Đang tải... (xem toàn văn)
Chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm
Chương Chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm I Khái quát chẩn đoán bệnh truyền nhiễm Chẩn đoán bệnh truyền nhiễm việc xác định nguyên nhân (và tên gọi) tượng bệnh lý có thơng qua thủ tục mô tả tượng bệnh lý gặp cá thể (bệnh) quần thể (dịch) hoặc/và mô tả mầm bệnh phân lập để so sánh thuộc tính thu với thuộc tính bệnh/dịch mầm bệnh mô tả, phân loại định danh (đặt tên) quy thuộc tượng bệnh lý có vào nhóm tượng bệnh lý phân loại đặt tên Mơ tả dựa vào triệu chứng lâm sàng (chẩn đốn lâm sàng), bệnh tích (chẩn đốn giải phẫu bệnh lý), đặc điểm dịch học (chẩn đoán dịch tễ học) đặc điểm vi sinh vật học, huyết học, huyết học, sinh học phân tử (chẩn đoán xét nghiệm) Như vậy, ta gọi tên bệnh có nhờ vào việc xác định tính tương đồng biểu bệnh và/hoặc bệnh với biểu bệnh và/hoặc bệnh bệnh đặt tên từ trước Thủ tục chẩn đoán (giống thủ tục nhận dạng) gọi thủ tục đồng định (identification) Trên thực tế, trình quy thuộc thực qua hàng loạt bước loại suy, ví dụ "vi khuẩn phân lập nhuộm màu Gram âm Bacillus hay vi khuẩn Gram dương khác" Do đó, chẩn đốn cịn q trình giám biệt (differentiation), cịn tính trạng quan trọng giúp chẩn đoán gọi đặc điểm giám biệt Tuy nhiên, nhiều thủ tục chẩn đoán việc xác nhận diện mầm bệnh (chẩn đoán bệnh nguyên học xác nhận kết chẩn đoán khác) Đồng định, vậy, khơng "xác định", mà xác định có định hướng sở kiến thức biết trước nhà chuyên môn loại bệnh và/hoặc mầm bệnh Hơn đồng định thất bại Sau nỗ lực đồng định, đồng định thất bại, nhà chun mơn đưa giả thuyết loại bệnh mới, chưa biết Trong điều tra dịch tễ học người ta nghiên cứu tốc độ truyền lây, tỷ lệ mắc bệnh mới, tỷ lệ lưu hành bệnh, tỷ lệ tử vong, tuổi giống phát bệnh chủ yếu, vùng phát sinh, yếu tố thời tiết, sinh sản dị thường đẻ trứng dị thường, giảm sản lượng sữa tỷ lệ đẻ trứng, thay đổi thức ăn, nhập động vật mới, truyền lây bệnh sang loại động vật khác, lịch sử tiêm phòng vacxin, Đặc biệt, điều tra dịch học quan trọng trình nhận biết bệnh truyền nhiễm phát sinh động vật chăn nuôi tập trung điều kiện môi trường Tuy nhiều bệnh cảm nhiễm đặc điểm dịch học, biểu bệnh lý triệu chứng lâm sàng đặc trưng, điều giúp ích cho việc suy định mầm bệnh liên quan cần ý chúng tạo định kiến người xét nghiệm làm lệch lạc kết lựa chọn sai phương pháp xét nghiệm, ví dụ, dùng phương pháp vi khuẩn học để xét nghiệm động vật bệnh ngộ độc hóa chất (nơng dược, ) Chẩn đốn bệnh ngun học thủ tục vi sinh vật học, huyết học sinh học phân tử, nhằm xác định diện loại mầm bệnh thể bị bệnh Đương nhiên, quy thuộc yếu tố mầm bệnh nghi ngờ (với nhóm mầm bệnh biết) cấp độ chi tiết tốt: loài gì, nhóm huyết học nào, nhóm di truyền học phân tử nào, câu hỏi thường đặt tìm cách trả lời Để thực nhanh chóng xác xét nghiệm chẩn đốn bệnh nguyên học cần khảo cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích mổ khám đặc điểm dịch tễ để suy định bệnh nguyên liên quan gây nên bệnh dịch Dựa vào triệu chứng lâm sàng bệnh tích, vị trí bệnh biến chủ yếu, mà bệnh truyền nhiễm động vật chia thành bệnh quan hô hấp, bệnh hệ thần kinh trung ương, bệnh quan tiêu hóa, bệnh sinh khối u (ung thư), bệnh da, bệnh quan sinh dục tiết niệu chứng bệnh trở ngại sinh sản (vô sinh, đẻ non, ) Chủng loại mầm bệnh vi khuẩn, virut, nấm, nguyên trùng ký sinh trùng khác Hơn loại mầm bệnh không gây bệnh đơn mà cịn bệnh hỗn hợp kế phát làm bệnh chứng lâm sàng thêm phức tạp Do đó, việc chọn lấy loại bệnh phẩm thích hợp với loại bệnh tật hay khác việc thu mẫu ảnh hưởng lớn đến kết chẩn đoán Trong trường hợp nghi ngờ bệnh cảm nhiễm vi khuẩn, chẳng hạn, cần ý mở rộng giả thuyết loại mầm bệnh mà lấy mẫu thích hợp để chẩn đoán bệnh cảm nhiễm virut nấm, II Chẩn đoán bệnh nguyên học Lấy mẫu bảo quản mẫu bệnh phẩm Kết phân lập bệnh nguyên phụ thuộc việc lấy bệnh phẩm vào thời điểm thích hợp từ vị trí thích hợp xử lý thích hợp xét nghiệm Cách lấy mẫu khác phụ thuộc loại bệnh, mẫu bệnh phẩm, nguyên tắc lấy sớm phát bệnh trạng lâm sàng, vật bệnh chết sau chết tốt Tuy nhiên, bệnh cảm nhiễm mãn tính bệnh ngun cịn phân lập bệnh qua Vị trí lấy bệnh phẩm thích hợp đa số trường hợp tổ chức có biến đổi bệnh lý (ổ bệnh) vị trí liên quan Ví dụ, bệnh quan hơ hấp lấy dịch xoang mũi khí quản, bệnh thần kinh lấy máu tủy sống, bệnh đường tiêu hóa lấy phân dịch từ hầu họng, bệnh da lấy nội dịch bọc nước bọc mủ, bệnh đường sinh dục tiết niệu lấy nước tiểu dịch thẩm xuất tử cung, Hơn nữa, trường hợp phân lập mầm bệnh từ mẫu bệnh phẩm mổ khám bệnh tích cần lấy cách vô trùng tránh vi khuẩn đường ruột ô nhiễm loại bệnh phẩm (não, gan, lách, hạch lympho, ), thời điểm lấy mẫu sau chết sớm tốt sau súc vật chết vài nội quan máu bị tạp khuẩn xâm nhập phát triển Hơn nữa, bệnh cảm nhiễm virut có chứng nhiễm virut huyết nặng bệnh sốt lưu hành bị cần lấy máu vào thời điểm sốt Sau phát bệnh hai tuần trở thời kỳ lấy máu thu huyết kỳ hồi phục Trong thời kỳ hiệu giá kháng thể tăng so với thời kỳ sốt cấp tính chứng tỏ mầm bệnh chứa kháng nguyên thuộc loại dùng để phát kháng thể Ví dụ, bệnh xuất quần thể cá thể bị bệnh cấp tính triệu chứng bệnh kéo dài khoảng tuần, khả phát mầm bệnh nhờ lấy mẫu để phân lập khoảng tuần vài ngày sau Trong kỳ cấp tính kháng thể đặc hiệu chưa hình thành Tuy nhiên, sau thời điểm kháng thể đặc hiệu bắt đầu tăng dần Nếu lấy mẫu huyết kỳ hồi phục (từ 10 ngày tháng sau xuất triệu chứng hàm lượng (hiệu giá) kháng thể cao nhiều so với lần lấy máu kỳ cấp tính Trong kỳ hồi phục này, ngược lại khó phân lập mầm bệnh Trong kiểm tra bệnh nguyên, sau lấy mẫu nên xét nghiệm mẫu sớm tốt Trong trường hợp thực xét nghiệm được, để phân lập vi khuẩn bảo quản bệnh phẩm °C đông lạnh Nhưng với bệnh phẩm để kiểm tra virut cần bảo quản -70 °C bảo quản dung dịch PBS (dung dịch sinh lý đệm phosphat) pha 50% glycerin Kiểm nghiệm thể bệnh nguyên Kiểm nghiệm thể bệnh nguyên bao gồm số phương pháp bên cạnh việc chẩn đoán lâm sàng: kiểm tra trực tiếp, nuôi cấy phân lập đồng định mầm bệnh qua xét nghiệm, phản ứng dị ứng phản ứng huyết học xác định tăng hàm lượng kháng thể đặc hiệu huyết Hai sơ đồ thường áp dụng cho việc chẩn đoán bệnh vi khuẩn virut gây động vật Kiểm tra trực tiếp bệnh phẩm thực trường hợp phải vận dụng đối sách cấp bách bệnh cảm nhiễm nhiều đồng thời với xác định mầm bệnh qua phân lập Trong trường hợp bệnh cảm nhiễm vi khuẩn người ta suy định chủng loại mầm bệnh sở đặc điểm hình thái, bắt màu vi khuẩn có bệnh phẩm Khi xác nhận mầm bệnh tiêu chế tác từ ổ bệnh quan tổ chức vốn khơng có vi sinh vật, thấy vi khuẩn nghi gây bệnh cách áp đảo tổ chức thường có vi khuẩn "bình thường" phương pháp kiểm tra trực tiếp hữu ích Hơn nữa, kết cịn có tác dụng tham khảo việc tuyển chọn khuẩn lạc đặc hiệu phát triển môi trường phân lập vi khuẩn Trong trường hợp bệnh cảm nhiễm nguyên trùng Leptospira Spirochaeta người ta cịn sử dụng tiêu tươi khơng nhuộm Ngồi ra, sử dụng phương pháp miễn dịch huỳnh quang phản ứng ngưng kết để kiểm tra kháng nguyên đặc hiệu, phương pháp PCR để kiểm xuất ADN đặc hiệu mầm bệnh phương pháp kiểm tra trực tiếp Trong trường hợp bệnh cảm nhiễm virut phương pháp trực tiếp kiểm tra thể bệnh nguyên phương pháp hiển vi điện tử để phát virion virut, phương pháp phát thể vùi (thể ấn nhập) tiêu tổ chức nhuộm, phương pháp kháng thể huỳnh quang phát kháng nguyên đặc hiệu, phương pháp PCR để phát ADN đặc hiệu mầm bệnh Phươ ng pháp hiển vi điện tử áp dụng để kiểm tra trực tiếp kiểm tra sau làm tăng nồng độ bệnh phẩm (dịch ổ viêm, niêm dịch mũi, phân, ) tiêu siêu mỏng làm từ tổ chức bệnh biến nhuộm âm Các phương pháp kháng thể huỳnh quang nhuộm tổ chức sử dụng tiêu mỏng tế bào tách biệt từ lát cắt tổ chức Các phương pháp kiểm tra trực tiếp hữu ích trường hợp phải chẩn đoán nhanh cách xác để có đối sách dự phịng sớm virut khó khơng thể ni cấy 2.1 Phương pháp kiểm tra phát kiểu hình Các phương pháp kiểm tra phát kiểu hình bao gồm hiển vi trực tiếp tiêu nhuộm (nhuộm Gram, Giemsa, ) tiêu tươi, sau nuôi cấy khởi đầu phân lập vi sinh vật gây bệnh nghiên cứu đặc điểm sinh lý (khả phát triển môi trường đặc điểm lứa cấy, ), đặc điểm sinh hóa (phân giải hay tổng hợp chất, sản phẩm trung gian trình chuyển hóa, ), khả đề kháng (hay mẫn cảm) với thuốc kháng sinh, Trên sở mô tả tính trạng vi sinh vật so sánh với mơ tả trước để quy thuộc vi sinh vật ta có vào nhóm vi sinh vật định 2.2 Phương pháp phát axit nucleic đặc hiệu Trình tự nucleotid ADN nhiễm sắc thể sinh vật, axit nucleic nucleocapsid virut ty thể sinh vật nhân thực có tính bảo tồn cao, bảo đảm tính cá thể chúng trình phát triển Trình tự khác cá thể khác miền định trình tự axit nucleic ổn định cá thể loài, miền khác lại giống cá thể nhóm phân loại lớn Nhìn chung miền axit nucleic genom có tính bảo tồn cao gen có tính chức cao Các phương pháp phát gen đặc hiệu ADN ARN đặc hiệu áp dụng rộng rãi phân loại đồng định vi sinh vật thời gian gần nhờ thành tựu to lớn nghiên cứu sinh học phân tử Các phương pháp phát gen đặc hiệu thường sử dụng PCR (polymerase chain reaction - phản ứng chuỗi enzym trùng hợp) với biến thể (RAPD, ), RT-PCR với ARN virut sinh vật khác, phương pháp lai phân tử (hybridization, gồm nhiều biến thể khác Southern hybridization, Northern hybridization, Western hybridization), tính đa dạng ngẫu nhiên, giải đọc so sánh trình tự nucleotid, Mục đích phương pháp so sánh phân loại vi sinh vật sở tính đồng dạng dị biệt (tính đồng - dị) gen có chức cao đó, sở đồng định vi sinh vật bệnh nguyên phát với mầm bệnh mơ tả phân loại trước đó, tức xác nhận bệnh phẩm có vi sinh vật thuộc loại mầm bệnh số mầm bệnh biết hay không thông qua xác nhận diện gen đặc hiệu loại mầm bệnh mầm bệnh khác biết 2.3 Phương pháp huyết học Các phương pháp huyết học dùng để phân biệt sinh vật đồng định chúng thông qua việc đánh giá tính dị biệt tính đồng dạng phân tử tham gia phản ứng với kháng huyết hay kháng thể Bản chất phương pháp lợi dụng tính đặc hiệu phản ứng kháng nguyên kháng thể: "kháng nguyên kết hợp với kháng thể nấy" Trong thực tế phản ứng huyết học giúp phát kháng nguyên (nếu có sẵn kháng thể đặc hiệu) phát kháng thể (nếu có sẵn kháng nguyên) Việc phát kháng nguyên bệnh phẩm thường khẳng định diện mầm bệnh Tuy nhiên, phản ứng thường khó khăn so với phản ứng phát kháng thể Phát kháng thể cho phép kết luận khứ động vật bị kháng nguyên xâm nhập (có thể bị cảm nhiễm tiêm vacxin) Như vậy, phát kháng thể máu động vật khơng có ý nghĩa chẩn đốn Tuy vậy, thực hai lần xét nghiệm kháng thể (cách số ngày) trình bệnh lâm sàng mà thấy có tăng cao hàm lượng (hiệu giá) kháng thể chứng tỏ bệnh mầm bệnh (mang kháng nguyên) tương ứng gây Phân lập đồng định bệnh nguyên Đồng định mầm bệnh nhằm trả lời câu hỏi có phải bệnh (với triệu chứng lâm sàng đặc điểm bệnh tích mơ tả) gây vi sinh vật (thuộc loại biết gây bệnh) hay khơng Hay nói cách khác, đồng định mầm bệnh xác định mầm bệnh nghi ngờ có mặt bệnh phẩm có thực có mặt hay khơng Việc nghiên cứu đơn giản có tác nhân gây bệnh nghi ngờ Khi cần trả lời kết dương tính hay âm tính Tuy nhiên, nhiều số chủng loại mầm bệnh thuộc đối tượng nghi ngờ khơng Khi đó, phải áp dụng đồng thời nhiều hướng nghiên cứu phân lập kỹ thuật kiểm định khác (vi sinh vật học, huyết học, phân tích phát gen đặc hiệu mầm bệnh, ) 3.1 Vi khuẩn Phân lập đồng định vi khuẩn mầm bệnh phải dựa hiểu biết trước đặc tính loại mầm bệnh có ni cấy khởi đầu thành công phân lập vi khuẩn mầm bệnh dạng lứa cấy khiết để có nguyên liệu cho xét nghiệm sau Nhiều vi khuẩn phát triển mạnh, hình thành khuẩn lạc (từ tế bào ban đầu) sau ngày đêm (ví dụ, E coli) nhiều vi khuẩn khác lại cần nuôi cấy thời gian kéo dài (2 tuần đến tháng trực khuẩn lao, ) có vi khuẩn khơng ni cấy môi trường dinh dưỡng nhân tạo (vi khuẩn bệnh Tyzzer, bệnh phong) Những vi khuẩn hiếu khí yếm khí tùy tiện thuận lợi cho việc ni cấy phân lập vi khuẩn yếm khí thường địi hỏi điều kiện khơng tiếp xúc với khí (Bacteroides, Fusobacterium, Veillonella) điều kiện yếm khí mơi trường dinh dưỡng (Clostridium) Cũng có vi khuẩn mầm bệnh thường cần phải bồi dưỡng tăng sinh trước nuôi cấy phân lập mật độ chúng bệnh phẩm thường không cao (Salmonella) Trong nhiều trường hợp khả phân lập trực tiếp mầm bệnh thường thấp vi sinh vật tạp nhiễm, cần sử dụng thể động vật thí nghiệm mẫn cảm làm môi trường tuyển lựa mầm bệnh Biện pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm địi hỏi phải nắm tính gây bệnh loại mầm bệnh điều kiện thí nghiệm Để ni cấy khởi đầu thường sử dụng mơi trường đặc thích hợp Các môi trường thạch thường, thạch máu thường sử dụng cho nhiều loại vi khuẩn Tuy vậy, nhiều vi khuẩn mầm bệnh sử dụng trực tiếp môi trường phân biệt (như môi trường Endo, Istrati, EMB, cho số trực khuẩn đường ruột, môi trường muối kiềm cho Vibrio, môi trường Lowenstein với trực khuẩn lao, ) Với vi khuẩn hiếu khí, que cấy vô trùng lấy lượng nhỏ bệnh phẩm phết lên vị trí bề mặt mơi trường nuôi cấy khởi đầu que cấy đó, que cấy vơ trùng khác, từ vị trí vết bơi vạch lên bề mặt mơi trường đường gấp khúc không chồng lên dài tốt Sau ủ điều kiện thích hợp từ mơi trường đó, đặc biệt vùng cuối đường vạch có mật độ vi khuẩn thấp, ta thu khuẩn lạc riêng rẽ có dấu hiệu đặc trưng vi khuẩn mầm bệnh cần đồng định Chọn số khuẩn lạc đại diện để nuôi cấy tiếp môi trường đặc để có lứa cấy khiết dạng khuẩn lạc riêng rẽ canh khuẩn lỏng Chú ý mơi trường tuyển lựa có tế bào vi khuẩn khác loại khơng thể hình thành khuẩn lạc sống phát triển mơi trường khác và, vậy, cần tránh để que cấy chạm vào bề mặt môi trường cách không cần thiết Để đồng định cần vận dụng thử nghiệm thích hợp nghiên cứu hình thái, tính chất bắt màu Gram, tính trạng sinh lý (phát triển mơi trường nghèo có chứa số chất định nồng độ định muối mật, mật, NaCl, KCN, ), tính trạng sinh hóa (chuyển hóa chất lên men đường có sinh khơng sinh hơi, hình thành axit hữu cơ, acetoin, sản sinh ureaza, sinh indol, ), tính gây bệnh động vật, với phơi gà lứa cấy tế bào (vero, ), thành phần protein tế bào, cấu trúc kháng nguyên, 3.2 Virut Việc ni cấy phân lập virut địi hỏi phải có mơi trường tế bào sống động vật thí nghiệm, lứa cấy tế bào tổ chức, trứng gà phát dục (phôi gà) với số xử lý bệnh phẩm Bệnh phẩm nghiền nhỏ, pha với nước sinh lý cho có đủ độ lỗng định, thêm chất kháng sinh (thường penicillin streptomycin) để diệt vi khuẩn Để loại bỏ vi khuẩn, lọc bệnh phẩm nghiền (thường với cát vô trùng để tăng khả giải phóng virion) qua lọc vi khuẩn (đường kính lỗ khổng 1 nói lên có liên quan bệnh yếu tố nguy cơ, RR=1 cho thấy khơng có liên quan bệnh cảm nhiễm yếu tố nguy cơ, cịn RR1 nói lên kết hợp giá trị cao kết hợp mạnh OR=1 cho thấy khơng có liên quan bệnh cảm nhiễm yếu tố nguy cơ, cịn OR1 nói lên có liên quan bệnh yếu tố nguy cơ, RR=1 cho thấy khơng có liên quan bệnh cảm nhiễm yếu tố nguy cơ, cịn RR1 nói lên kết hợp giá trị cao kết hợp mạnh, tức yếu tố nguy (mầm bệnh) giả thuyết nguyên nhân bệnh có xu hướng khẳng định Đánh giá ảnh hưởng tiêm vacxin tỷ lệ mắc bệnh: tốn thực tiễn địi hỏi vacxin nhà sản xuất thực nghiệm khuyến cáo sử dụng Một phương pháp phân tích tính phụ thuộc tỷ lệ gia súc tiêm vacxin tỷ lệ mắc bệnh (sau vacxin theo lý luận phải có hiệu lực) hàng năm Ví dụ liệu thu thập 10 năm (1990 - 1999) bảng sau giúp ta giải vấn đề Năm Tỷ lệ tiêm vacxin (%) Tỷ lệ mắc bệnh (%) 90 55 1,8 91 57 1,7 92 63 2,1 93 64 1,6 94 62 1,2 95 68 1,4 96 71 0,9 97 75 0,8 98 74 0,8 99 77 0,6 Có số phương pháp xác định mối phụ thuộc hai dãy số liệu Trong đó, phương pháp xác định hệ số liên quan thứ bậc rrange phương pháp tiện lợi Hệ số liên quan thứ bậc rrange = 1-{6∑d2/[(n(n-1)(n+1)]} mang giá trị từ -1 đến +1 Giá trị dương mối tương quan thuận, tức tăng giảm, giá trị âm mối tương quan nghịch Giá trị từ đến 0,5 mối phụ thuộc yếu, từ 0,5 đến 0,8 mức trung bình, lớn 0,8 đến mối quan hệ phụ thuộc mạnh Trước hết cần lập bảng xác định thứ bậc, sau: Năm 1990 91 92 93 94 95 96 97 98 99 Tỷ lệ tiêm X (%) 55 57 63 64 62 68 71 75 74 77 Tỷ lệ bệnh Y (%) 1,8 1,7 2,1 1,6 1,2 1,4 0,9 0,8 0,8 0,6 Số thứ tự bậc X 10 Y 10 d (=X-Y) d2 +8 +6 +6 +2 +2 -3 -6 -6 -9 64 36 36 4 36 36 81 ∑d2=306 ... yếu, mà bệnh truyền nhiễm động vật chia thành bệnh quan hô hấp, bệnh hệ thần kinh trung ương, bệnh quan tiêu hóa, bệnh sinh khối u (ung thư), bệnh da, bệnh quan sinh dục tiết niệu chứng bệnh trở... thuộc loại bệnh, mẫu bệnh phẩm, nguyên tắc lấy sớm phát bệnh trạng lâm sàng, vật bệnh chết sau chết tốt Tuy nhiên, bệnh cảm nhiễm mãn tính bệnh ngun cịn phân lập bệnh qua Vị trí lấy bệnh phẩm... bệnh Johne (á lao) bệnh sẩy thai truyền nhiễm Lấy dịch chiết từ lứa cấy tế bào vi khuẩn nuôi cấy lâu ngày ta "dị ứng nguyên mẫn muộn", với bệnh lao gọi tubercullin, với bệnh sẩy thai truyền nhiễm
