-time PCR quốc gia tiên tiến lại ñắt, bệnh nhân phải trả tiền cho xét nghiệm không 100USD? Lý chủ yếu phòng thí nghiệm lâm sàng nơi thường phải mua kit xét nghiệm PCR real-time PCR từ công ty sản xuất kit chẩn ñoán (như Roche Diagnostic) với giá thành ñắt ñể ñảm bảo xét nghiệm ñược thực cách chuẩn mực Tại quốc gia thu nhập thấp Việt Nam chúng ta, làm chắn xét nghiệm PCR real-time PCR chẳng thể áp dụng ñược dù thực tế cần phải có xét nghiệm Chúng ta biết PCR real-time PCR kỹ thuật hoàn toàn mở cho phép nhà nghiên cứu tiếp cận ñể tự pha thuốc thử thực xét nghiệm chịu trách nhiệm kết xét nghiệm mà thực (thường gọi homebrew) Tuy nhiên làm chắn ñối phó với vấn ñề chất lượng xét nghiệm PCR real-time PCR khác biệt phòng thí nghiệm lâm sàng với Do giải pháp hay ñó phải có kit PCR realtime PCR sản xuất nước cung cấp ñến phòng thí nghiệm lâm sàng Các kit không ñạt ñược ñộ nhạy ñộ ñặc hiệu cao, mà phải có ñầy ñủ chuẩn mực ñể người làm xét nghiệm kiểm soát ñược sơ sót xãy trình làm xét nghiệm Nhờ vậy, chất lượng xét nghiệm PCR real-time PCR ñược chuẩn mực, ñạt mức cao cách ñồng ñều phòng thí nghiệm lâm sàng, ñồng thời giá thành xét nghiệm hoàn toàn chấp nhận ực tế triển khai PCR real-time PCR Xuất phát từ nhận ñịnh trên, thời gian qua ñã liên tục phát triển hoàn thiện kit PCR real-time PCR ñể ñưa vào ứng dụng nhiều phòng thí nghiệm lâm sàng có trang bị PCR Việt Nam Như ñã nói trên, ñể ñảm bảo ñược chất lượng cao ñồng ñều xét nghiệm PCR real-time PCR thực ñược phòng thí nghiệm lâm sàng áp dụng cho chẩn ñoán, thử nghiệm kit cung cấp ñể làm thử nghiệm phải luôn có ñầy ñủ chuẩn mực sau: (1) Kit khuếch ñại ñạt ñược ñộ nhạy cao có chứng ñể xác ñịnh ñộ nhạy thông qua chứng [+] ñược cung cấp với số copies xác ñịnh ñể người sử dụng 158 kiểm tra ñược (2) Có chứng nội sử dụng chung mồi với nucleic acid ñích ñược cung cấp với hàm lượng copies tối thiểu ñể người thực thí nghiệm cho vào mẫu chứng âm [-] mẫu thật thật âm tính thực xét nghiệm với mẫu thử nhờ mà kiểm tra ñược trình xét nghiệm có bị ngoại nhiễm không suốt trình thao tác xét nghiệm chứng minh ñược ñộ nhạy kit tách chiết kit khuếch ñại (3) Người thực thí nghiệm cho chứng nội vào PCR mix với tách chiết mẫu thử ñể xác ñịnh ñược mẫu âm tính âm tính thật mà âm tính PCR bị ức chế (4) Có hệ thống chống ngoại nhiễm dUTP UNG ñược pha chung vào PCR mix ñể sản phẩm khuếch ñại bị phá huỷ không cho tham gia vào trình khuếch ñại (5) Trong PCR ñịnh lượng, chuẩn trên, ñể ñảm bảo xét nghiệm ñịnh lượng, mẫu chuẩn biết rõ hàm lượng copies DNA ñích ñược cung cấp dạng bền vững với yêu cầu người làm xét nghiệm phải tự cho vào PCR mix nhằm ñánh giá ñược thao tác pipetting làm ñịnh lượng xây dựng ñược ñường chuẩn lần làm xét nhiệm ñể tạo xở ñịnh lượnh xác Cho ñến nay, ñã triển khai thực xét nghiệm PCR realtime PCR sản xuất ñược kit tương ứng ñạt ñược tất chuẩn mực trên, ñó là: (1) Xét nghiệm kit PCR phát HBV-DNA (hình ) dựa khuếch ñại ñích 259bp gen S, ñạt ñộ nhạy 10 copies/ml huyết Có chứng âm huyết tương người bình thường, chứng dương 100 copies/ml plasmid chèn ñúng ñoạn DNA ñích ñể chứng minh ñược ñộ nhạy phản ứng ñúng khai báo Có chứng nội plasmid chèn DNA tái tổ hợp sử dụng mồi cho Hình 69: K❀t qu✺ xét nghi✴m PCR phát hi✴n HBV-DN❆ ñược NK thực với HBV-PCR kit sản phẩm khuếch ñại khác biệt DNA ñích với kích thước 195bp, ñược cung cấp lượng tối thiểu ñể kiểm soát ñộ nhạy tách chiết, khuếch ñại kiểm tra ngoại nhiễm, xác ñịnh mẫu có bị âm tính ức chế không 159 (2) Xét nghiệm kit RT-PCR phát HCV-RNA (hình 70) dựa khuếch ñại ñoạn 240bp vùng 5’NC, ñạt ñộ nhạy 50 copies/ml huyết mà người sử dụng kiểm chứng nhờ chứng [+] chứa 200copies/ml plasmid chèn DNA ñích Có chứng nội RNA phiên mã từ plasmid chèn DNA tái tổ hợp kích thước 195bp khác biệt với DNA ñích sử dụng Hình 70: K t qu✁ xét nghi✂m RT-PCR phát hi✂n HCV-RN✄ ñược NK thực với HCV-RTPCR kit mồi Chứng nội ñược cung cấp nồng ñộ tối thiểu ñể người làm thí nghiệm cho vào với mẫu thử ñể ñược tách chiết RNA với mẫu thử nhờ kiểm tra ñược hiệu tách chiết RNA mẫu thử phát ñược ức chế mẫu thử kết âm tính Chứng âm mẫu huyết thật âm tính ñược cung cấp kiểm tra nguy ngoại nhiễm thao tác xét nghiệm (3) Xét nghiệm kit PCR phát MTB-DNA (hình 71) dùng chẩn ñoán lao dựa khuếch ñại ñoạn DNA ñích 249bp ñoạn chèn IS6110 diện từ 16 ñến 30 copies genome vi khuẩn M tuberculosis, nhờ ñộ nhạy xét nghiệm ñạt ñến mức phát 1fg (1/10 genome vi khuẩn) thể tích mẫu thử cho vào ống phản ứng Cũng xét nghiệm PCR khác, Hình 71: Kết xét nghiệm PCR phát MTB-DN✄ ñược thực NK với MTB-PCR kit có chứng âm huyết tương người bình thường, có chứng dương chứa 100 copies/ml plasmid chèn ñúng ñoạn DNA ñích nhờ người làm xét nghiệm kiểm chứng ñược ñược ñộ nhạy PCR mix Có chứng nội plasmid chèn DNA tái tổ hợp sử dụng mồi cho sản phẩm khuếch ñại khác biệt DNA ñích với kích thước 195bp ñược cung cấp lượng tối thiểu ñể kiểm tra ñược hiệu tách chiết DNA kít tách chiết DNA, 160 chứng minh mẫu âm tính không bị ức chế, chứng minh ñộ nhạy PCR mix (4) Xét nghiệm kit RT-PCR phát ñịnh type virus Dengue (hình 72) hay sốt Dengue sốt xuất huyết Dengue Xét nghiệm kit chứa ñầy ñủ chứng dương, chứng nội ñạt chuẩn mực xét nghiệm PCR dùng chẩn ñoán xét nghiệm kit mà phát triển Đây xét nghiệm kit RT-PCR có khả vừa phát vừa ñịnh ñược type virus Dengue qua vòng PCR ña mồi mà kết ñạt Hình 72: Kết xét nghiệm RT-PCR phát ñịnh type virus Dengue gây sốt Dengue sốt xuất huyết Dengue ñược nhạy phương pháp dựa qui trình kinh ñiển Lanciotti cần phải qua hai vòng PCR với vòng làm tổ bên vòng ñịnh ñược type virus Áp dụng thực tế lâm sàng, xét nghiệm kít ñã chứng tỏ có khả phát ñịnh type Dengue sớm, ngày ñầu bệnh, trước có dấu hiệu giảm tiểu cầu (5) Xét nghiệm kit PCR-ELISA phát ñịnh type HPV (hình 73) mãnh sinh thiết hay quệt cổ tử cung Đây xét nghiệm kit phát triển dựa nguyên tắc sử dụng mồi ñặc hiệu gen L1 virus ñể khuếch ñại ñoạn DNA dài 450bp bị ñánh dấu digoxygenine nhờ sử dụng PCR mix có thêm dig-dUTP Hình 73: Nguyên tắc xét nghiệm kit ñịnh type HPV NK HPV-PCR-ELIS☎ phát Sau ñó ñịnh genotype HPV cách lai sản phẩm khuếch ñại giếng ELISA có dò ñặc hiệu 161 genotype gắn giếng qua nối hoá học streptavidine-biotin (streptavidine phủ giếng nối với dò ñặc hiệu ñã gắng biotin ñầu 5’) Sản phẩm lai “probe-sản phẩm khuếch ñại” ñược phát cộng hợp kháng thể ñơn dòng ñặc hiệu digoxygenine ñánh dấu men peroxidase tá chất TMB Xét nghiệm kit PCRELISA có khả phát sau ñó ñịnh ñược genotype 10 genotype thường gặp HPV là: 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 58 Hiện xét nghiệm kit ñược bệnh viện Phụ Sản Từ Dũ sử dụng thành xét nghiệm dùng tầm soát sàng lọc ung thư sớm cổ tư cung phụ nữ (6) Các xét nghiệm kit PCR ñể phát tác nhân vi sinh vật gây bệnh khác PCR phát HSV, CMV, multiplex PCR phát ñồng thời N gonorrhoeae C trachomatis, L monocytogenes, nonstop nested PCR phát H5 Tất ñều ñạt chuẩn mực PCR dùng chẩn ñoán (hình ) (7) Xét nghiệm kit realtime PCR phát ñịnh lượng HBV-DNA huyết bệnh nhân nhiễm HBV dựa PCR khuếch ñại ñoạn ñặc hiệu dài khỏang 190bp từ gene polymerase HBV-DNA Xét nghiệm kit ñạt ñộ nhạy 10 copies/ml huyết Có chứng nội plasmid chèn DNA tái tổ hợp sử dụng mồi cho sản phẩm khuếch ñại có trình tự khác biệt DNA ñích nhờ ñược phát với dò NK Hình 74: Kết xét nghiệm PCR với kit HSV-PCR NK phát Herpes simplex virus (trên), CMV-PCR phát cytomegalo virus (giữa), NKNGRCHLmultiplex PCR phát N gonorrhoeae C trachomatis (dưới) taqman gắn màu huỳnh quang TexasRed, Hex, hay Joe khác biệt với dò taqman gắn màu FAM phát sản phẩm khuếch ñại DNA ñích Chứng nội ñược cung cấp lượng tối thiểu ñể cho vào PCR mix với tách chiết mẫu thử nhờ ñó kiểm tra ñược ức chế có 162 mẫu âm tính Có chứng âm huyết tương người bình thường, chứng dương chứa 100 copies/ml plasmid chèn ñúng ñoạn DNA ñích nhờ chứng minh ñược ñộ nhạy phản ứng ñúng khai báo Các nồng ñộ DNA ñích chuẩn ñược cung cấp dạng bền vững nhờ mà ñường chuẩn ñược xây dựng ñạt R≥0.990 PCR efficiency ñạt 90-105% (8) Xét nghiệm kit RT real-time PCR phát ñịnh lượng HCV-RNA huyết bệnh nhân nhiễm HCV dựa PCR khuếch ñại ñoạn ñặc hiệu vùng 5’-NC genome HCV Xét nghiệm kit ñạt ñộ nhạy 50 copies/ml huyết Có chứng nội RNA phiên mã từ plasmid chèn DNA tái tổ hợp sử dụng mồi cho sản phẩm khuếch ñại có trình tự khác biệt cDNA ñích nhờ ñược phát phân biệt với sản phẩm khuếch ñại từ DNA ñích với nguyên tắc kit real-time PCR phát HBV Chứng nội ñược cung cấp lượng tối thiểu ñể cho vào với mẫu thử nhờ ñó kiểm tra ñược hiệu tách chiết RNA phát ñược ức chế Chứng âm huyết tương người bình thường, có chứng dương chứa 100 copies/ml plasmid chèn ñúng ñoạn DNA ñích nhờ chứng minh ñược ñộ nhạy phản ứng ñúng khai báo Các nồng ñộ DNA ñích chuẩn ñược cung cấp dạng A bền vững nhờ mà ñường chuẩn ñược xây dựng ñạt R≥0.990 PCR efficiency ñạt 90-105% C (9) Xét nghiệm kit RT B real-time PCR ñịnh lượng HIV1-RNA huyết bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS dùng theo dõi hiệu ñiều trị ñặc hiệu Xét nghiệm dựa PCR khuếch ñại Hình 75: Kết xét nghiệm ñịnh genotype HBV với kit NKHBV genotype-PCR (✆), xét nghiệm phát ñột biến YMDD NK kháng lamivudine HBV với kit HBVlamiR-PCR (B), xét nghiệm ñịnh genotype HCV với kit NKHCVinoLI€✆ genotype-core PCR (C) ñoạn ñặc hiệu vùng gag gene genome HIV1 Xét nghiệm kit ñạt ñộ nhạy 100 copies/ml huyết Có chứng nội RNA phiên mã từ plasmid chèn DNA tái tổ hợp sử dụng 163 mồi cho sản phẩm khuếch ñại có trình tự khác biệt cDNA ñích nhờ ñược phát phân biệt với sản phẩm khuếch ñại từ DNA ñích với nguyên tắc kit real-time PCR phát HBV Chứng nội ñược cung cấp lượng tối thiểu ñể cho vào với mẫu thử nhờ ñó kiểm tra ñược hiệu tách chiết RNA phát ñược ức chế Chứng âm huyết tương người bình thường, có chứng dương chứa 100 copies/ml plasmid chèn ñúng ñoạn DNA ñích nhờ chứng minh ñược ñộ nhạy phản ứng ñúng khai báo Các nồng ñộ DNA ñích chuẩn ñược cung cấp dạng bền vững nhờ mà ñường chuẩn ñược xây dựng ñạt R≥0.990 PCR efficiency ñạt 90- Hình 76: M❋t s❄ b❋ xét nghi✝m PCR RT-PCR phát hi✝n tác nhân virus gây b✝nh tôm Các b❋ xèt nghi✝m ñạt ñầy ñủ chuẩn mực kỹ thuật cho xét nghiệm PCR RT-PCR dành cho chẩn ñoán 105% (10) Ngoài ra, ñể cung cấp thêm giải pháp toàn diện xét nghiệm sinh học phân tử dùng chẩn ñoán theo dõi hiệu ñiều trị viêm gan virus B viêm gan virus C mạn tính, ñã phát triển xét nghiệm kit như: Nested multiplex PCR ñịnh genotype HBV, PCR-RFLP phát ñột biến YMDD vị trí 204 180 ñề kháng lamivudine HBV, PCR core kit ñịnh genotype HCV 164 phương pháp lai với dò inoLIPA (hình ) Các xét nghiệm kit hoàn toàn triển khai ñược phòng thí nghiệm có trang bị phương tiện PCR (11) Trong lĩnh vực thủy sản, công ty Nam Khoa công ty ñầu tiên hàng ñầu phát triển ñược xét nghiệm PCR realtime PCR phát xác ñịnh tỷ lệ tôm nhiễm virus WSSV, MBV, HPV, IHHNV, GAV, YHV, TSV, MrNV với ñầy ñủ chuẩn mực dành cho chẩn ñoán Công ty nhà tiên phong phát triển phương pháp xác ñịnh tỷ lệ tôm nhiễm bệnh phương pháp real-time kỹ thuật ñịnh lượng tương ñối Hình minh họa số kit PCR RT-PCR công ty Nam Khoa phat triển ñể phát virus gây bệnh cho tôm thực tế triển khai kỹ thuật kỹ thuật sinh học phân tử khác Thật cho ñến nay, nhu cầu ñến từ nhà lâm sàng nghiên cứu y học không ñòi hỏi phải phát triển ứng dụng kỹ thuật PCR real-time PCR, mà ñòi hỏi nhà khoa học phải sớm ñưa kỹ thuật sinh học phân tử ñại khác vào ứng dụng Một kỹ thuật mà nhận thấy cần phải thực ñược ñó kỹ thuật giải trình tự Quan ñiểm ứng dụng kỹ thuật không nghiên cứu mà phải phục vụ cho chẩn ñoán lâm sàng Chính mà năm 2005, ñã ñầu tư máy giải trình tự CEQ8000 có chức năng: giải trình tự, phân tích ñoạn, phát SNP Năm 2007 ñã nâng cấp thêm chức thực nghiên cứu biểu gen ñồng thời ñầu tư thêm thiết bị giải trình tự ABI 3130XL có 16 capillaries Với chức giải trình tự, ñã thành công triển khai xét nghiệm: (1) Định genotype HCV kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận ñược từ xét nghiệm ñịnh lượng HCV-RNA kit NK HCV RT realtime TQPCR; (2) Định genotype phát ñột biến kháng lamivudine, adefovir entecavir kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR khuếch ñại từ gene rt HBV; (3) Phát ñột biến precore HBV ñể tiên ñoán dự hậu viêm gan virus B mạn tính; (4) Phát M tuberculosis kháng rifampicine, INH, ethambutol trực tiếp từ bệnh phẩm với kết vòng 72 Ngoài ra, chức khác CEQ8000 chức phân tích ñoạn ñã ñược triển khai xét nghiệm xác ñịnh quan hệ huyết thống, chức phát SNP ñang ñược triển 165 khai ñể phát tính ña dạng loài ñột biến, chức biểu gene nghiên cứu ung thư hiệu ñiều trị thuốc trị ung thư ế luận Đã nhà khoa học, có tri thức ñịnh Các tri thức ñến từ sách hay phương tiện tra cứu mà ngày hôm dễ dàng tiếp cận Đã nhà nghiên cứu lĩnh vực y học có mong muốn làm ñược ñiều ñó từ kiến thức mà ñang có ñể ứng dụng ñược vào giải số thực tế ñòi hỏi chẩn ñoán nghiên cứu y học nước Vấn ñề yếu ñể tri thức mà có không tri thức suông mà phải biến thành sản phẩm? Đây câu hỏi mà nghĩ nhiều người muốn biết ñể trả lời Chúng nghĩ có câu thơ Goethe có lẽ giúp có kim nam ñể trả lời câu hỏi trên: “Knowing is not enough, we must apply Willing is not enough, we must do” Với lời phóng dịch người bạn chúng tôi: “Tri thức chẳng ñủ Nếu không ñem trãi nghiệm với ñời Ước vọng trở thành vô nghĩa Nếu ngồi ôm mộng chơi vơi” Ngoài ra, ñể tránh bị nhà sản xuất nước chê bai mặt chất lượng, cho ñừng có tự thua cho TI N NÀO C A ĐÓ, mà phải trả lời trau dồi tri thức ñể vươn ñến ñỉnh cao khoa học TRI THỨC ĐẾN ĐÂU CHẤT LƯỢNG ĐẾN ĐÓ 166