Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TINH SẠCH ENDOGLUCANASE TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN ACHROMOBACTER XYLOSOXIDANS BM13 BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION ÂM CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN: ThS VÕ VĂN SONG TOÀN VÕ TRUNG NGHĨA PGS TS TRẦN NHÂN DŨNG MSSV: 3102837 LỚP: CNSH TT K36 Cần Thơ, tháng năm 2015 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TINH SẠCH ENDOGLUCANASE TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN ACHROMOBACTER XYLOSOXIDANS BM13 BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION ÂM CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN: ThS VÕ VĂN SONG TOÀN VÕ TRUNG NGHĨA PGS TS TRẦN NHÂN DŨNG MSSV: 3102837 LỚP: CNSH TT K36 Cần Thơ, tháng năm 2015 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS Võ Văn Song Toàn Võ Trung Nghĩa CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS TS Trần Nhân Dũng XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG Cần Thơ, ngày tháng năm 2015 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ  -Trong suốt trình thực đề tài luận văn tốt nghiệp bên cạnh cố gắng thân, nhận động viên khích lệ to lớn vật chất lẫn tinh thần từ gia đình, quan tâm hướng dẫn, giúp đỡ từ thầy cô bạn bè Đó động lực giúp vượt qua khó khăn để hoàn thành đề tài nghiên cứu Xin gửi lời cảm ơn đến thầy PGS TS Trần Nhân Dũng, thầy Ths Võ Văn Song Toàn, hai thầy cố vấn tạo điều kiện thuận lợi tận tụy hướng dẫn hoàn thành đề tài Xin gửi lời tri ân sâu sắc đến quý thầy Xin gửi lời cám ơn chân thành đến thầy TS Nguyễn Đức Độ, tất quý thầy cô Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học tận tình truyền đạt, giúp đỡ có kiến thức hữu ích phục vụ cho việc thực đề tài Xin chân thành cám ơn bạn sinh viên Ngô Thùy Dương lớp CNSHTT K36, Nguyễn Lê Bảo Trân lớp CNSHTT K36, em sinh viên lớp CNSH K37, VSV K3 bạn sinh viên phòng thí nghiệm Công Nghệ Enzyme, Sinh Hóa nhiệt tình giúp đỡ chia sẻ nhiều kinh nghiệm quý báu suốt thời gian học tập thực đề tài Xin gửi lời cám ơn chân thành đến cố vấn học tập cô Trần Thị Xuân Mai động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành đề tài Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình người thân động viên, khích lệ ủng hộ mặt vật chất tinh thần suốt thời gian qua để vững tin hoàn thành đề tài Cuối lời, kính chúc người mạnh khỏe, hạnh phúc, vui vẻ thành đạt Xin trân trọng cám ơn! Cần Thơ, ngày 01 tháng 05 năm 2015 Võ Trung Nghĩa  Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Đề tài “Tinh endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans BM13 phương pháp sắc ký trao đổi ion âm Uno Sphere Q” thực nhằm mục tiêu khảo sát phương pháp kết tủa hiệu tinh endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans BM13 Dịch vi khuẩn BM13 nuôi cấy môi trường bổ sung chất bã mía sau ủ kị khí 38oC ngày ly tâm để thu enzyme ngoại bào Từ 700 ml dịch enzyme ngoại bào ban đầu với protein tổng 28,2 mg hoạt tính tổng 985,2 U, dịch enzyme tủa phân đoạn với ammonium sulfate (AS), tủa với dung môi hữu ethanol acetone Kết cho thấy phương pháp tủa phân đoạn với AS hiệu hiệu suất thu hổi đạt cao bị biến tính enzyme Trong đó, phân đoạn 50 – 80% AS phân đoạn hiệu protein tổng hoạt tính tổng endoglucanase đạt 7,38 mg; 672,2 U Phân đoạn tủa AS từ 50 – 80% giữ lại tinh tiếp tục phương pháp sắc ký trao đổi ion âm gel Uno Sphere Q Dịch enzyme tách phân đoạn FI Phân đoạn FI có hàm lượng protein hoạt tính đặc hiệu 2,8 mg 84,2 U/mg Kết điện di gel SDS-PAGE kết hợp phương pháp nhuộm bạc với độ nhạy cao xác định enzyme tinh có hai băng với trọng lượng phân tử 64,4 kDa 60,4 kDa Toàn trình tinh đạt hiệu suất 38,6% độ tinh tăng lên lần Từ khóa: Achromobacter xylosoxidans BM13, ammonium sulfate, endoglucanase, sắc ký trao đổi ion âm Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang TÓM LƯỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH HÌNH v DANH SÁCH BẢNG vi TỪ VIẾT TẮT viii CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .3 2.1 Tổng quan Achromobacter xylosoxidans 2.1.1 Lịch sử phát .3 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Đặc điểm Achromobacter xylosoxidans 2.2 Tổng quan endoglucanase 2.2.1 Enzyme cellulase 2.2.2 Cấu trúc endoglucanase 2.2.3 Cơ chế thủy phân endoglucanase .8 2.2.4 Ảnh hưởng yếu tố môi trường đến hoạt tính endoglucanase .8 2.2.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ .8 2.2.4.2 Ảnh hưởng pH .9 2.2.4.3 Ảnh hưởng ion kim loại 2.2.4.4 Tính đặc hiệu chất endoglucanase 2.2.4.5 Một số tính chất khác endoglucanase 10 2.3 Các phương pháp nghiên cứu 10 2.3.1 Trích ly protein .10 2.3.1.1 Phương pháp ly tâm 10 2.3.1.2 Phương pháp lọc 11 2.3.2 Phương pháp tủa protein .11 2.3.2.1 Phương pháp tủa muối 11 2.3.2.2 Phương pháp tủa dung môi hữu 12 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT 2.3.2.3 Phương pháp tủa điểm đẳng điện 13 2.3.3 Phương pháp sắc ký trao đổi ion 14 2.3.4 Phương pháp điện di gel polyacrylamide (SDS – PAGE) 16 2.3.5 Các phương pháp phân tích protein 18 2.3.5.1 Khảo sát hàm lượng protein phương pháp Bradford 18 2.3.5.2 Khảo sát hoạt tính protein 19 a Định tính protein vòng tròn đường kính thủy phân 19 b Định lượng hoạt tính phương pháp Nelson - Somogyi 19 2.4 Tình hình nghiên cứu nước 20 2.4.1 Trong nước 20 2.4.2 Ngoài nước 21 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Phương tiện nghiên cứu 22 3.1.1 Thời gian địa điểm 22 3.1.2 Nguyên, vật liệu 22 3.1.3 Dụng cụ, thiết bị 22 3.1.4 Hóa chất 22 3.1.5 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 23 3.2 Phương pháp nghiên cứu 24 3.2.1 Tinh endoglucanase phương pháp tủa phân đoạn với ammonium sulfate .24 3.2.2 Tinh endoglucanase phương pháp tủa với ethanol 25 3.2.3 Tinh endoglucanase phương pháp tủa với acetone 26 3.2.4 Tinh endoglucanase phương pháp sắc ký trao đổi ion 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 28 4.1 Tinh endoglucanase phương pháp tủa phân đoạn với ammonium sulfate .28 4.2 Tinh endoglucanase phương pháp tủa với ethanol 32 4.3 Tinh endoglucanase phương pháp tủa với acetone 35 4.4 Tinh endoglucanase phương pháp sắc ký ion âm với gel Uno Sphere Q .39 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .43 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT 5.1 Kết luận 43 5.2 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC PHỤ LỤC CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỤ LỤC KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM PHỤ LỤC KẾT QUẢ THỐNG KÊ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans Hình Phân loại enzyme cellulase Hình Đặc tính thứ tự phân cắt loại enzyme thuộc hệ enzyme cellulase .6 Hình Cấu trúc domain endoglucanase Hình Cấu trúc tâm hoạt động endoglucanase tương tác với chất cellobiose Hình chế thủy phân liên kết β-1,4-glycosidic Hình Ảnh hưởng nồng độ muối tính tan protein 12 Hình Cấu trúc amino acid pH thay đổi 13 Hình Giản đồ thể điểm đẳng điện protein 14 Hình 10 Hai loại hạt gel dùng sắc ký trao đổi ion 15 Hình 11 Sắc ký trao đổi ion 16 Hình 12 Biểu đồ hấp thụ điện tích protein sắc ký trao đổi ion 16 Hình 13 Công thức phân tử Coomassie Brilliant Blue G-250 .19 Hình 14 Hoạt tính phân đoạn tủa với AS phản ứng thủy phân chất CMC 29 Hình 15 ĐKTP phân đoạn tủa với ammonium sulfate 30 Hình 16 Lượng chất CMC bị thủy phân enzyme tủa ethanol 33 Hình 17 Đường kính thủy phân enzyme tủa ethanol 34 Hình 18 Lượng chất CMC bị thủy phân enzyme tủa acetone 35 Hình 19 Đường kính thủy phân enzyme tủa acetone 36 Hình 20 Sắc ký đồ phân đoạn 50 – 80% AS 39 Hình 21 ĐKTP endoglucanase .40 Hình 22 ĐKTP endoglucanase .40 Hình 23 Điện di SDS-PAGE 41 Hình 24 Bảng chuẩn lượng muối ammonium sulfate tủa phân đoạn PL1 Hình 25 Đường chuẩn Bradford PL2 Hình 26 Đường chuẩn Nelson - Somogyi PL2 Hình 27 Đường chuẩn CMC PL2 Hình 28 Đường chuẩn trọng lượng phân tử protein chuẩn PL2 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Thành phần môi trường đặc nuôi cấy vi khuẩn (M1) 23 Bảng 2: Thành phần môi trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn (M2) 23 Bảng 3: Tổng kết trình tinh enzyme phương pháp tủa phân đoạn ammonium sulfate 28 Bảng 4: Endoglucanase tủa với ethanol .32 Bảng 5: Endoglucanase tủa với acetone .35 Bảng 6: So sánh số liệu phương pháp tủa protein 38 Bảng 7: Sắc ký gel Uno Sphere Q 39 Bảng 8: Tóm tắt quy trình tinh 41 Bảng 9: Dựng đường chuẩn BSA PL1 Bảng 10: Pha dung dịch đường chuẩn glucose PL1 Bảng 11: Dựng đường chuẩn glucose PL1 Bảng 12: Dung dịch chạy điện di PL1 Bảng 13: Dung dịch buffer PL1 Bảng 14: Thành phần gel phân tích PL1 Bảng 15: Thành phần gel tập trung PL1 Bảng 16: Giá trị OD 595nm đường chuẩn BSA PL2 Bảng 17: Giá trị OD 520nm đường chuẩn glucose PL2 Bảng 18: Giá trị độ nhớt đường chuẩn CMC PL2 Bảng 19: Số liệu đường tuyến tính trọng lượng phân tử khoảng cách di chuyển protein chuẩn PL2 Bảng 20: Giá trị OD 595nm định lượng protein phân đoạn tủa với ammonium sulfate PL2 Bảng 21: Định lượng protein tủa AS PL2 Bảng 22: Giá trị OD 520nm định lượng hoạt tính phân đoạn tủa với ammonium sulfate PL2 Bảng 23: Định lượng hoạt tính enzyme tủa AS PL2 Bảng 24: Giá trị đường kính thủy phân định tính enzyme tủa AS PL2 Bảng 25: Giá trị độ giảm độ nhớt enzyme tủa AS PL2 Bảng 26: Giá trị OD 595nm định lượng protein phân đoạn tủa ethanol PL2 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT Bảng 23: Định lượng hoạt tính enzyme tủa AS Mẫu Thể tích Hàm lượng glucose Hoạt tính Hoạt tính tổng (ml) (μg/ml) (U/ml) (U) Thô 700 4,22 ± 0,839 1,41 ± 0,280 983 ± 196 50% AS 10,4 46,9 ± 9,75 15,6 ± 3,25 163 ± 33,8 60% AS 13,5 43,7 ± 16,0 14,6 ± 5,32 197 ± 71,8 70% AS 11,1 37,0 ± 10,1 12,3 ± 3,38 137 ± 37,6 80% AS 16,8 37,8 ± 10,8 12,6 ± 3,59 176 ± 50,3 90% AS 19 2,89 ± 1,07 0,963 ± 0,357 18,3 ± 6,79 Bảng 24: Giá trị đường kính thủy phân định tính enzyme tủa AS Mẫu TBĐKTP (mm) ± Stdev Thô 50% AS 60% AS 70% AS 3,17 ± 0,289 4,33 ± 0,577 6,33 ± 0,764 8,33 ± 0,577 80% AS 90% AS 9,33 ± 1,16 4,67 ± 1,16 Bảng 25: Giá trị độ giảm độ nhớt enzyme tủa AS Nồng độ CMC ban đầu: 2,6% Mẫu Thô 50% AS 60% AS 70% AS 80% AS 90% AS 0,110±0,015 0,160±0,026 0,372±0,032 0,321±0,015 0,444±0,012 0,176±0,012 TB CMC bị thủy phân (%) ± Stdev Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT Kết thí nghiệm 2: tinh endoglucanase phương pháp tủa với ethanol Bảng 26: Giá trị OD 595nm định lượng protein phân đoạn tủa ethanol Mẫu H2O (ĐC): 0,850 Tỉ lệ tủa enzyme:ethanol (TBOD595 – ĐC) ± Stdev TBOD595 Thô 0,939 0,089 ± 0,006 Tỉ lệ 1:1 1,073 0,223 ± 0,025 Tỉ lệ 1:2 1,19 0,341 ± 0,012 Tỉ lệ 1:3 1,29 0,435 ± 0,022 Tỉ lệ 1:4 1,30 0,446 ± 0,006 Bảng 27: Định lượng protein tủa ethanol Tỉ lệ tủa Thể tích Hàm lượng protein Protein tổng enzyme:ethanol (ml) (mg/ml) (mg) Thô 600 0,040 ± 0,003 24,2 ± 1,51 Tỉ lệ 1:1 5,5 0,102 ± 0,011 0,558 ± 0,063 Tỉ lệ 1:2 3,5 0,155 ± 0,005 0,543 ± 0,018 Tỉ lệ 1:3 0,198 ± 0,01 0,593 ± 0,03 Tỉ lệ 1:4 2,5 0,203 ± 0,003 0,506 ± 0,007 Bảng 28: Giá trị OD 520nm định lượng hoạt tính phân đoạn tủa ethanol Tỉ lệ tủa enzyme:ethanol TBOD520 ĐC (TBOD520 – ĐC) ± Stdev Thô 0,313 0,003 0,013 ± 0,003 Tỉ lệ 1:1 0,465 0,375 0,081 ± 0,023 Tỉ lệ 1:2 0,473 0,318 0,155 ± 0,044 Tỉ lệ 1:3 0,558 0,323 0,235 ± 0,004 Tỉ lệ 1:4 0,482 0,290 0,192 ± 0,016 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT Bảng 29: Định lượng hoạt tính enzyme tủa ethanol Tỉ lệ tủa Thể tích Hàm lượng glucose Hoạt tính Hoạt tính tổng enzyme:ethanol (ml) (μg/ml) (U/ml) (U) Thô 600 4,22 ± 0,839 1,41 ± 0,280 844 ± 168 Tỉ lệ 1:1 5,5 26,9 ± 7,60 8,96 ± 2,53 49,3 ± 13,9 Tỉ lệ 1:2 3,5 51,8 ± 14,7 17,3 ± 4,89 60,4 ± 17,1 Tỉ lệ 1:3 78,4 ± 1,17 26,1 ± 0,390 78,4 ± 1,17 Tỉ lệ 1:4 2,5 64,1 ± 5,23 21,4 ± 1,74 53,4 ± 4,36 Bảng 30: Giá trị đường kính thủy phân định tính enzyme tủa ethanol Tỉ lệ enzyme:ethanol TBĐKTP (mm) ± Stdev Thô 4,33 ± 0,577 Tỉ lệ 1:1 Tỉ lệ 1:2 Tỉ lệ 1:3 Tỉ lệ 1:4 5,17 ± 0,764 6,33 ± 0,577 8,33 ± 0,577 7,83 ± 0,289 Bảng 31: Giá trị độ giảm độ nhớt enzyme tủa ethanol Nồng độ CMC ban đầu: 2,6% Tỉ lệ enzyme:ethanol Thô Tỉ lệ 1:1 Tỉ lệ 1:2 Tỉ lệ 1:3 Tỉ lệ 1:4 TB CMC bị thủy phân (%) ± 0,110 ± 0,015 0,216 ± 0,018 0,411 ± 0,008 0,681 ± 0,019 0,492 ± 0,008 Stdev Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT Kết thí nghiệm 3: tinh endoglucanase phương pháp tủa với acetone Bảng 32: Giá trị OD 595nm định lượng protein phân đoạn tủa acetone Mẫu H2O (ĐC): 0,850 Tỉ lệ tủa enzyme:acetone (TBOD595 – ĐC) ± Stdev TBOD595 Thô 0,939 0,089 ± 0,006 Tỉ lệ 1:1 1,02 0,168 ± 0,008 Tỉ lệ 1:2 1,16 0,313 ± 0,027 Tỉ lệ 1:3 1,25 0,399 ± 0,011 Tỉ lệ 1:4 1,33 0,478 ± 0,021 Bảng 33: Định lượng protein tủa acetone Tỉ lệ tủa Thể tích Hàm lượng protein Protein tổng enzyme:acetone (ml) (mg/ml) (mg) 600 0,040 ± 0,003 24,2 ± 1,51 Tỉ lệ 1:1 0,076 ± 0,003 0,382 ± 0,017 Tỉ lệ 1:2 3,5 0,142 ± 0,012 0,498 ± 0,043 Tỉ lệ 1:3 3,1 0,181 ± 0,005 0,562 ± 0,016 Tỉ lệ 1:4 0,217 ± 0,009 0,652 ± 0,028 Thô Bảng 34: Giá trị OD 520nm định lượng hoạt tính phân đoạn tủa acetone Tỉ lệ tủa enzyme:acetone TBOD520 ĐC (TBOD520 – ĐC) ± Stdev Thô 0,313 0,003 0,013 ± 0,003 Tỉ lệ 1:1 0,418 0,369 0,049 ± 0,007 Tỉ lệ 1:2 0,483 0,374 0,109 ± 0,023 Tỉ lệ 1:3 0,528 0,363 0,165 ± 0,009 Tỉ lệ 1:4 0,571 0,355 0,216 ± 0,010 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT Bảng 35: Định lượng hoạt tính enzyme tủa acetone Tỉ lệ tủa Thể tích Hàm lượng Hoạt tính Hoạt tính tổng enzyme:acetone (ml) glucose (μg/ml) (U/ml) (U) Thô 600 4,22 ± 0,839 1,41 ± 0,280 844 ± 168 Tỉ lệ 1:1 16,3 ± 2,40 5,44 ± 0,801 27,2 ± 4,01 Tỉ lệ 1:2 3,5 36,4 ± 7,50 12,1 ± 2,50 42,5 ± 8,75 Tỉ lệ 1:3 3,1 54,9 ± 2,87 18,3 ± 0,958 56,7 ± 2,97 Tỉ lệ 1:4 72,0 ± 3,38 24,0 ± 1,13 72,0 ± 3,38 Bảng 36: Giá trị đường kính thủy phân định tính enzyme tủa acetone Tỉ lệ enzyme:acetone TBĐKTP (mm) ± Stdev Thô 4,33 ± 0,577 Tỉ lệ 1:1 Tỉ lệ 1:2 Tỉ lệ 1:3 Tỉ lệ 1:4 4,67 ± 0,577 7,33 ± 0,577 8,77 ± 0,252 9,67 ± 0,577 Bảng 37: Giá trị độ giảm độ nhớt enzyme tủa acetone Nồng độ CMC ban đầu: 2,6% Tỉ lệ enzyme:acetone Thô Tỉ lệ 1:1 Tỉ lệ 1:2 Tỉ lệ 1:3 Tỉ lệ 1:4 TB CMC bị thủy phân (%) ± 0,110 ± 0,015 0,157 ± 0,004 0,419 ± 0,015 0,615 ± 0,009 0,747 ± 0,012 Stdev Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT Kết thí nghiệm 4: tinh endoglucanase phương pháp sắc ký trao đổi ion âm gel Uno Sphere Q Bảng 38: Giá trị OD 280nm phân đoạn sắc ký gel Uno Sphere Q Ống OD280nm Ống OD280nm Ống OD280nm Ống OD280nm 0,092 10 0,183 19 0,072 28 0,425 0,098 11 0,136 20 0,134 29 0,388 0,106 12 0,113 21 0,213 30 0,373 0,161 13 0,098 22 0,223 31 0,330 0,213 14 0,094 23 0,375 32 0,294 0,224 15 0,090 24 0,533 33 0,258 0,227 16 0,091 25 0,579 34 0,234 0,221 17 0,089 26 0,542 35 0,229 0,207 18 0,085 27 0,474 36 0,197 Bảng 39: Giá trị OD 595nm định lượng protein phân đoạn sau sắc ký Mẫu H2O (ĐC): 0,748 Phân đoạn (TBOD595 – ĐC) ± Stdev TBOD595 UB 0,770 0,022 ± 0,024 FI 0,914 0,166 ± 0,004 Bảng 40: Định lượng protein phân đoạn sau sắc ký Phân đoạn Thể tích (ml) Hàm lượng protein Protein tổng (mg/ml) (mg) UB 23 0,01 ± 0,002 0,230 ± 0,052 FI 37 0,075 ± 0,002 2,79 ± 0,067 Bảng 41: Giá trị OD 520nm định lượng hoạt tính phân đoạn sau sắc ký Phân đoạn TBOD520 ĐC (TBOD520 – ĐC) ± Stdev UB 0,149 0,152 F 0,195 0,158 0,043 ± 0,001 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT Bảng 42: Định lượng hoạt tính enzyme sau sắc ký Phân đoạn Thể tích (ml) Hàm lượng Hoạt tính Hoạt tính tổng glucose (μg/ml) (U/ml) (U) UB 23 0 F 37 14,3 ± 2,91 6,37 ± 1,29 236 ± 47,8 Bảng 43: Trọng lượng phân tử băng protein mẫu enzyme tinh Băng Rp (cm) RB (cm) 2,3 2,4 Rf = Rp/RB 4,5 LogMW MW (kDa) 0,511 1,81 64,4 0,533 1,78 60,4 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT PHỤ LỤC KẾT QUẢ THỐNG KÊ Kết thống kê vòng tròn ĐKTP tủa phân đoạn endoglucanase ammonium sulfate Summary Statistics for Vong tron DKTP Cac phan doan tua AS Count Average Standard deviation Coeff of variation Minimum Maximum Range 50% 4.33333 0.57735 13.3235% 4.0 5.0 1.0 60% 6.33333 0.763763 12.0594% 5.5 7.0 1.5 70% 8.33333 0.57735 6.9282% 8.0 9.0 1.0 80% 9.33333 0.57735 6.1859% 9.0 10.0 1.0 90% 4.66667 1.1547 24.7436% 4.0 6.0 2.0 Tho 3.16667 0.288675 9.11606% 3.0 3.5 0.5 Total 18 6.02778 2.34817 38.9558% 3.0 10.0 7.0 ANOVA Table for Vong tron DKTP by Cac phan doan tua AS Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0.0000 Between groups 87.7361 17.5472 Within groups 6.0 12 0.5 Total (Corr.) 93.7361 17 35.09 Multiple Range Tests for Vong tron DKTP by Cac phan doan tua AS Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups Tho 3.16667 X 50% 4.33333 XX 90% 4.66667 X 60% 6.33333 70% 8.33333 X 80% 9.33333 X X Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT Kết thống kê lượng chất CMC bị thủy phân tủa phân đoạn endoglucanase ammonium sulfate Summary Statistics for Luong CMC bi thuy phan Cac phan doan tua AS Count Average Standard deviation Coeff of variation Minimum Maximum Range 50% 0.163333 0.0057735 3.5348% 0.16 0.17 0.01 60% 0.383333 0.0152753 3.98485% 0.37 0.4 0.03 70% 0.326667 0.0208167 6.37245% 0.31 0.35 0.04 80% 0.44 0.01 2.27273% 0.43 0.45 0.02 90% 0.166667 0.011547 6.9282% 0.16 0.18 0.02 Tho 0.103333 0.0152753 14.7825% 0.09 0.12 0.03 Total 18 0.263889 0.129712 49.154% 0.09 0.45 0.36 ANOVA Table for Luong CMC bi thuy phan by Cac phan doan tua AS Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0.0000 Between groups 0.283694 0.0567389 Within groups 0.00233333 12 0.000194444 Total (Corr.) 0.286028 17 291.80 Multiple Range Tests for Luong CMC bi thuy phan by Cac phan doan tua AS Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups Tho 0.103333 X 50% 0.163333 X 90% 0.166667 X 70% 0.326667 60% 0.383333 80% 0.44 X X X Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT Kết thống kê vòng tròn ĐKTP tủa endoglucanase ethanol Summary Statistics for Vong tron DKTP Cac phan doan tua ethanol Count Average Standard deviation Coeff of variation Minimum Maximum Range Mau tho 4.33333 0.57735 13.3235% 4.0 5.0 1.0 Ti le 1:1 5.16667 0.763763 14.7825% 4.5 6.0 1.5 Ti le 1:2 6.33333 0.57735 9.11606% 6.0 7.0 1.0 Ti le 1:3 8.33333 0.57735 6.9282% 8.0 9.0 1.0 Ti le 1:4 7.83333 0.288675 3.68521% 7.5 8.0 0.5 Total 15 6.4 1.64968 25.7762% 4.0 9.0 5.0 ANOVA Table for Vong tron DKTP by Cac phan doan tua ethanol Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0.0000 Between groups 34.7667 8.69167 Within groups 3.33333 10 0.333333 Total (Corr.) 38.1 14 26.07 Multiple Range Tests for Vong tron DKTP by Cac phan doan tua ethanol Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups Mau tho 4.33333 X Ti le 1:1 5.16667 X Ti le 1:2 6.33333 Ti le 1:4 7.83333 X Ti le 1:3 8.33333 X X Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT Kết thống kê lượng chất CMC bị thủy phân tủa endoglucanase ethanol Summary Statistics for Luong CMC bi thuy phan Cac phan doan tua ethanol Count Average Standard deviation Coeff of variation Minimum Maximum Range Mau tho 0.104667 0.0184481 17.6256% 0.089 0.125 0.036 Ti le 1:1 0.214 0.00888819 4.15336% 0.207 0.224 0.017 Ti le 1:2 0.408 0.0087178 2.13672% 0.398 0.414 0.016 Ti le 1:3 0.672 0.019975 2.97247% 0.649 0.685 0.036 Ti le 1:4 0.487667 0.00737111 1.51151% 0.482 0.496 0.014 Total 15 0.377267 0.207846 55.0926% 0.089 0.685 0.596 ANOVA Table for Luong CMC bi thuy phan by Cac phan doan tua ethanol Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0.0000 Between groups 0.602902 0.150725 Within groups 0.00189733 10 0.000189733 Total (Corr.) 0.604799 14 794.41 Multiple Range Tests for Luong CMC bi thuy phan by Cac phan doan tua ethanol Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups Mau tho 0.104667 X Ti le 1:1 0.214 Ti le 1:2 0.408 Ti le 1:4 0.487667 Ti le 1:3 0.672 X X X X Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT Kết thống kê vòng tròn ĐKTP tủa endoglucanase acetone Summary Statistics for Vong tron DKTP Cac ti le tua Acetone Count Average Standard deviation Coeff of variation Minimum Maximum Range Mau tho 4.33333 0.57735 13.3235% 4.0 5.0 1.0 Ti le 1:1 4.66667 0.57735 12.3718% 4.0 5.0 1.0 Ti le 1:2 7.33333 0.57735 7.87296% 7.0 8.0 1.0 Ti le 1:3 8.76667 0.251661 2.87066% 8.5 9.0 0.5 Ti le 1:4 9.66667 0.57735 5.97259% 9.0 10.0 1.0 Total 15 6.95333 2.25922 32.4912% 4.0 10.0 6.0 ANOVA Table for Vong tron DKTP by Cac ti le tua Acetone Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0.0000 Between groups 68.664 17.166 Within groups 2.79333 10 0.279333 Total (Corr.) 71.4573 14 61.45 Multiple Range Tests for Vong tron DKTP by Cac ti le tua Acetone Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups Mau tho 4.33333 X Ti le 1:1 4.66667 X Ti le 1:2 7.33333 Ti le 1:3 8.76667 X Ti le 1:4 9.66667 X X Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT Kết thống kê lượng chất CMC bị thủy phân tủa endoglucanase acetone Summary Statistics for Luong CMC bi thuy phan Cac ti le tua Acetone Count Average Standard deviation Coeff of variation Minimum Maximum Range Mau tho 0.104667 0.0184481 17.6256% 0.089 0.125 0.036 Ti le 1:1 0.157 0.0043589 2.77637% 0.152 0.16 0.008 Ti le 1:2 0.419 0.0150997 3.60374% 0.405 0.435 0.03 Ti le 1:3 0.615 0.00953939 1.55112% 0.606 0.625 0.019 Ti le 1:4 0.747333 0.0120968 1.61867% 0.738 0.761 0.023 Total 15 0.4086 0.259262 63.4512% 0.089 0.761 0.672 ANOVA Table for Luong CMC bi thuy phan by Cac ti le tua Acetone Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0.0000 Between groups 0.939382 0.234846 Within groups 0.00164933 10 0.000164933 Total (Corr.) 0.941032 14 1423.88 Multiple Range Tests for Luong CMC bi thuy phan by Cac ti le tua Acetone Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups Mau tho 0.104667 X Ti le 1:1 0.157 Ti le 1:2 0.419 Ti le 1:3 0.615 Ti le 1:4 0.747333 X X X X Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất đến vận tốc phản ứng phần mềm GraphPad Prism 6.0 Et kcat Km Vmax Std Error kcat Km 95% Confidence Intervals kcat Km Goodness of Fit Degree of Freedom R square Absolute Sum of Square Sy.x Constraints Et Number of point Analyzed 0,025 6,36 5,115 0,159 0,5650 1,469 5,082 to 7,638 1,793 to 8,437 0,9255 0,001664 0,01360 Et = 0,0250 11 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT LÝ LỊCH KHOA HỌC I LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên sinh viên: Võ Trung Nghĩa Ngày, tháng năm sinh: 14/03/1992 Nơi sinh: Quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ Địa nay: 54 Lý Tự Trọng, phường An Cư, quận Ninh Kiều, TP Cân Thơ Điện thoại: 0984311459 Email: nghia102837@student.ctu.edu.vn II QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO Đại học Hệ đào tạo: Chính quy (Chương trình tiên tiến) Ngành đào tạo: Công nghệ Sinh học Nơi đào tạo: Đại học Cần Thơ Trình độ ngoại ngữ Chứng anh văn C quốc gia  Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học [...]... về tinh sạch endoglucanase từ vi khuẩn nhưng tinh sạch enzyme từ dòng vi khuẩn này vẫn còn rất hạn chế; đối với nước ta vấn đề này vẫn còn khá mới mẻ và cũng chưa có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn này Từ đó, đề tài Tinh sạch enzyme endoglucanase từ dịch nuôi cấy Achromobacter xylosoxidans BM13 bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion được tiến hành nhằm khảo sát phương pháp tủa endoglucanase từ vi khuẩn. .. phương pháp sắc ký thường được sử dụng là sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực, sắc ký tương tác kị nước  Sắc ký trao đổi ion a Khái niệm Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích của protein trong dung dịch Nói cách khác, phương pháp này phân tách protein dựa vào tương tác trao đổi ion giữa protein trong dung dịch (nước, dung dịch đệm) (pha động) và các tác Chuyên... dương hay âm Nếu pH < pI thì protein tích điện dương, nếu pH > pI thì protein tích điện âm, đây là cơ sở quan trọng để lựa chọn loại gel thích hợp cho từng loại protein Có 2 loại gel trao đổi ion (Hình 10) + Gel trao đổi ion âm: các nhóm chức mang điện tích dương tương tác trao đổi ion âm với protein mang điện tích âm + Gel trao đổi ion dương: các nhóm chức mang điện tích âm tương tác trao đổi ion dương... lại kết quả Những phương pháp phi cơ học là những phương pháp không dùng đến các tác động vật lý chẳng hạn như phương pháp hóa học, phương pháp sinh học Tuy nhiên đề tài này áp dụng phương pháp để trích lý enzyme và 2 phương pháp chủ yếu được dùng là ly tâm và lọc 2.3.1.1 Phương pháp ly tâm Ly tâm là quá trình tách vật thể rắn ra khỏi dung dịch Trong công nghệ enzyme, ly tâm là phương pháp thường được... bào từ chủng vi khuẩn Achromobacter (Chawla et al., 2008) Điều này càng được củng cố thêm bởi báo cáo của Maharana và Ray (2013) cũng cho biết chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans có khả năng sản sinh endoglucanase ngoại bào Enzyme protease cũng đã từng được trích ly từ vi khuẩn Achromobacter lyticus M497-1 và khảo sát một số đặc điểm (Masaki et al 1986) Bên cạnh đó, vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans. .. kích thích tăng trưởng Indole Acetic Acid (IAA) và cố định đạm của một loại vi khuẩn được phân lập từ rễ chuối vùng đồng bằng sông Cửu Long Kết quả giải mã cho thấy vi khuẩn này đồng hình đến 97% với vi khuẩn Achromobacter sp Một số các nghiên cứu khác cũng cho thấy tính đa dạng hệ enzyme từ vi khuẩn A xylosoxidans Enyme từ vi khuẩn này có khả năng phân giải carbazol trong môi trường nhiễm dioxin với... nhóm vi khuẩn A xylosoxidans (Nguyễn Văn Cách, 2010) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 20 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường ĐHCT 2.4.2 Ngoài nước Cho đến nay các báo cáo về tinh sạch enzyme endoglucanase từ vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans hầu như là chưa có ngay cả trên thế giới Theo báo cáo Sesidharan Sreedevi et al (2013) thì 3 dòng vi khuẩn Achromobacter. .. sạch enzyme cellulase từ vi khuẩn Achromobacter nói riêng và vi khuẩn nói chung, chủ yếu tinh sạch cellulase là tập trung vào đối tượng nấm Tuy nhiên có một số nghiên cứu về đặc tính hệ enzyme của vi khuẩn Achromobacter đã được ghi nhận Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự (2009) nghiên cứu về khả năng phân hủy chất 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) từ một số chủng vi khuẩn trong đó có Achromobacter xylosoxidans Kết quả... cứu phân giải phosphate vô cơ với một số chủng vi khuẩn trong đó có vi khuẩn Achromobacter sp được nuôi cấy trong môi trường có nồng độ muối từ 0 – 5% Theo đó, 3 dòng vi khuẩn Achromobacter sp được sử dụng đều cho thấy có khả năng phát triển ở nồng độ muối từ 0 - 2% Bên cạnh đó, lượng phosphate khó tan được phân giải bởi 3 dòng vi khuẩn này cao nhất đạt từ 500 – 600 (g/l) Nghiên cứu của Nguyễn Thị Quỳnh... 2.3.3 Phương pháp sắc ký trao đổi ion Sắc ký là quá trình phân tách các chất trong hỗn hợp (khí hoặc lỏng) gồm nhiều chất khác nhau Phương pháp này được giới thiệu lần đầu vào những năm đầu 1900 bởi Mikhail Tsvet Trong sắc ký người ta phân biệt pha tính và pha động Theo đó, pha tĩnh là chất lỏng hoặc các hạt nhỏ có mang điện tích được nhồi vào trong cột có tác dụng giữ vật chất lại và có khả năng thay đổi ... ký trao đổi ion âm Uno Sphere Q” thực nhằm mục tiêu khảo sát phương pháp kết tủa hiệu tinh endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans BM13 Dịch vi khuẩn BM13 nuôi cấy. .. vi khuẩn hạn chế; nước ta vấn đề mẻ chưa có nhiều nghiên cứu vi khuẩn Từ đó, đề tài Tinh enzyme endoglucanase từ dịch nuôi cấy Achromobacter xylosoxidans BM13 phương pháp sắc ký trao đổi ion ... ion, sắc ký lọc gel, sắc ký lực, sắc ký tương tác kị nước  Sắc ký trao đổi ion a Khái niệm Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào khác điện tích protein dung dịch Nói cách khác, phương pháp phân