Các kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật Nội dung học      Mở đầu Các phương pháp chuyển gen không sử dụng virus Các phương pháp chuyển gen sử dụng virus Ứng dụng Kết luận Mở đầu  Dự án giải mã gen Người (Human Genome Project, 1990 – 2003)   Hiểu biết rõ ràng gen Người Cải tiến phương pháp chuẩn đoán, điều trị cá thể  Liệu pháp gen Mở đầu   Liệu pháp gen việc áp dụng nguyên lí di truyền điều trị bệnh lí người Liệu pháp gen = chuyển vật liệu di truyền vào tế bào với mục tiêu     Thay cho gen chức Ức chế biểu gen bệnh Tiêu diệt tế bào bệnh gen tự sát … Mở đầu Mô hình liệu pháp gen Mở đầu  Chiến lược chuyển gen   In vivo Ex vivo Mở đầu  Các phương pháp chuyển gen   Phương pháp chuyển gen sử dụng virus Phương pháp chuyển gen không sử dụng virus   Phương pháp hóa học Phương pháp vật lí Phương pháp  Chuyển gen virus    Khả xâm nhiễm đa dạng chuyên biệt Gắn chèn gen mục tiêu vào gen tế bào chủ  biểu ổn định protein mục tiêu Retrovirus, Herpesvirus, Adenovirus, Lentivirus, … Phương pháp  Quá trình chép virus Chuyển gen sử dụng virus  Chiến lược sử dụng vector virus  Giai đoạn 1: tạo vector virus Tín hiệu đóng gói Gen mục tiêu Vector DNA Helper DNA Virus hoang dại Gen cần thiết virus Protein virus Tế bào đóng gói Protein virus Vector retrovirus 10 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp DEAE-dextran 21 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp Cationic lipid (Liposome)   Một phương pháp không sử dụng virus hiệu Khi cho Cationic lipid vào DNA      Tập hợp DNA (điện tích) Hình thành phức hợp lớp nhiều tầng DNA/cationic lipid Dễ dàng thấm qua màng tế bào di chuyển thông qua trình thực bào Một số loại cationic lipid độc với tế bào Một số sản phẩm thương mại: Lipofectamine (Invitrogen), Fugene (Roche, Promega) 22 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp Cationic lipid (Liposome) 23 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp vật lý     Thường sử dụng phương pháp chuyển gen hóa học hiệu Không phụ thuộc vào loại tế bào Không có giới hạn kích cỡ DNA chuyển Yêu cầu có dụng cụ chuyên biệt (Súng bắn gen, Máy điện biến nạp, Hệ thống vi thao tác, …) 24 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp điện biến nạp     Sử dụng dòng điện  tạo điện trường tác động lên màng tế bào thời gian cực ngắn (us – ms) Xuất lổ (pore) màng tế bào  vector dễ dàng di chuyển xuyên qua màng tế bào Thông số điện biến nạp dòng tế bào khác Thường gây chết tế bào !!! 25 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp điện biến nạp 26 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp điện biến nạp 27 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp bắn gen    Hệ thống bao gồm xylanh “hộp đạn” có chứa hạt vàng phủ DNA Khi kích hoạt hệ thống, khí nén Helium giải phóng, tác động sóng siêu âm lên hạt vàng có phủ DNA  hạt di chuyển vào tế bào chất tế bào Thường áp dụng cho tế bào thực vật (Bắp, Lúa mạch, Đậu nành, …) 28 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp bắn gen 29 Ứng dụng  Bệnh SCID – Suy giảm miễn dịch trầm trọng (Severe Combined Immunodeficiency Disease)     Do thiếu hụt Adenosin Deaminase (Adenosine Deaminase Deficiency (ADA)), dẫn đến tạo số lượng lớn S-adenosylhomocysteine, gây độc cho trưởng thành Lympho T B Gen mã hóa nằm NST số 22 (32Kbp, 12 exons) Hậu quả: Lympho T B chức Các tác nhân lạ dễ dàng xâm nhập  chết, không điều trị 30 Ứng dụng  Điều trị   Trước có liệu pháp gen  ghép tủy David, bị SCID vừa sinh đời, nhận tủy chị gái  chết, bị ung thư máu 31 Ứng dụng  Điều trị     Tháng 9, 1990, NIH điều trị cho bệnh nhân SCID liệu pháp gen Ashanti – tuổi, tiến hành ghép tế bào lympho biến nạp gen mã hóa ADA phương pháp sử dụng retrovirus (~109 vector retrovirus sử dụng) Cynthia – tuổi, điều trị giống Ashanti Thành công việc tái tạo hệ miễn dịch, nhiên, tế bào bạch cầu có đời sống ngắn, phải lặp lại ca ghép tế bào chuyển gen 32 Ứng dụng  Bệnh ung thư liệu pháp sử dụng virus oncolytic   Chuyên biệt receptor Chuyên biệt chép   Không có xuất protein kháng virus Sử dụng promoter thích hợp 33 Ứng dụng  Bệnh ung thư liệu pháp sử dụng virus oncolytic AFP promoter 34 Kết luận    Các kỹ thuật chuyển gen  ưu điểm khuyết điểm riêng Liệu pháp gen  chưa ổn định, cần thêm hoàn thiện phương pháp chuyển gen Liệu pháp gen = “ốc đảo sa mạc” 35 [...]...  Gắn chèn gen mục tiêu vào NST của tế bào quan tâm  biểu hiện gen mục tiêu ổn định Ít nhạy cảm với hệ miễn dịch Sử dụng đối với các dòng tế bào phân chia mạnh Khuyết điểm    Gắn chèn gen mục tiêu một cách ngẫu nhiên Không có khả năng chuyển nhiễm lên các dòng tế bào không phân chia Sự biểu hiện bắt đầu giảm đi sau một thời gian biểu hiện ổn định 14 Chuyển gen sử dụng virus 15 Chuyển gen không sử... màng tế bào hoặc di chuyển thông qua quá trình thực bào Một số loại cationic lipid độc với tế bào Một số sản phẩm thương mại: Lipofectamine (Invitrogen), Fugene (Roche, Promega) 22 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp Cationic lipid (Liposome) 23 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp vật lý     Thường sử dụng khi các phương pháp chuyển gen bằng hóa học kém hiệu quả Không phụ thuộc vào. .. loại tế bào Không có giới hạn về kích cỡ DNA chuyển Yêu cầu có các dụng cụ chuyên biệt (Súng bắn gen, Máy điện biến nạp, Hệ thống vi thao tác, …) 24 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp điện biến nạp     Sử dụng dòng điện  tạo một điện trường tác động lên màng tế bào trong thời gian cực ngắn (us – ms) Xuất hiện các lổ (pore) trên màng tế bào  vector dễ dàng di chuyển xuyên qua màng tế bào. .. Phương pháp vật lí   Điện biến nạp Súng bắn gen 16 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp hóa học      Sử dụng lần đầu tiên vào năm 1965 (DEAEdextran) Giúp cho DNA dễ dàng bám và di chuyển qua màng tế bào, màng nhân Hiệu quả thấp hơn so với các phương pháp chuyển gen sử dụng virus Yêu cầu nghiêm ngặt về hóa chất sử dụng Không liên quan đến các vấn đề về an toàn sinh học 17 Chuyển gen không... nạp giữa các dòng tế bào rất khác nhau Thường gây chết tế bào !!! 25 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp điện biến nạp 26 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp điện biến nạp 27 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp bắn gen    Hệ thống bao gồm một xylanh và một “hộp đạn” có chứa các hạt vàng được phủ DNA Khi kích hoạt hệ thống, khí nén Helium được giải phóng, tác động một sóng... hạt vàng được phủ DNA Khi kích hoạt hệ thống, khí nén Helium được giải phóng, tác động một sóng siêu âm lên các hạt vàng có phủ DNA  các hạt này di chuyển vào tế bào chất của tế bào Thường áp dụng cho tế bào thực vật (Bắp, Lúa mạch, Đậu nành, …) 28 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp bắn gen 29 Ứng dụng  Bệnh SCID – Suy giảm miễn dịch trầm trọng (Severe Combined Immunodeficiency Disease) .. .Chuyển gen sử dụng virus  Giai đoạn 2: quá trình xâm nhiễm Vector trần vector Vector tồn tại trong nhân Tế bào mục tiêu Vector gắn chèn vào NST mRNA và Protein trị liệu 11 Chuyển gen sử dụng virus   Retrovirus Cấu tạo  Vỏ   Thụ thể Glycoprotein Lõi    Protein lõi Vật liệu di truyền Các enzym 12 Chuyển gen sử dụng virus  Retrovirus 13 Chuyển gen sử dụng virus  Retrovirus... SCID đầu tiên bằng liệu pháp gen Ashanti – 4 tuổi, được tiến hành ghép các tế bào lympho đã được biến nạp gen mã hóa ADA bằng phương pháp sử dụng retrovirus (~109 vector retrovirus được sử dụng) Cynthia – 9 tuổi, điều trị giống như Ashanti Thành công trong việc tái tạo hệ miễn dịch, tuy nhiên, các tế bào bạch cầu có đời sống ngắn, phải lặp lại các ca ghép tế bào đã được chuyển gen 32 Ứng dụng  Bệnh ung... mặt tế bào quan tâm DNA sẽ di chuyển vào bên trong tế bào thông qua cơ chế thực bào (endocytosis) Tủa CaPO4: ngăn chặn sự ảnh hưởng của nuclease 18 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp Calcium Phosphate 19 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp DEAE-dextran     Phức hợp DNA/DEAE-dextran được tạo ra dưới tác dụng của lực tĩnh điện DEAE-dextran có điện tích +, gắn kết DNA (-) và màng tế. .. và màng tế bào (-) Hiệu quả cao hơn Calcium phosphate, nhưng DEAE-dextran độc với tế bào, dễ làm chết tế bào sau biến nạp Thực hiện biến nạp không sử dụng huyết thanh 20 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp DEAE-dextran 21 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp Cationic lipid (Liposome)   Một trong những phương pháp không sử dụng virus khá hiệu quả Khi cho Cationic lipid vào DNA   ... màng tế bào  vector dễ dàng di chuyển xuyên qua màng tế bào Thông số điện biến nạp dòng tế bào khác Thường gây chết tế bào !!! 25 Chuyển gen không sử dụng virus  Phương pháp điện biến nạp 26 Chuyển. .. Helium giải phóng, tác động sóng siêu âm lên hạt vàng có phủ DNA  hạt di chuyển vào tế bào chất tế bào Thường áp dụng cho tế bào thực vật (Bắp, Lúa mạch, Đậu nành, …) 28 Chuyển gen không sử dụng... liệu di truyền vào tế bào với mục tiêu     Thay cho gen chức Ức chế biểu gen bệnh Tiêu diệt tế bào bệnh gen tự sát … Mở đầu Mô hình liệu pháp gen Mở đầu  Chiến lược chuyển gen   In vivo