BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẦN THỊ HỒNG HÀ NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG U VÀ ĐIỀU BIẾN MIỄN DỊCH TỪ HAI LOÀI NẤM HẦU THỦ (Hericium erinaceus) VÀ NẤM HƯƠNG (Lentinula edodes) NUÔI TRỒNG Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa hợp chất thiên nhiên Mã số: 62.44.01.17 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội, 2015 Công trình hoàn thành tại: Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Mai Hương TS Lưu Văn Chính Phản biện 1: GS.TSKH Phan Tống Sơn Phản biện 2: GS.TS Phạm Văn Ty Phản biện 3: PGS.TS Vũ Đình Hoàng Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Học viện họp vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện quốc gia, Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Nấm lớn có khoảng 140.000 loài, có 14.000 loài biết, khoảng 50% số cho ăn được, 2.000 loài an toàn với người khoảng 700 loài có hoạt tính sinh học dùng cho ngành y dược Khoa học chứng minh nấm dược liệu có tác dụng tốt sức khỏe người, chữa bệnh ung thư, tim mạch, tiểu đường, mỡ máu, béo phì, suy giảm miễn dịch virus (HIV), chống viêm nhiễm, bệnh tổn thương thần kinh v.v… (Wasser, 2002; Chang cs., 2004) Các hoạt chất nấm phân tử nhỏ triterpenoids (hơn 130 loại) nấm linh chi G lucidum (Huie cs., 2004), hericinone (8 loại) erinapyron nấm hầu thủ H erinaceus (Arnone cs., 1994), đặc biệt hoạt tính chữa bệnh nhờ chất phân tử lượng lớn polysaccharide glycoprotein Phần nhiều, polysaccharide nấm có hoạt tính điều hòa đáp ứng sinh học (biological response modifiers, BRM) với vai trò ngăn chặn tiêu diệt tế bào lạ (ung thư, vi sinh vật v.v…) mà không hây hại tế bào chủ Hiện chưa có loại thuốc đặc hiệu chữa ung thư Các phương pháp điều trị ung thư chủ yếu áp dụng liệu pháp miễn dịch nhờ sử dụng chất từ thiên nhiên (đặc biệt beta-glucan từ nấm) kích hoạt, điều hòa hệ thống miễn dịch (đại thực bào, tế bào đơn nhân …) thể tiêu diệt tế bào lạ (ung thư, vi sinh vật) Đối tượng nghiên cứu nội dung luận án Đối tượng nghiên cứu luận án nấm hầu thủ (Hericium erinaceus) nấm hương (Lentinula edodes), với nội dung chủ yếu sau: Tách chiết số hợp chất trao đổi thứ cấp, polysaccharide giàu glucan từ thể nấm Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, khả ức chế hình thành khối u thạch mềm chất phân lập Tạo chế phẩm thử nghiệm động vật thực nghiệm Đánh giá độ an toàn hiệu lực chế phẩm động vật thực nghiệm (khả kháng u điều biến miễn dịch, khả bảo vệ, phục hồi chức gan sản phẩm) Những đóng góp luận án 3.1 Lần nghiên cứu có hệ thống loài nấm (Hericium erinaceus, Lentinula edodes) Việt Nam theo định hướng hoạt tính ức chế tạo u in vitro môi trường thạch 3.2 Lần đánh giá hoạt tính gây độc tế bào dòng ung thư gan (HepG2), ung thư mô liên kết (RD) hoạt tính ức chế tạo u in vitro môi trường thạch polysaccharit phân lập từ loài nấm (Hericium erinaceus, Lentinula edodes) 3.3 Là công trình đâu tiên chiết tách hoạt chất từ nấm hương (Lentinula edodes) đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ức chế tạo u in vitro môi trường thạch 3.4 Là công trình đầu sử dụng β-1,3/1,6-glucan tách từ nấm hầu thủ để bao curcumin tạo sản phẩm Cur-Glu có kích thước nano (50 nm) tan tốt nước Sản phẩm Cur-Glu có hiệu ức chế rõ rệt phức gắn đựợc vào tế bào ung thư làm cho tế bào phát quang (Kết công bố tạp chí quốc tế Chemistry Letter, vol.40, No8, p 846-848) Bố cục luận án Luận án gồm 174 trang với 41 bảng số liệu, 54 hình-sơ đồ, 187 tài liệu tham khảo 11 phụ lục Bố cục luận án: Mở đầu (2 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (41 trang), Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu (9 trang), Chương 3: Thực nghiệm (20 trang), Chương 4: Kết thảo luận (74 trang), Kết luận (3 trang), Các công trình công bố (2 trang), Tài liệu tham khảo (22 trang), Danh mục phụ lục (1 trang) II NỘI DUNG LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Phần tổng hợp nghiên cứu Thế giới nước nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học nấm dược liệu CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Nấm hương Chủng nấm hương (Lentinula edodes (Berk.) Sing.) lưu giữ Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên Nấm nấm hương khô cung cấp Viện Di truyền Nông nghiệp 2.1.2 Nấm hầu thủ Chủng nấm hầu thủ (Hericium erinaceus (Bull.:Fr.) Pers) lưu giữ Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên Nấm hầu thủ khô cung cấp Viện Di truyền Nông nghiệp 2.2 Các phương pháp phân lập hợp chất Sắc ký lớp mỏng (TLC) Phương pháp sắc ký mỏng (TLC) hợp chất đường Sắc ký lớp mỏng điều chế Sắc ký cột (CC) 2.3 Phương pháp tinh β-glucan từ nấm hương nấm hầu thủ 2.3.1 Phương pháp tinh β-1,3-glucan từ nấm hương Theo phương pháp Chihara cs, 1970 2.3.2 Phương pháp tinh β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ Theo phương pháp Mizuno cs., 1999 2.3 Các phương pháp xác định cấu trúc hoá học Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học hợp chất kết hợp xác định thông số vật lý với phương pháp phổ đại bao gồm:  Phổ khối lượng (MS)  Điểm nóng chảy (MP)  Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 2.6 Phương pháp xác định hàm lượng polysaccharide Theo phương pháp Dubois cs., 1956 2.7 Phương pháp thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ -1,3-glucanase 2.8 Nghiên cứu bao curcumin (Cur) β-1,3/1,6-glucan 2.9 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 2.9.1 Phương pháp thử khả gây độc tế bào (cytotoxicity) Nuôi tế bào ung thư in vitro theo Skehan cs Xác định hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư theo phương pháp SRB Likhiwitayawuid cs tiến hành Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia Mỹ (NCI) Phương pháp phòng Sinh học Thực nghiệm thuộc Viện Hoá học Hợp chất Thiên nhiên áp dụng từ năm 1996 2.9.2 Phương pháp ức chế hình thành khối u chiều thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vitro Theo tác giả Jong Bin Kim (2005) Huiyuan Gao cs (2007), triển khai thực phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên 2.10 Các phương pháp thử dược lý 2.10.1 Phương pháp đánh giá độc tính cấp Nghiên cứu tính độc cấp theo phương pháp Abrham (1978) Turner (1965) Được thử nghiệm Bộ môn Dược lý – Học viện Quân y 2.10.2 Phương pháp đánh giá độc tính bán trường diễn Phương pháp mô tả Abrham W.B (1978) theo quy định WHO (2000) Bộ Y tế hiệu lực an toàn nghiên cứu thuốc có nguồn gốc thiên nhiên Được thử nghiệm Bộ môn Dược lý – Học viện Quân y 2.10.3 Phương pháp đánh giá số tác dụng sản phẩm Được thử nghiệm Bộ môn Dược lý – Học viện Quân y 2.10.3.1 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan HG1 mô hình gây độc gan carbon tetracholorid 2.10.3.2 Nghiên cứu tác dụng HG1 đến trình tổng hợp protein động vật dùng bán trường diễn Phương pháp mô tả Irwin Samuel (1967) 2.10.3.3 Nghiên cứu tác dụng hệ miễn dịch HG1 thực nghiệm Theo phương pháp Santos G.W., Mansour H (1968) Phạm Mạnh Hùng (1984) 2.10.3.4 Phương pháp thử hiệu lực kháng u thực nghiệm Theo phương pháp Irina G Agafonova cs., 2008 thử nghiệm Viện Hàn lâm Khoa học Nga 2.10.4 Xử lý số liệu Theo phương pháp thống kê dùng y-sinh-dược học Sử dụng phần mềm Microsoft Excel (Nguyễn Xuân Phách cs, 1995) CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM 3.1 Nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học nấm hương Phần trình bày cụ thể cách thức phân lập chất từ nấm hương theo định hướng hoạt tính ức chế hình thành khối u môi trường thạch 3.1.1 Phân lập hợp chất từ thể nấm hương Nấm hương khô (2 kg) Chiết siêu âm với EtOH 95% Dịch Bã nấm Làm lạnh 4-10 C Kết tinh Cất loại dm Cặn chiết EtOH (65 g) NH1 (6g) Nước (100C) Dịch chiết nước Cặn nấm I 1% NH4 oxalate EtOH - Bổ sung nước - Bổ sung n-hexan (100C) P1 (76,8g) Lớp n-hexan Dịch chiết axit Cặn n-hexan (22 g) Cặn II NaOH (5%), 60C EtOH Bổ sung EtOAc P2 (50g) Lớp etyl axetat Lớp nước Chiết BuOH Cặn etyl axetat (15g) Cặn BuOH (18 g) Dịch chiết kiềm EtOH P3 (221,6g) Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu nấm hương Cặn III Cặn n-hexan (22g) Silica gel CC NH-A1 n-hexan/axeton NH-A249/11/1 NH-A3 (1,5g)Silica gel CC (1.3g) (900mg) NH2nNH3 hexan/axeton: (150mg) (50mg) 3/1-1/1 Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất NH2 NH3 3.1.2 Tách polysaccharide từ dịch lên men nấm hương Dịch lên men nấm hương (1 lít) - Ly tâm 5000v/phút - Loại bỏ cặn Dịch - Bổ sung EtOH 95% (tỉ lệ 3:1) - Ủ 4C - Ly tâm 10000v/phút Cặn P4 (5,2 g) Sơ đồ 3.3 Sơ đồ tách chiết polysaccharide từ dịch lên men nấm hương 3.1.3 Tinh β-1,3/1,6 glucan (lentinan) từ nấm hương P1 (25,2 g) 2L nước, khuấy Tủa với CTAOH 0.2M K tủa 20% acetic acid K tủa CTA-OH 50% acetic acid K tủa Hòa tan 6% NaOH Dịch tan Ethanol, v K tủa Loại protein phương pháp Sevag Polysaccharide tinh (15,2 g) NH-GL Sơ đồ 3.4 Sơ đồ tinh β-1,3/1,6 glucan từ nấm Hương 3.2 Nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học nấm hầu thủ Phần trình bày cụ thể cách thức phân lập chất từ nấm hầu thủ 3.2.1 Phân lập hợp chất từ thể nấm hầu thủ Nấm hầu thủ khô (2 kg) Chiết siêu âm với EtOH 95% Dịch Cặn nấm Nước (100C) Cất loại dm Cặn chiết EtOH (25 g) - Bổ sung nước Cặn I Dịch chiết nước 1% NH4 oxalate (100C) EtOH - Bổ sung n-hexan Lớp nước Lớp n-hexan P1 (120g) Dịch chiết axit Cặn n-hexan (15 g) Bổ sung EtOAc Lớp etyl axetat EtOH P2 (30g) Lớp nước NaOH (5%), 60C Dịch chiết kiềm Cặn III EtOH Chiết BuOH Cặn etyl axetat (7g) Cặn II P3 (320g) Cặn BuOH (3 g) Sơ đồ 3.5: Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu nấm Hầu thủ Cặn n-hexan (15g) Cặn etyl axetat (7 g) Silica gel CC Silica gel pha thường pha đảo nHT-A3 HT-A1 HT-A2hexan/axeton (900mg) (4,5g) 9/11/1 Làm lạnh, kết Sephadex tinh lại HT2 Silica gel CC HT1 - Lọc rửa nhiều (52mg) (500mg) nlần aceton lạnh HT3 (8 mg) HT4 (20 mg) HT5 (125 mg) hexan/axeton Sơ đồ 3.6: Sơ đồ phân lập hợp chất từ nấm hầu thủ 4/1 HT6 (15 mg) 3.2.2 Tách polysaccharide từ dịch lên men nấm hầu thủ Dịch lên men nấm hầu thủ (1 lít) - Ly tâm 5000v/phút - Loại bỏ cặn Dịch - Bổ sung EtOH 95% (tỉ lệ 3:1) - Ủ 4C - Ly tâm 10000v/phút Cặn P4 (3,6 g) Sơ đồ 3.7 Sơ đồ tách chiết polysaccharide từ dịch lên men nấm hầu thủ 3.2.3 Tinh β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ P3 (160 g) Cột DEAE cellulose (Cl -) Tinh (40g) Cột Sapharose CL6B Tinh 2, β-1,3/1,6 glucan (14,54g) Sơ đồ 3.8 Sơ đồ tinh β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ 3.2.4 Thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ -1,3glucanase Dịch -Glucan 5% beta glucan (5mg/ml) đệm citric 25mM enzyme 5’ D1 15’ 120’ 60’ D2 D3 D4 Bất hoạt enzyme, 100C Tủa EtOH tới 25% Dịch HT-GL1 Tủa EtOH tới 40% Dịch HT-GL2 Tủa EtOH 70% HT-GL3 Dịch Sơ đồ 3.9 Sơ đồ Thủy phân β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ emzyme 3.2.6 Sử dụng β-1,3/1,6-glucan từ nấm hầu thủ làm chất mang curcumin  glucan Curcumin tinh khiết H O trao đổi ion (tỉ EtOH tuyệt đối (tỉ lệ 1:1) lệ 1:1) Dịch  glucan Dịch Curcumin Khuấy máy khuấy từ o điều kiện chân, t phòng, 48 Hỗn hợp A Làm bay từ từ dung môi nhiệt độ phòng thời gian 24 h DD B Ly tâm lần dung dịch Cur-Glucan lọc loại bỏ phần Cur không bao lắng xuống Dung dịch Cur-Glu Đông khô Bột Cur-Glu Sơ đồ 3.10 Sơ đồ tạo hỗn hợp β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ curcumin 3.3 Tạo chế phẩm thử nghiệm Tạo 01 sản phẩm thử nghiệm (HG1) có thành phần gồm: 35 % β-1,3/1,6-glucan (từ phân đoạn polysaccharide P3 nấm hầu thủ); 0,1 % chất có hoạt tính khác nấm hầu thủ; 64,9 % chất mang 3.4 Thử dược lý chế phẩm 3.4.1 Nghiên cứu độc tính cấp Thí nghiệm tiến hành với nhóm chuột nhắt trắng, trọng lượng trung bình 20 ± 2,0 g Trước cho chuột uống HG1, chuột chuẩn bị trước 16 Chế phẩm nghiên cứu HG1 cho uống với mức liều tăng dần Trong số mức liều đem thử, khoảng cách mức liều cao chưa gây chết chuột mức liều thấp gây chết 100% số chuột nhóm sử dụng để tính toán Sau cho uống HG1, chuột nuôi dưỡng theo dõi chu đáo, ăn thức ăn tổng hợp xưởng sản xuất thức ăn động vật thí nghiệm cung cấp, nước uống ad libitum Thời gian theo dõi liên tục 72 Số chuột chết đếm theo nhóm Tính toán: theo phương pháp cải tiến Livschitz (1986) 11 Số lượng bạch cầu, hồng cầu, tiểu cầu máu ngoại vi Tỷ lệ thực bào số thực bào Phản ứng mẫn với kháng nguyên (KN) đặc hiệu: gây mẫn cảm chuột nhắt kháng nguyên albumin lòng trắng trứng (OVA) ngày sau gây mẫn cảm, thử thách với kháng nguyên OVA cách tiêm kháng nguyên vào da gan bàn chân chuột nhắt trắng Đánh giá đáp ứng mẫn muộn với kháng nguyên OVA thời điểm 24 h, 48 h, 72 h 96 h sau thời điểm tiêm 3.4.4 Nghiên cứu thử hiệu lực kháng u thực nghiệm động vật sản phẩm HG1 − Động vật thí nghiệm Chuột nhắt trắng trọng lượng 20,0  2,0 g đạt tiêu chuẩn nghiên cứu Động vật thí nghiệm nuôi dưỡng theo quy định phòng thí nghiệm chuyên dụng dược lý tuần trước làm thí nghiệm − Nghiên cứu thử hiệu lực kháng u thực nghiệm HG1 Đánh giá hoạt tính tan huyết tế bào ung thư cổ trướng Ehrlich Chuẩn bị dịch tế bào hồng cầu: Thu máu từ chuột dòng CD1 (20 g): Chuột gây mê diethyl ether, nhanh chóng mổ ngực chúng lấy máu cách chọc nóng dung dịch đệm PBS 10 mM pH 7,4 lạnh (4C) - không dùng thuốc chống đông máu Hồng cầu rửa lần với PBS, dùng 10 lần thể tích dung dịch rửa, ly tâm phút tốc độ 1500 rpm Nồng độ hồng cầu đạt mức OD 1,0 700 nm mẫu chưa cho tan huyết Với thử nghiệm tan huyết, 10 µL dung dịch mẫu thử nghiệm pha với 90 µL dung dịch hồng cầu 5% phiến 96 giếng (37C) OD theo dõi liên tục spectrophotometer 700 nm (Specord UV-VIS) Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro tế bào ung thư cổ trướng Ehrlich (EAC) Dòng tế bào 4N Ehrlich sử dụng thí nghiệm Các tế bào ung thư EAC nuôi cấy ổ bụng chuột phương pháp tiêm vào khoang thể chúng Dòng chuột CD1 sử dụng thí nghiệm Tế bào thu lại sau ngày nuôi cấy Chuột gây mê với diethyl ether nhanh chóng mổ ổ bụng để lấy tế bào ung thư (bằng xi lanh) Các tế bào rửa lần với buffer muối (saline buffer) pH 7,4, dùng 10 thể tích lần dung dịch rửa, ly tâm phút tốc độ 1000 rpm; sau tạo lại dung dịch tế bào với saline buffer (nồng độ 2x106 tế bào/mL) Với thử nghiệm gây độc tế bào, 10 µL dung dịch mẫu thử nghiệm DMSO pha với 90 µL dung dịch tế bào phiến 96 giếng (37C) Tổng tế bào số tế bào sống đếm qua kính hiển vi với thuốc nhuộm Trypan Blue 0,17% Đánh giá hoạt tính chống u in vivo tế bào ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich (EAC) 12 Ung thư EAC phát triển chuột dòng CD1 Chuột đực dòng CD1 từ 68 tuần tuổi với cân nặng 20g sử dụng Trong thí nghiệm có 40 động vật thử nghiệm Mỗi nhóm thí nghiệm gồm 10 động vật thử nghiệm Tế bào ung thư Ehrlich tiêm vào khoang thể chuột với nồng độ 2x106 tế bào/mL Cho chuột dùng chế phẩm HGC1 bắt đầu ngày sau cấy khối u Hỗn hợp pha 1% DMSO dầu olive với liều 100, 10 g/kg thêm vào chuột ngày lần, ngày (5 liều) Nhóm đối chứng có 1% DMSO dầu olive Đánh giá hoạt tính chống u tế bào ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich (EAC) MRI Chuột BALB/c đực 68 tuần (trọng lượng khoảng 26 g) tuổi sử dụng Tế bào Ehrlich cấy vào chuột xương đòn vai phải với nồng độ 5x106 tế bào/mL Cho chuột dùng mẫu thử nghiệm ngày sau cấy khối u Sử dụng kỹ thuật MRI để ước tính khả kiềm hãm khối u Ehrlich sau ngày kể từ ngày thứ sau cấy với tế bào ung thư (ở nhóm đối chứng nhóm thử nghiệm) Chuột gây mê với xylazine (13 mg/kg trọng lượng thể) CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học nấm hương Phần trình bày cách phân lập xác định cấu trúc theo đinh hướng hoạt tính ức chế hình thành khối u môi trường thạch hợp chất từ nấm hương 4.1.1 Tách phân đoạn đánh giá hoạt tính sinh học Quả thể nấm hương khô chiết tách phân đoạn miêu tả sơ đồ 3.1 (mục 3.1.1) Từ dịch chiết cồn tách được: 01 chất kết tinh NH1 phần chiết gồm: cặn n-hexan, cặn ethyl axetat, cặn butanol Từ bã nấm 03 phân đoạn polysaccharide (P1NH, P2-NH, P3-NH) tách chiết (xem sơ đồ 3.1 mục 3.1.1) Ngoài ra, từ dịch lên men nấm hương phân đoạn polysaccharide P4-NH tách (xem mục 3.1.2) Hàm lượng polysaccharide phân đoạn tách từ nấm hương trình bày bảng 4.1 Bảng 4.1 Polysaccharide phân đoạn tách chiết nấm hương Dạng nguyên liệu Polysaccharide*(**) Chiết nước nóng (P1) 3,84 (3,01) 100 g thể Chiết axit (P2) 2,5 (1,95) Chiết kiềm (NaOH 1M) (P3) 11,08 (9,5) Dịch thể (g/L) (P4) 5,2 (3,94) Lượng polysaccharide thô 100 g mẫu nấm khô (hoặc 1L dịch thể) Số ngoặc: hàm lượng polysaccharide 100 g mẫu nấm khô (hoặc 1L dịch thể) Tất phân đoạn chiết tách nấm hương đánh giá hoạt tính gây độc tế bào kháng u thạch Kết cho thấy mẫu NH-hexan P1- NH có hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư gan (HepG2) ung thư mô liên kết (RD) Hơn mẫu biểu hoạt tính ức chế hình thành khối u thạch với mật 13 độ hình thành khối u giảm tương ứng 58,56 54,09%, kích thước trung bình khối u giảm tương ứng 52,01 35,36% so với đối chứng Chúng lựa chọn phân đoạn n-Hexan P1-NH từ nấm hương để phân tách dẫn đường phép thử hoạt tính chống ung thư Phân đoạn n-Hexan tách thành phân đoạn nhỏ NH-A1, NH-A2, NH-A3 Kết đánh giá hoạt tính chống ung thư thông qua thử nghiệm gây độc tế bào ức chế tạo u thạch phân đoạn Kết cho thấy phân đoạn NH-A1 biểu hoạt tính gây độc tế bào ức chế hình thành khối u thạch Phân đoạn NH-A1 lựa chọn để nghiên cứu thành phần hóa học Từ phân đoạn NH-A1 sắc ký cột với hệ dung môi n-hexan/axeton theo tỉ lệ 3/1-1/1, thu hợp chất ký hiệu NH-2 (150 mg) NH-3 (50 mg) (sơ đồ 3.2) Từ phân đoạn polysaccharide P1-NH tinh β-1,3/1,6 glucan (GL-NH) (xem mục 3.1.4) 1.1.2 Xác định cấu trúc hợp chất NH1, NH2 NH3 Hợp chất NH1: galactiol Chất kết tinh màu trắng, điểm chảy 167-169C H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz, ppm) δ 4,40 (d, J = 5,5 Hz, 1H-OH), 4,35 (t, J = Hz, 1H –OH), 4,13 (d, J = Hz), 1H-OH), 3,60 (m, 1H, H1a), 3,53 ( t, J = 7,5 Hz,1H, H3), 3,45 (m, 1H, H1b), 3,38 (m, 1H, H2) 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz, ppm) δ 71,5 (C2), 69,8 (C3), 63,9 (C1) Hợp chất NH2: Ergosterol Tinh thể hình kim màu trắng, Tnc: 168oC, ESI-MS: m/z 397,3 [M + H]+ (C28H44O, M = 396) H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz, ppm) δ: 5,75 (dd, J1=2Hz, J2=5,5Hz, 1H,H6), 5,38 (m,1H,H7), 5,23 (dd, J1=7Hz, J2=15Hz, 1H, H23), 5,17 (dd, J1=7Hz, J2=15Hz, H22), 3,64 (m, H3), 2,47 (m, 1H), 2,28 (t, J = 12 Hz, 2H,H4), 2,04 (m, 1H, H20), 1,98 (1H, m, H9), 1,94 (1H, m, H14), 1,90 (1H, m, H12b), 1,76 (2H, m, H2b, H24), 1,75 (1H, m, H1b), 1,73 (1H, m, H14), 1,67 (1H, m, H15), 1,28 (1H, m, H16a), 1,74 (1H, m, H16b), 1,25 (1H, m, H15a), 1,68 (m, 1H, H15b), 1,64 (m, 1H, H11), 1,50 (1H, m, H2a), 1,38 (m, 1H, H25), 1,34 (1H, m, H12a), 1,25 (m, 1H, H1a), 1,78 (1H, m, H1b), 1,04 (d, J=6,5Hz, 3H21), 0,95 (s, 3H, H19), 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, H28) 0,83 (t, J =7 Hz, 6H, H26-27), 0,63(s, 3H, H-18) 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz, ppm) δ: 141,7 (C-5), 139,9 (C-8), 135,6 (C-22), 131,9 (C-23), 119,60 (C-6), 116,50 (C-7), 70,49 (C-3), 55,79 (C-17), 54,59 (C-14), 46,29 (C9), 42,87 (C-24), 42,59 (C-13), 40,83 (C-40), 40,82 (C-20), 39,12 (C-12), 38,41 (C-1), 37,06 (C-10), 33,12 (C-25), 32,03 (C-2), 28,29 (C-16), 23,02 (C-15), 21,14 (C-4), 21,12 (C-21), 16,31 (C-19), 19,66 (C-26), 19,96 (C-27), 17,62 (C-28) 12,07 (C-18) Hợp chất NH3: Ergosterol peroxide Chất tinh thể hình kim màu trắng, Tnc 181-183oC, phổ khối lượng ESI-MS: m/z 429,3 [M + H]+ (C28H44O3, M = 426) H-NMR (CDCl3, 500 MHz, ppm) δ: 1,56 (1H, m, H1a), 1,85 (1H, m, H1b), 1,72 (1H, m, H2a), 1,96 (1H, m, H2b), 3,97 (1H, m, H3), 1,27 (1H, m, H4a), 1,97 (1H, m, H4b), 6,24 (1H, d, J = 8,5 Hz, H6), 6,50 (1H, d, J = 8,5 Hz, H7), 1,51 (1H, m, H9), 1,41 (1H, m, H11a), 1,62 (1H, m, Hb-11), 1,55 (1H, m, H12a), 2,11 (1H, m, H12b), 1,58 (1H, m, H14), 1,25 (1H, m, H15a), 1,53 (1H, m, H15b), 1,37 (1H, m, H16a), 1,78 (1H, m, H16b), 1,24 (1H, m, H17), 0,86 (3H, s, H18), 0,88 (3H, s, H19), 2,03 (1H, m, H20), 1,01 (3H, d, J = 7,0 Hz, H21), 5,14 (1H, dd, J = 14 8,5, 15,5 Hz, H22), 5,22 (1H, dd, J = 8,5, 15,5 Hz, H23), 1,87 (1H, m, H24), 1,50 (1H, m, H25), 0,88 (3H, d, J = 6,6 Hz, H26), 0,83 (3H, d, J = 6,5 Hz, H27) 0,91 (3H, d, J = 6,5 Hz, H28) 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz, ppm) δ: 30,09 (C-1), 34,71 (C-2), 66,49 (d, C-3), 39,37 (C-4), 82,17 (C-5), 135,22 (C-6), 130,75 (C-7), 79,44 (C-8), 51,12 (C-9), 36,99 (C-10), 20,64 (C-11), 39,91 (C-12), 44,58 (C-13), 51,70 (C-14), 23,42 (C-15), 28,65 (C-16), 56,23 (C-17), 12,88 (C-18), 18,18 (C-19), 39,73 (C-20), 20,89 (C-21), 135,44 (C-22), 132,33 (C-23), 42,79 (C-24), 33,08 (C-25), 19,65 (C-26), 19,96 (C-27) 17,57 (C-28) Hợp chất NH-GL: β-1,3/1,6 glucan Kết phổ cho thấy, có tín hiệu nguyên tử C Tín hiệu C = 103 nguyên tử C1; tín hiệu C = 86,1 nguyên tử C3; tín hiệu C = 76,7 C5; tín hiệu C = 76,3 C3’; tín hiệu C = 73,7 C2; tín hiệu C = tín hiệu 70,3 C6s (thay thế); tín hiệu C = 68,4 C4 tín hiệu C = 61,2 C6 Hợp chất NH1: galactiol HO CH2 Hợp chất NH-2: Ergosterol 28 OH 21 22 24 26 20 CH CH OH HO 18 CH 17 11 25 27 13 19 CH 14 HO 23 10 H2C OH HO Hợp chất NH3: Ergosterol peroxide Chất NH-GL: β- 1,3/1,6 glucan 28 21 22 24 26 20 18 17 11 25 27 13 19 23 14 10 O HO O 1.1.3 Đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất phân lập từ nấm hương Các hợp chất phân lập đánh giá hoạt tính gây độc tế bào kháng u thạch mềm Kết thu bảng 4.2, 4.3 Bảng 4.2 Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập từ nấm hương Nồng độ Dòng tế bào ST Ký hiệu mẫu Phần trăm sống sót (%) T mẫu (g/ml) Hep-G2 Fl RD Lu DMSO 100  0,0 100  0,0 100  0,0 100  0,0 Chứng (+) NH1 NH2 10 10 2,1 0,07 92,70,8 61,10,4 1,7 0,4 96,31,2 72,80,2 0,3  0,02 94,40,5 79,51,1 5,20,4 99,71,8 92,50,3 NH3 10 26,50,7 32,91,1 42,20,4 48,90,6 NH-GL 20 91,30,7 93,21,1 86,50,9 90,41,4 15 STT Dòng tế bào Giá trị IC50 (g/ml) Ký hiệu mẫu Chứng (+) NH3 Hep-G2 0,22 3,84 Fl 0,27 4,17 RD 0,16 7,61 Lu 0,31 9,21 Kết cho thấy, hợp chất NH3 biểu hoạt tính độc tế bào dòng tế bào thử (ung thư gan – Hep G2, ung thư tử cung-Fl, ung thư mô liên kết-RD, ung thư phổi – Lu) với giá trị IC50 3.84, 4.17, 7.61, 9.21g/ml Bảng 4.3 Kết thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u tế bào ung thư gan HepG2 thạch mềm hợp chất Kích thước trung bình Nồng độ Độ giảm mật khối u mẫu thử Kí hiệu mẫu độ khối u Đường kính % giảm so với (% ) (g/mL) (µm) đối chứng Chứng âm (DMSO 1%) 0 29,631,71 10 5,14 NH1 27,751,35 3,330,58 10 3,91 NH2 28,111,57 48,330,50 10 55,18 NH3 13,280,98 58,331,26 20 34,36 GL-NH 19,451,25 39,250,94 Kết bảng 4.3 cho thấy hợp chất NH3 GL-NH ức chế hình thành khối u Hợp chất NH3 ức chế rõ rệt cả, mật độ hình thành khối u giảm 58,33% kích thước trung bình khối u giảm 55,18 % so với đối chứng 4.2 Nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học nấm hầu thủ 4.2.1 Tách phân đoạn đánh giá hoạt tính chống ung thư Quả thể nấm hầu thủ khô chiết tách phân đoạn miêu tả sơ đồ 3.4 (mục 3.2.1) Từ dịch chiết cồn tách phần chiết (cặn n-hexan, cặn etyl axetat, cặn butanol) Từ bã nấm chiết tách 03 phân đoạn polysaccharide (P1-HT, P2-HT, P3-HT) Ngoài ra, từ dịch lên men nấm hầu thủ tách phân đoạn polysaccharide P4-HT (xem mục 3.2.2) Các phân đoạn polysaccharide thô xác định hàm lượng polysaccharide Kết trình bày bảng 4.4 Bảng 4.4 Polysaccharide phân đoạn tách chiết nấm hầu thủ nấm hương Nấm Nấm hầu thủ Dịch thể (g/L) (P4) 3,6 (1,52) Chiết nước nóng (P1) (2,5) 100 g thể Chiết axit (P2) 1,5 (1,2) Chiết kiềm (NaOH 1M) (P3) 16,0 (12,1) Lượng polysaccharide thô 100 g mẫu nấm khô (hoặc 1L dịch thể) Số ngoặc: hàm lượng polysaccharide 100 g mẫu nấm khô (hoặc 1L dịch thể) 16 Tất phân đoạn đánh giá hoạt tính gây độc tế bào kháng u thạch Kết cho thấy cho thấy cặn n-hexan polysaccharide P3-HT biểu khả ức chế hình thành khối u với mật độ hình thành khối u giảm tương ứng 47,93 30,35% kích thước trung bình khối u giảm tương ứng 44,49 33,63% so với đối chứng Cặn chiết n-hexan tiến hành phân lập sắc ký cột lặp lại silica gel pha thường sephadex với hệ dung môi thích hợp (sơ đồ 3.5) thu hợp chất HT1 HT2 Từ phân đoạn P3-HT tiến hành tinh chế theo sơ đồ 3.6 thu nhận β-1,3/1,6 glucan tinh (GL-HT) (xem mục 3.2.4) 4.2.2 Cấu trúc hợp chất phân lập từ nấm hầu thủ Hợp chất HT1: axit stearic Hợp chất HT1 thu dạng rắn, tinh thể màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 69,6C H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz, ppm)  11,91 (1H, s (broad), COOH); 2,18 (2H, m, H-2); 1,47 (2H, m, H-3); 1,23 (28H, s, H-4 – H17); 0,85 (3H, t, J = 6,5 Hz, H-18) 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz, ppm)  174,4 (C-1); 33,7 (C-2); 31,3 (C-3); 29,1 (C4, C-5, C-6, C-7, C-8, C-9, C-10, C-11); 29,0 (C-12); 28,9 (C-13), 28,8 (C-14); 28,6 (C-15); 24,5 (C-16); 22,1 (C-17); 13,9 (C-18) Hợp chất HT2 - Ergosterol peroxide Chất tinh thể hình kim màu trắng, điểm chảy 181-183oC, phổ khối lượng ESI-MS: m/z 429,3 [M + H]+ (C28H44O3, M = 426) H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm) : 1,58 (1H, m, Ha-1), 1,86 (1H, m, Hb-1), 1,71 (1H, m, Ha-2), 1,96 (1H, m, Hb-2), 3,97 (1H, m, H-3), 1,27 (1H, m, Ha-4), 1,97 (1H, m, Hb-4), 6,24 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6), 6,50 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-7), 1,51 (1H, m, H-9), 1,41 (1H, m, Ha-11), 1,62 (1H, m, Hb-11), 1,55 (1H, m, Ha-12), 2,11 (1H, m, Hb-12), 1,58 (1H, m, H-14), 1,25 (1H, m, Ha-15), 1,53 (1H, m, Hb-15), 1,37 (1H, m, Ha-16), 1,78 (1H, m, Hb-16), 1,24 (1H, m, H-17), 0,86 (3H, s, H-18), 0,88 (3H, s, H-19), 2,03 (1H, m, H-20), 1,01 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-21), 5,14 (1H, dd, J = 8,5, 15,5 Hz, H-22), 5,22 (1H, dd, J = 8,5, 15,5 Hz, H-23), 1,87 (1H, m, H-24), 1,50 (1H, m, H-25), 0,88 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-26), 0,83 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-27) 0,91 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-28) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm): 30,13 (C-1), 34,71 (C-2), 66,47 (C-3), 39,36 (C4), 82,16 (C-5), 135,21 (C-6), 130,75 (C-7), 79,43 (C-8), 51,12 (C-9), 36,98 (C-10), 20,64 (C-11), 39,71 (C-12), 44,57 (C-13), 51,70 (C-14), 23,41 (C-15), 28,64 (C-16), 56,22 (C-17), 12,88 (C-18), 18,18 (C-19), 39,71 (C-20), 20,88 (C-21), 135,42 (C-22), 132,33 (C-23), 42,78 (C-24), 33,07 (C-25), 19,64 (C-26), 19,94 (C-27), và17 ,56 (C-28) Hợp chất HT3 - Cerebroside B Chất bột màu trắng, điểm chảy 180-190oC, phổ khối lượng ESI-MS: m/z 726,6 [MH]+, m/z 750,5 [M+Na]+, m/z 728,3 [M+H]+, m/z 710,5 [M-H2O+H]+, m/z 548,3 [Mglucose+H]+ (C41H77NO9, M = 727) H-NMR (500 MHz, CD3OD, ppm) 3,73 (1H, Ha-1), 4,13 (1H, Hb-1), 4,01 (1H, H-2), 4,16 (1H, H-3), 5,50 (1H, dd, J = 7,0, 15,5 Hz, H-4), 5,76 (1H, dt, J = 15,5, 6,0 Hz, H-5), 2,07 (2H, H-6), 2,10 (2H, H-7), 5,17 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-8), 2,00 (1H, H-10), 1,43 (1H, H11), 1,31 (2H, H-16), 1,33 (2H, H-17), 0,92 (3H, t, J = 7,0 Hz, H-18) 1,62 (3H, s, H-19), 4,01 (1H, H-2’), 1,57 (1H, Ha-3’), 1,74 (1H, Hb-3’), 1,44 (2H, H-4’), 1,31 (2H, H-14’), 1,33 (2H, 17 H-15’), 0,92 (3H, t, J = 7,0 Hz, H-16’), 4,29 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1”), 3,22 (1H, H-2”), 3,37 (1H, H-3”), 3,31 (1H, H-4”), 3,30 (1H, H-5”), 3,69 (1H, Ha-6”) 3,89 (1H, dd, J = 2,0, 11,5 Hz, Hb-6”) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD, ppm) 70,13 (C-1), 55,01 (C-2), 73,29 (C-3), 131,51 (C4), 135,04 (C-5), 34,02 (C-6), 29,09 (C-7), 125,22 (C-8), 137,18 (C-9), 41,18 (C-10), 29,52 (C-11), 30,79-31,24 (C-12 đến 15), 33,49 (C-16), 24,15 (C-17), 14,86 (C-18), 16,53 (C-19), 177,60 (C-1’), 73,49 (C-2’), 36,28 (C-3’), 26,57 (C-4’), 30,79 (C-5’), 31,24 (C-13’), 33,49 (C-14’), 24, 15 (C-15’), 14,86 (C-16’), 105,13 (C-1”), 75,39 (C-2”), 78,31 (C-3”), 71,97 (C4”), 78,38 (C-5”) 63,08 (C-6”) Hợp chất HT4 - Hericenone D Chất kết tinh màu trắng, điểm chảy 41-43oC, phổ khối lượng ESI-MS: m/z 599,2 [M + H]+, m/z 597,4 [M - H]- (C37H58O6, M = 598) H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm) H: 6,53 (1H, s, H-6), 5,32 (2H, s, H-7), 10,11 (1H, s, H-8), 3,91 (3H, s, H-9), 3,40 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-1’), 5,32 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-2’), 3,00 (2H, s, H-4’), 6,09 (1H, t, J = 1,0, 1,5 Hz, H-6’), 1,84 (3H, d, J = 1,5 Hz, H-8’), 2,12 (3H, d, J = 1,0 Hz, H-9’), 1,78 (3H, d, J = 0,5 Hz, H-10’), 2,33 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-2”), 1,62 (2H, m, H-3”), 1,25 (26H, m, H-4”-17”), 0,88 (3H, m, H-18”) và12,37 (1H, s, OH) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm) C: 138,70 (C-1), 112,91 (C-2), 162,94 (C-3), 117,33 (C-4), 163,49 (C-5), 105,55 (C-6), 62,90 (C-7), 193,10 (C-8), 55,93 (C-9), 21,62 (C1’), 126,27 (C-2’), 130,35 (C-3’), 55,55 (C-4’), 199,54 (C-5’), 122,85 (C-6’), 155,42 (C-7’), 27,66 (C-8’), 20,67 (C-9’), 16,41 (C-10’), 173,20 (C-1”), 34,25 (C-2”), 24,89 (C-3”), 29,13 (C-4’’), 31,94 (C-17”) 14,12(C-18”) Hợp chất HT5 - Ergosterol Chất tinh thể hình kim màu trắng, điểm chảy 168oC, phổ khối lượng ESI-MS: m/z 397,3 [M + H]+ (C28H44O, M = 396) H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm) H: 1,25 (1H, m, H-1a), 1,75 (1H, m, H-1b), 1,50 (1H, m, Ha-2), 1,78 (1H, m, Hb-2), 3,63 (1H, m, H-3), 2,28 (2H, t, J = 13,5 Hz, H-4), 5,56 (1H, dd, J = 2,0, 5,5 Hz, H-6), 5,38 (1H, m, H-7), 1,97(1H, m, H-9), 1,65 (1H, m, H-11), 1,34 (1H, m, Ha-12), 1,90 (1H, m, Hb-12), 1,92 (1H, m, H-14), 1,67 (1H, m, H-15), 1,28 (1H, m, Ha-16), 1,74 (1H, m, Hb-16), 1,25 (1H, m, H-17), 0,63 (3H, s, H-18), 0,95 (3H, s, H-19), 2,05 (1H, m, H-20), 1,03 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21), 5,17 (1H, dd, J = 8,5, 15,5 Hz, H-22), 5,22 (1H, dd, J = 8,5, 15,5 Hz, H-23), 1,76 (1H, m, H-24), 1,38 (1H, m, H-25), 0,84 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-26), 0,82 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-27) 0,91 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-28) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm) C: 38,39 (C-1), 32,02 (C-2), 70,47 (C-3), 40,83 (C-4), 141,36 (C-5), 119,60 (C-6), 116,30 (C-7), 139,80 (C-8), 46,27 (C-9), 37,04 (C-10), 21,13 (C-11), 39,11 (C-12), 42,41 (C-13), 54,57 (C-14), 23,01 (C-15), 28,29 (C-16), 55,76 (C-17), 12,06 (C-18), 16,30 (C-19), 40,82 (C-20), 21,11 (C-21), 135,60 (C-22), 131,99 (C23), 42,85 (C-24), 33,10 (C-25), 19,66 (C-26), 19,96 (C-27) 17,62 (C-28) Hợp chất HT6 - β-Adenosine Chất tinh thể hình kim màu trắng, điểm chảy 234-235oC, phổ khối lượng ESI-MS: m/z 267,8 [M + H]+, 289,8 [M + Na]+ (C10H13N5O4, M = 267) H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, ppm) H: 8,14 (1H, s, H-2), 8,34 (1H, s, H-8), 5,88 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-1’), 4,61 (1H, dd, J = 4,0, 10,5, H-2’), 4,15 (1H, br s, H-3’) 3,97 (1H, dd, J = 3,5, 6,5 Hz, H-4’), 3,57 (1H, m, H-5’a), 3,68 (1H, m, H-5’b), 7,32 (2H, s, NH2), 5,42 (1H, OH-2’), 5,17 (1H, d, J = 3,0, OH-3’) 5,43 (1H, OH-5’) ppm 18 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, ppm) C: 152,41 (C-2), 149,08 (C-4), 119,37 (C-5), 156,17 (C-6), 139,95 (C-8), 87,95 (C-1’), 73,47 (C-2’), 70,68 (C-3’), 85,92 (C-4’), 61,69 (C-5’) Hợp chất GL-HT: β- 1,3/1,6 glucan Qua hình phổ 13C-NMR cho thấy có 10 tín hiệu nguyên tử C chính: tín hiệu C = 103,4 103,1 biểu thị C1 chuỗi thẳng C1’ glucose nhánh, tín hiệu C = 86,3 biểu thị C3 (chuỗi thẳng) chuỗi thẳng Hai giá trị chứng tỏ có liên kết β-glucosidic polymer, tín hiệu C = 61,1 biểu thị C6, tín hiệu C =68,57 biểu thị C4, tín hiệu C = 73,0 biểu thị C2, C =76,9 biểu thị cho C5 glucose chuỗi thẳng C =70,2 biểu thị C6s (substituted, thay thế) 13 Hợp chất HT1: axit stearic Hợp chất HT2: Ergosterol peroxide 28 21 26 22 Hợp chất HT3 - Cerebroside B OH 6" OH 4" O 5" HO 19 3" 2" OH 1" 15 13 11 14 12 10 14 3' 1' O 2' 9' 7' 5' 4' 8' 6' 13' 11' 10' 12' 16' 22 9' 24 11 OH 5' 1' 3' 23 25 17 O 8' 27 13 19 10' O 7' 26 20 18 O Hợp chất HT4 - Hericenone D 28 21 O HO Hợp chất HT5 - Ergosterol 15 10 15' 14' OH 27 16 18 16 NH 25 23 17 13 11 18 17 O HO 12 24 20 19 2" O O 1" (CH2)14 3" 18" O 14 10 HO Hợp chất GL-HT: β- 1,3/1,6 glucan Hợp chất HT6 - β-Adenosine NH2 N N N N HO 5' O H 4' H 3' OH H 2' 1' H OH 4.2.3 Đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất phân lập từ nấm hầu thủ Các hợp chất phân lập từ nấm hầu thủ đánh giá hoạt tính gây độc tế bào khả ức chế hình thành khối u in vitro Kết trình bày bảng 4.5 VÀ 4.6 Bảng 4.5 Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập từ nấm Hầu thủ Nồng độ Dòng tế bào ST Ký hiệu mẫu Phần trăm sống sót (%) T mẫu (g/ml) Hep-G2 Fl RD Lu DMSO Chứng (+) 100  0,0 100  0,0 100  0,0 100  0,0 2,1 0,07 1,7 0,4 0,3  0,02 5,20,4 19 HT1 HT2 10 10 98,60,9 19,90,3 99,21,6 17,40,5 96,81,1 29,40,9 99,81,9 45,21,2 HT3 10 98,60,7 99,21,5 95,80,9 99,71,8 HT4 10 82,80,7 85,30,5 79,41,2 92,31,5 HT5 10 85,81,4 92,61,2 79,91,8 85,30,9 HT6 10 90,30,6 82,91,3 90,50,8 98,21,4 GL-HT 20 72,81,2 80,91,5 65,90,4 81,50,6 STT Dòng tế bào Gía trị IC50 (g/ml) Ký hiệu mẫu Chứng (+) HT2 Hep-G2 0,22 4,82 Fl 0,27 5,13 RD 0,16 8,79 Lu 0,31 9,11 Kết cho thấy, hợp chất HT2 biểu hoạt tính độc tế bào dòng tế bào thử (ung thư gan-Hep G2, ung thư tử cung, ung thư mô liên kết-RD, ung thư phổi-Lu) với giá trị IC50 4,82; 5,13; 8,79 9,11g/ml Bảng 4.6 Kết thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u tế bào ung thư gan HepG2 thạch mềm hợp chất Kích thước trung bình Nồng độ Độ giảm mật khối u mẫu thử Kí hiệu mẫu độ khối u Đường kính % giảm so với (% ) (g/mL) (µm) đối chứng Chứng âm (DMSO 1%) 0 30,450,67 10 HT1 8,03 27,250,96 11,561,12 10 HT2 52,31 14,131,06 55,781,75 HT3 10 28,111,25 7,68 14,70,76 HT4 10 22,820,94 16,30,54 25,06 HT5 10 21,951,34 18,51,26 27,91 HT6 10 24,660,58 19,15 16,90,98 GL-HT 20 17,221,15 45,280,64 43,45 Kết bảng 4.6 cho thấy mẫu HT2 ức chế rõ rệt hình thành khối u với mật độ hình thành khối u giảm 55,78 so với đối chứng kích thước trung bình khối u giảm tương ứng 52,31% so với đối chứng 20 4.3 Nghiên cứu biến đổi β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ thành hoạt chất dễ tan đánh giá hoạt tính chúng 4.3.1 Thủy phân enzyme -1,3-glucanase Enzyme β-1,3 glucanase chuẩn dùng cắt ngắn mạch - glucan từ nấm hầu thủ thu phân đoạn (HT-GL1, HT-GL2, HT-GL3 ) (xem mục 3.2.5 phần thực nghiệm) phân đoạn kiểm tra qua cột Sephadex G-100, thấy có đỉnh polysaccharide riêng rẽ Điều chứng tỏ chúng khác biệt độ dài mạch polymer Các β-1,3/1,6-glucan với trọng lượng phân tử khác gồm HT-GL1, HT-GL2 HT-GL3 dùng đánh giá hoạt tính gây độc tế bào khả ức chế hình thành khối u thạch mềm Kết trình bày bảng 4.7 4.8 Bảng 4.7 Hoạt tính gây độc tế bào β-1,3/1,6-glucan với trọng lượng phân tử khác STT Ký hiệu mẫu DMSO Chứng (+) HT-GL1 HT-GL2 HT-GL3 Nồng độ mẫu (g/ml) 20 20 20 STT Ký hiệu mẫu Chứng (+) HT-GL1 HT-GL2 HT-GL3 Hep-G2 0,31 13,56 15,73 >20 Dòng tế bào Phần trăm sống sót (%) Hep-G2 Lu RD 100  0,0 100  0,0 100  0,0 0,5  0,04 0,9  0,0 0,2  0,1 75,71,1 39,30,4 35,20,7 62,30,07 44,71,1 38,90,3 52,80,2 69,30,1 50,70,9 Dòng tế bào Giá trị IC50 (g/ml) Lu 0,34 >20 >20 >20 RD 0,17 14,25 17,68 >20 Kết cho thấy mẫu HT-GL1 HT-GL2 biểu hoạt tính gây độc với dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) ung thư mô liên kết (RD) với giá trị IC50 13,56 14,25 g/mL, 15,73 17,68 g/mL Bảng 4.8 Kết thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u thạch mềm β-1,3/1,6glucan có trọng lượng phân tử khác Kích thước trung bình khối u Độ giảm mật Nồng độ mẫu Kí hiệu mẫu % giảm so với độ khối u so với thử (g/ml) Đường kính (µm) đối chứng(% ) đối chứng Đối chứng âm 0 30,450,67 (DMSO 1%) HT-GL1 20 12,270,92 59,70 59,721,58 HT-GL2 20 13,451,21 55,83 56,121,67 HT-GL3 20 15,170,56 50,18 49,420,62 21 Kết bảng 4.8 cho thấy mẫu biểu hoạt tính ức chế hình thành khối u thạch mềm Tuy nhiên, mẫu GL1 GL2 ức chế rõ rệt hình thành khối u với mật độ hình thành khối u giảm tương ứng 59,72 56,12% so với đối chứng kích thước trung bình khối u giảm tương ứng 59,70 55,83 % so với đối chứng Đáng ý sản phẩm có độ tan hoạt tính tốt so với sản phẩm ban đầu 4.3.2 Dùng β-1,3/1,6-glucan từ nấm hầu thủ làm chất mang curcumin Nghiên cứu chế tạo hệ Cur-Glu nhằm làm tăng độ tan glucan curcumin nước Sản phẩm curcumin β-1,3/1,6-glucan hòa tan nước thể tính tan tốt tạo thành dung dịch có màu vàng suốt, kích thước hạt 50 nm Hiệu suất phản ứng mang Cur Glu 100-20/100 = 80% Phần dung dịch Cur-Glu thu được đem đông khô thu Cur Glu dạng bột có kích thước 50 nm Cấu trúc, hình thái học Cur-Glu Đo phổ hấp thụ điện tử Cur-Glu máy VARIAN spectrophotometer Carry 5000 UV-Vis-NIR phổ huỳnh quang cho thấy có tương tác curcumin với polysacaride β-1,3 D-glucan Trên phân tử Cur Glu có nhiều nhóm OH- nên phân tử tương tác với theo liên kết hydro Ảnh FeSEM cho thấy kích cỡ Glu lớn (khoảng 6–10µm), chứng tỏ mạch dài Cur tồn dạng hình que, kích thước khoảng 800 nm Khi tương tác với nhau, Glu mang Cur tạo thành hạt kích thước 50 nm Với kích thước này, hấp thụ Cur-Glu vào thể trở nên dễ dàng Hình ảnh huỳnh quang Cur Cur-Glu cho thấy hạt Cur Cur-Glu cho độ phát quang mạnh, độ tương phản độ phân giải cao Tính chất phát quang vật liệu gợi ý khả ứng dụng vật liệu việc chữa trị ung thư mà cho trình đánh dấu sinh học Hoạt tính β-1,3 D-glucan bao curcumin Thử nghiệm gây độc tế bào sản phẩm Cur, glucan hỗn hợp phối trộn Cur-Glu không biểu hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan (HepG2) nuôi cấy in vitro Tuy nhiên, thử nghiệm khả ức chế hình thành u có khác biệt rõ rệt sản phẩm khả ức chế hình thành u kích thước khối u Các kết tổng kết bảng 4.9 Bảng 4.9 Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào hoạt tính ức chế tạo u thạch mềm sản phẩm dòng tế bào HepG2 Mẫu thử Nồng HT gây độc tế bào Tỷ lệ tạo u Kích thước khuẩn lạc độ ban (% tế bào sống thạch mềm so với trung bình giảm so đầu sót) đối chứng (%) với đối chứng (%) Cur 8mg/ml 99,3 ± 0,5 80,0 ± 1,3 20-30 Glu 8mg/ml 93,3 ± 0,9 75,5 ± 1,1 23-30 Cur-Glu 8mg/ml 90,7 ± 0,7 30,2 ± 1,5 40-50 22 Hình ảnh hình thành khối u chiều thạch mềm cho thấy hiệu ức chế rõ rệt hỗn hợp Cur-glu với tỷ lệ 4:1 lên hình thành khối u dòng tế bào thạch mềm đáng ý gắn đựợc vào tế bào làm cho tế bào phát quang Mặc dù sản phẩm curcumin, β-glucan Cur-Glu không biểu hoạt tính gây độc tế bào dòng Hep-G2, hiệu ức chế rõ rệt Cur-Glu với tỷ lệ 4:1 lên hình thành khối u dòng tế bào thạch mềm 4.4 Thử nghiệm tác dụng dược lý chế phẩm HG1 động vật thực nghiệm Từ β-glucan nấm hầu thủ tạo sản phẩm HG1 (xem mục 3.3 phần thực nghiệm) Các sản phẩm thử nghiệm động vật Kết cho thấy:  Độc tính cấp diễn: Với mức thể tích lớn đưa vào dày chuột nhắt trắng tương đương liều 24 g/kg TLCT chuột, chưa gây chết chuột  Độc tính bán trường diễn: Với mức liều 1.0 30.0 g/kg/24h dùng uống liên tục tuần chuột nhắt: không ảnh hưởng đến trọng lượng thể khối lượng quan gan, lách, thận; Không tác động độc tế bào máu; Không ảnh hưởng đến chức gan, thận; Không ảnh hưởng đến thông số điện tim thỏ Được coi an toàn động vật thử nghiệm  Tác dụng bảo vệ gan: Với mức liều 1,0 g/kg TLCT/24h chuột nhắt, HG1 có tác dụng làm giảm hoạt độ enzym gan AST, ALT γGT, so sánh nhóm thử nhóm chứng, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p>0.05  Tác dụng hệ miễn dịch: Với mức liều 1,0 g 3,0 g/kg TLCT/24h chuột nhắt: Có tác dụng tăng cường trình tổng hợp protein động vật thực nghiệm Đặc biệt với liều thấp 1,0 g/kg TLCT dùng bán trường diễn, khác biệt trước sau thí nghiệm có ý nghĩa thống kê (p0.05); Phản ứng mẫn muộn nhóm chuột nhắt trường hợp chiếu xạ sau cho uống HG1 liều 1.0g/kg TLCT, so sánh nhóm chứng nhóm thử sau 24h, 48h, 72h 96h, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p[...]... khối u giảm 58,33% và kích thước trung bình của khối u giảm 55,18 % so với đối chứng 4.2 Nghiên c u hóa học và hoạt tính sinh học của nấm h u thủ 4.2.1 Tách phân đoạn và đánh giá hoạt tính chống ung thư Quả thể nấm h u thủ khô được chiết và tách phân đoạn như mi u tả ở sơ đồ 3.4 (mục 3.2.1) Từ dịch chiết cồn đã tách được 3 phần chiết (cặn n-hexan, cặn etyl axetat, cặn butanol) Từ bã nấm chiết tách. .. Rene Ullrich, Martin Hofrichter (2010) Nghiên c u nuôi trồng một số loài nấm ăn và nấm dược li u Việt Nam, thu nhận, chuyển hóa và khảo sát hoạt tính kháng u thực nghiệm các polysaccarit của chúng Hội nghị khoa học kỉ niệm 35 năm Viện KH&CNV 1975-2010, ti u ban: Các chất có hoạt tính sinh học, tr 75-82 4 Le Mai Huong, Ha Phuong Thu, Nguyen Thi Bich Thuy, Tran Thi Hong Ha, Ha Thi Minh Thi, Mai Thu Trang,... sự hấp thụ của Cur-Glu vào cơ thể sẽ trở nên dễ dàng hơn Hình ảnh huỳnh quang của Cur và Cur-Glu cho thấy những hạt Cur và Cur-Glu đ u cho độ phát quang mạnh, độ tương phản và độ phân giải cao Tính chất phát quang của vật li u gợi ý khả năng ứng dụng vật li u này không những trong việc chữa trị ung thư mà còn có thể cho quá trình đánh d u sinh học Hoạt tính của β-1,3 D-glucan bao curcumin Thử nghiệm... c u trúc theo đinh hướng hoạt tính ức chế sự hình thành khối u trong môi trường thạch của các hợp chất từ nấm hương 4.1.1 Tách các phân đoạn và đánh giá hoạt tính sinh học Quả thể nấm hương khô được chiết và tách phân đoạn như mi u tả ở sơ đồ 3.1 (mục 3.1.1) Từ dịch chiết cồn đã tách được: 01 chất kết tinh NH1 và 3 phần chiết gồm: cặn n-hexan, cặn ethyl axetat, cặn butanol Từ bã nấm 03 phân đoạn polysaccharide... trong nước Sản phẩm curcumin β-1,3/1,6-glucan khi hòa tan trong nước thể hiện tính tan tốt và tạo thành dung dịch có m u vàng trong suốt, kích thước hạt 50 nm Hi u suất của phản ứng mang Cur bởi Glu là 100-20/100 = 80% Phần dung dịch Cur-Glu thu được được đem đi đông khô sẽ thu được Cur Glu dạng bột có kích thước 50 nm C u trúc, hình thái học của Cur-Glu Đo phổ hấp thụ điện tử của Cur-Glu bằng máy VARIAN... ra, từ dịch lên men nấm h u thủ tách được phân đoạn polysaccharide P4-HT (xem mục 3.2.2) Các phân đoạn polysaccharide thô cũng được xác định hàm lượng polysaccharide Kết quả được trình bày ở bảng 4.4 Bảng 4.4 Polysaccharide trong các phân đoạn tách chiết nấm h u thủ và nấm hương Nấm Nấm h u thủ Dịch thể (g/L) (P4) 3,6 (1,52) Chiết nước nóng (P1) 6 (2,5) 100 g quả thể Chiết axit (P2) 1,5 (1,2) Chiết. .. Lê Mai Hương, Nguyễn Thị Bích Thủy, Trần Thị Hồng Hà, Trần Thị Như Hằng, Đỗ H u Nghị, Hà Phương Thư, Nguyễn Xuân Phúc, Mai Thu Trang, Đỗ Hùng Mạnh, Rene Ullrich, Martin Hofrichter (2010) Khảo sát hoạt tính ức chế tạo u nuôi cấy 3 chi u trên thạch mềm của sản phẩm curcumin được bao bọc bởi 1,3-β-Glucan tách chiết từ nấm H u thủ Việt Nam Tạp chí KH & CN, tập 48, số 4A, tr 216-224 2 Nguyễn Bích Thuỷ, Lê... khối u với mật độ hình thành khối u giảm tương ứng là 59,72 và 56,12% so với đối chứng và kích thước trung bình của khối u giảm tương ứng là 59,70 và 55,83 % so với đối chứng Đáng chú ý hơn cả là 2 sản phẩm này có độ tan và hoạt tính tốt hơn so với sản phẩm ban đ u 4.3.2 Dùng β-1,3/1,6-glucan từ nấm h u thủ làm chất mang curcumin Nghiên c u chế tạo hệ Cur-Glu nhằm làm tăng độ tan của glucan và curcumin... Tran Thi Nhu Hang, Do Huu Nghi, Nguyen Xuan Phuc and Duong Tuan Quang (2011) Preparetion and antitumor-promoting activity of Curcumin encapsulated by 1,3--Glucan isolated from medicinal mushroom Hericium erinaceum Chemistry Letter, vol.40, No8, p 846-848 5 Ha Phuong Thu, Le Mai Huong, Hoang Thi My Nhung, Le Thi thu Huong, Duong Tuan Quang, Tran Thi Hong Ha, Tran Dai Lam and Nguyen Xuan Phuc (2012)... 1 ngày sau khi cấy khối u Sử dụng kỹ thuật MRI để ước tính khả năng kiềm hãm khối u Ehrlich sau mỗi 2 ngày kể từ ngày thứ 7 sau khi cấy với tế bào ung thư (ở nhóm đối chứng và nhóm thử nghiệm) Chuột được gây mê với xylazine (13 mg/kg trọng lượng cơ thể) CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nghiên c u hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hương Phần này trình bày về cách phân lập và xác định c u trúc theo ... sinh học nấm h u thủ Phần trình bày cụ thể cách thức phân lập chất từ nấm h u thủ 3.2.1 Phân lập hợp chất từ thể nấm h u thủ Nấm h u thủ khô (2 kg) Chiết si u âm với EtOH 95% Dịch Cặn nấm Nước (100C)... nghiên c u hóa học hoạt tính sinh học nấm dược li u CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 Đối tượng nghiên c u 2.1.1 Nấm hương Chủng nấm hương (Lentinula edodes (Berk.) Sing.) l u. .. luận án nấm h u thủ (Hericium erinaceus) nấm hương (Lentinula edodes), với nội dung chủ y u sau: Tách chiết số hợp chất trao đổi thứ cấp, polysaccharide gi u glucan từ thể nấm Đánh giá hoạt tính