Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học PHN M U 1.1 Tớnh cp thit ca ti Lỳa go l ngun lng thc chớnh ca hn mt na dõn s trờn th gii nc ta lỳa go khụng ch l ngun lng thc tiờu dựng nc m cũn l mt hng xut khu quan trng, cú ý ngha kinh t v xó hi cao Vỡ vy, cõy lỳa luụn l i tng c trung nghiờn cu v ci to khụng ngng tng nng sut v cht lng ht Hin nay, cỏc nh chn ging lỳa ang c gng trung ci thin cht lng go, v chn lỳa cht lng l mt nhng mc ớch quan trng ca chng trỡnh phỏt trin ging lỳa Vit Nam cng nh trờn th gii Cht lng go nh hng rt ln n giỏ tr thng mi ca ht lỳa, õy cng l mt c im rt phc tp, c xỏc nh bi bn thnh phn: cht lng xay xỏt (milling quanlity), dỏng v b ngoi (appearance quanlity), cht lng nu v n (nutrition quanlity) Trong ú cht lng nu, cht lng n, v v b ngoi ca ht to thnh yu t kinh t quan trng nh hng n vic sn xut lỳa ca nhiu vựng trờn th gii V b ngoi ca ht ch yu c xỏc nh bi cỏc tớnh trng nh di, rng, t l di/rng v c ca ni nh Tuy nhiờn, s thớch v hỡnh dng ht thay i cỏc nhúm khỏch hng khỏc nhau, vớ d: Ging cú ht thon di c a thớch M, Tõy u v hu ht cỏc nc Asian bao gm Trung Quc, n , Pakistan, Thỏi Lan; ngc li ngi Nht Bn, Hn Quc thớch ht ngn v trũn Vỡ vy, chn ging cú hỡnh thỏi ht cho nhng mc ớch c bit, cn c lu ý nhng hon cnh ca th trng Thờm vo ú rng v di ht cú nh hng rt ln n nhng tớnh trng cht lng quan trng khỏc ca lỳa nh c ca ht, hiu qu xay xỏt, cht lng nu v n ng thi rng v hỡnh dng ht cng úng vai trũ quan trng xỏc nh nng sut ht Vi s phỏt trin ca sinh hc phõn t, vic chn to ging cú th tin hnh nhanh chúng v chun xỏc nh ỏp dng cỏc ch th phõn t Nhiu gen quý cõy lỳa c phỏt hin bi cỏc ch th phõn t, cú hn 49 v trớ cỏc ch th phõn t ó c bit cú liờn kt cht ch vi cỏc gen khỏng o Nguyễn Thị Thoa 8K Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học ụn, gen khỏng bnh bc lỏ, gen quy nh tớnh bt dc nhy cm quang chu k [8] Mun xỏc nh cỏc ch th phõn t cho chn to ging, cn xỏc nh c s liờn kt ca ch th phõn t vi cỏc tớnh trng hỡnh thỏi lm vic ny, vic nghiờn cu s bin ng ca cỏc ch th phõn t mt qun th phõn ly c bit l rt cn thit, vi nhng tớnh trng s lng cú h s di truyn thp v rt khú xỏc nh trờn ng rung theo phng phỏp chn lc truyn thng nh tớnh trng hỡnh thỏi ht Vỡ vy, chỳng tụi tin hnh thc hin ti: Nghiờn cu bin ng di truyn ca mt s dũng lỳa qun th F3 ca cp lai gia CR203 v Bc thm s 7, gúp phn vo phỏt trin cỏc ch th phõn t liờn kt cú th ng dng chn to ging lỳa cht lng cao 1.2 Mc tiờu, ý ngha, yờu cu ca ti nghiờn cu 1.2.1 Mc tiờu Nghiờn cu bin ng di truyn ca mt s dũng lỳa ca qun th F bng ch th phõn t SSR, lm c s cho vic xỏc nh ch th SSR liờn kt vi mt s tớnh trng hỡnh thỏi ht ca lỳa (di ht, rng ht, ) 1.2.2 í ngha 1.2.2.1 í ngha khoa hc Gúp phn nghiờn cu ng dng ch th phõn t chn to ging lỳa 1.2.2.2 í ngha thc tin Giỳp cho sinh viờn cng c lý thuyt, b sung mt s kin thc thc t, tip xỳc c nghiờn cu phc v cho cụng tỏc sau ny Gúp phn to c s cho vic to ging lỳa cht lng cao, rỳt ngn thi gian v nõng cao hiu qu chn lc 1.3 i tng v phm vi nghiờn cu 1.3.1 i tng nghiờn cu S dng mt s dũng lỳa qun th F3 ca cp lai gia CR203 v Bc thm s 1.3.2 Phm vi nghiờn cu ng dng ch th phõn t nghiờn cu h gen ca mt s dũng lỳa Nguyễn Thị Thoa 8K Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học a im: Nghiờn cu ti Phũng Di truyn T bo thc vt Vin Cụng ngh sinh hc Vin Khoa hc v cụng ngh Vit Nam Thi gian nghiờn cu: T 29/03/2010 n 04/06/2010 1.4 X lý s liu X lý s liu bng cỏc phn mm chuyờn dng Nguyễn Thị Thoa 8K Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học PHN TNG QUAN TI LIU 2.1 Tng quan v cõy lỳa Cõy lỳa thuc h hũa tho (Poaceae, trc õy l h Gramineae) thõn bi, lỏ mm Lỳa trng thuc chi Oryza vi nhiu loi khỏc Hai loi c quan tõm nhin hn c l Oryza sativa L v Oryza glaberrima L cú ngun gc vựng nhit i v cn nhit i khu vc ụng nam Chõu v Chõu Phi Hai loi ny cung cp hn 1/5 ton b lng lng thc tiờu th bi ngi Lỳa l cõy lng thc ngn ngy, cú th cao n 1,8 m, ụi cao hn, vi cỏc lỏ mng hp bn (2 - 2,5 m) v di 50 - 100 cm Lỳa tin húa theo hng thớch nghi cao vi th phn nh giú, vỡ th hoa nh, xu xớ, bao hoa tiờu gim, cỏch ớnh ca ch nh lm cho bao phn d dng lc l trc giú to iu kin thun li cho s tung phn, u nhu cú chựm lụng rt phỏt trin d dng bt phn Ht l qu thúc (ht nh, cng ca cỏc loi ng cc) di - 12 mm v dy - mm Hỡnh 1: Cỏc b phn ca cõy lỳa (Oryza Sativa) Loi Oryza sativa L cú ba loi ph l Indica, Japonica, Javanica Trong ú Indica l loi lỳa c trng cỏc vựng nhit i, Japonica c trng nhng vựng ụn i, cũn loi hỡnh trung gian Javanica l Japonica nhit i Loi Oryza sativa L cú s nhim sc th n bi n = 12 Tỏm 23 loi lỳa cú b gen t bi, i a s cỏc loi lỳa di lỳa trng hin Nguyễn Thị Thoa 8K Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học cú b gen lng bi (2n) Hin 83.000 mu lỳa c lu tr Ngõn hng gen quc t ti Vin nghiờn cu lỳa Quc t (IRRI), ngõn hng gen quc gia n , Thỏi Lan, Trung Quc, Indonesia, Vit NamTrong ú cú khong 9700 mu ging lỳa c thự cho tớnh chu hn, ỳng, núng, lnh, sõu bnh Cõy lỳa Vit Nam (Oryza sativa L.) cũn c gi l lỳa Chõu vỡ nú c thun húa t lỳa di t ba trung tõm u tiờn Chõu Theo c im lỳa trng Vit Nam thỡ ch yu l cỏc ging Indica (Bựi Huy ỏp, 1999) 2.2 C s khoa hc Cụng ngh sinh hc c coi l phng tin nht gii quyt cỏc khú khn m cụng tỏc chn to ging c truyn khụng th thc hin c Cụng ngh sinh hc gúp phn tng nng sut v nõng cao cht lng cõy trng [2] Trong cụng tỏc chn ging cõy trng, cỏc tớnh trng c kho nghim l nhng tớnh trng liờn quan n nng sut, phm cht ca sn phm v ch yu liờn quan n vic tng cng tớnh chng chu i vi sõu bnh v iu kin ngoi cnh bt li Nhng c im mong mun v hỡnh thỏi luụn luụn b nh ca iu kin mụi trng hoc khụng biu hin iu kin ngoi cnh khụng phự hp Vỡ vy, vic chn lc theo kinh nghim s kộm hiu qu v tn thi gian Chỳng ta khụng th trc tip chn lc cỏc gen quan tõm m phi chn lc giỏn tip thụng qua cỏc ch th liờn kt vi gen ú [2] Cỏc c im cú th l c im v hỡnh thỏi liờn kt cht ch vi cỏc gen quan tõm (ch th hỡnh thỏi) Tuy nhiờn, ch th ny rt hn ch c im v hỡnh thỏi l rt ớt Ch th cng cú th l mt c im th hin khớa cnh húa hc (ch th izozym), hay cu trỳc phõn t c truyn cho th h sau, ging nh cỏc nhõn t di truyn ca Mendel, nhng li cú th nh lng c (ch th phõn t ADN) Mt ch th di truyn cn phi cú hai yờu cu c bn: cú s khỏc bit gia c th b v c th m v nú cng phi di truyn chớnh xỏc cho th h sau Khỏc vi hai loi ch th hỡnh thỏi v ch th izozym, cỏc loi ch th ADN rt phong phỳ tớnh a dng ca ADN, tớnh n nh v khụng l Nguyễn Thị Thoa 8K Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học thuc vo cỏc yu t mụi trng Cựng vi s tin b ca cụng ngh sinh hc hin i ó phỏt hin cỏc ch th v ADN ó tr thnh cng c c lc giỳp cỏc nh di truyn chn ging nghiờn cu mt cỏch cú hiu qu v bin i di truyn qun th t nhiờn, xỏc nh mi quan h gia cỏc cỏ th cựng mt loi, v l c s cho vic phõn loi di loi, phỏt hin loi mi v mi quan h tin húa gia loi [6] v nhng nghiờn cu chi tit hn phỏt hin nhng thay i genom m cỏc k thut izozym khụng gii quyt c [4], [12] Cỏc ch th phõn t ADN hay k thut du chun phõn t (Molecular Marker) bao gm: - Ch th phõn t da trờn c s lai ADN hay ch th RFLP - Ch th da trờn c s nhõn bn ADN bng k thut PCR nh AFLP, RAPD, STS, SSR 2.2.1 Ch th ADN Ch th ADN (ch th phõn t) cú th l cỏc gen hoc mt on trỡnh t nucleotide c hiu h gen ca sinh vt (bao gm ADN nhõn, ADN t bo cht) Cú th hiu n gin chỳng nh nhng ct mc h gen S hin din ca cỏc ct mc v khong cỏch tng i gia chỳng phn ỏnh mc bin d gia cỏc cỏ th, ging, loi mt qun th, sinh vt cú kh nng nhõn bn ADN ca chỳng vi chớnh xỏc cao nhng cú nhiu c ch xy cú th lm thay i cu trỳc ADN, n gin nh s thay i bt cp hoc phc hn nh s o on, chuyn on hoc mt on Nh vy, cú s bin ng rt ln v ADN mt qun th sinh vt Ch th phõn t c xem l cụng c rt hiu qu ỏnh giỏ a dng sinh hc phc v cụng tỏc chn ging cõy trng [7] Nh ch th phõn t cho phộp xỏc nh c cỏc c im trc tip ca kiu gen thụng qua vic xỏc nh trỡnh t nht nh ca gen hoc ca trỡnh t liờn kt cht vi cỏc gen mang tớnh trng mong mun Bng vic s dng cỏc ch tiờu phõn tớch trc tip kiu gen trờn, ngi ó i thng vo bn cht di truyn ca cỏc tỡnh trng, khc phc nh hng ca cỏc yu t mụi trng, qua cỏc th h c cha cú s biu hin kiu hỡnh Vỡ vy, ch th phõn t c coi l ch th phn nh chõn tht bn cht di truyn [7] 2.2.2 Cỏc k thut ch th ADN Nguyễn Thị Thoa 8K Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học 2.2.2.1 a hỡnh cỏc on ct gii hn (RFLP) C s k thut ny l s dng cỏc loi enzyme gii hn (RE) ct phõn t ADN ti nhng a im c hiu cha mt trt t c thự ADN Vỡ vy, mt on ln ADN sau c x lý bi enyme gii hn s thu c nhiu on cú kớch thc khỏc nhau, s lng v kớch thc ca chỳng s phn ỏnh s phõn b ca nhng v trớ ct phõn t ADN, s hin din ca cỏc on ct ny mang tớnh c trng cho tng t hp ADN /enzyme t ú s dng nhng mnh ct ny nh cỏc du võn tay c trng i vi tng phõn t ADN hoc i vi cỏc cỏ th cha phõn t ADN ú Nhng phõn on nh vy cú th c phỏt hin bng cỏch chy in di trờn gel agarose [5], [9] RFLP c ng dng nghiờn cu a dng di truyn, s phõn húa di truyn huyt thng, lp bn liờn kt gen Tuy nhiờn, phng phỏp ny cng cú nhc im l cn mt lng ADN ln, quỏ trỡnh phc cụng trỡnh, khú t ng húa, tn kộm v phi s dng cht ng vỡ phúng x nguy him cho ngi [3], [5], [11] 2.2.2.2 a dng v chiu di cỏc on ADN c nhõn bn chn lc (AFLP) Zabeau v Vos (1993), Vos v cng s (1995) ó a v mụ t mt k thut mi v in du võn ADN ú l k thut khuch i chn lc cỏc on ADN a hỡnh (AFLP Technology) õy l k thut phi hp ca RFLP v PCR Nguyờn tc ca k thut ny l dựng enzyme gii hn ct ADN genome thnh cỏc phõn on kớch thc khỏc nhau, s ú s cú mt phõn on mang cỏc im mỳt ging v s dng mt on ni adaptor nh cú th gn thờm mt hoc mt s oligonucleotid c trn trc nh hng cho vic gn cỏc cp mi PCR Tt c nhng on ADN cú u mỳt ging s c nhõn bn, thay i s lng v trt t cỏc oligonucleotide cỏc u mi, ta cú th nhn c nhng on ADN c nhõn bn khỏc nhau, sn phm PCR c in di trờn gel polyacrylamide v s a hỡnh c xỏc nh bi s khỏc ca cỏc on ct c nhõn [10], [11], [15] K thut ny phc hn RFLP nhng hin l mt k thut cú sc mnh ln v y tim nng v in du võn ADN Nú to mt cỏch Nguyễn Thị Thoa 8K Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học nhanh chúng nht, hiu qu nht mt bn di truyn dy c cỏc ch th phõn t nhm chn lc cỏc tớnh trng mong mun thụng qua chn ging nh cỏc ch th phõn t ng thi l mt cụng c lớ tng i vi vic xỏc nh v ỏnh giỏ cõy trng mc phõn t ADN; cú hiu qu vic xỏc nh tớnh a hỡnh cõy trng [3], [11] Cỏc nhõn t AFLP l nhng ch th phõn t, nhanh chúng c ỏp dng vo vic nghiờn cu bin ng di truyn, lp bn gene, dỏn nhón gene quan trng nhiu loi thc vt khỏc nh: khoai tõy, lỳa mch i vi lỳa ch th AFLP ng dng nghiờn cu a dng di truyn v chn to lỳa ó em c mt s kt qu Trờn c s d liu nhn c v a hỡnh cỏc ch th AFLP ca mt s giụng lỳa nng, kt qu bc u cho thy 12 ging lỳa nng c nghiờn cu cú s khỏc ln mc phõn t, ú l nhng nguyờn liu rt tt cho nghiờn cu di truyn v chn ging lỳa Trong vic lp bn v nh v gen lỳa nh ch th AFLP ó thu c kt qu nh ng dng a dng ch th phõn t AFLP lp bn di truyn lỳa (Mackell v cs, 1996) Bng phng phỏp phõn tớch AFLP ó xỏc nh v trớ gen khỏng o ụn P1-44 (t) cui nhim sc th 11 2.2.2.3 ADN a hỡnh c nhõn ngu nhiờn (RAPD) K thut nhõn ngu nhiờn s a hỡnh ca ADN l bc phỏt trin mi da trờn k thut PCR ó c phỏt hin bi William v cs (1990) Nguyờn tc k thut ny l s dng nhng mi ngn (khong 10 nucleotide) cú trt t c tng hp ngu nhiờn Do di ca mi tng i ngn nờn kh nng tỡm v bt cp ca chỳng trờn ADN khuụn l khụng my khú khn Trong phn ng ny mi n gn vo hai im khỏc hai mch n i din Nu khong cỏch ca mi nm khong cỏch cú th nhõn bn c (thng 200-2000 nucleotide) thỡ on ADN s c nhõn lờn, kt qu sn phm ca RAPD l hng ngn on ADN khỏc v di, trỡnh t v s cú mt ca sn phm ny chng t cú s tng ng hon ton hay mt phn gia ADN genome vi cỏc ngun oligonucleotide kim tra s a hỡnh thỡ sn phm s in di trờn gel agarose [8], [11] K thut ny c ng dng ph bin nghiờn cu a dng sinh hc v cú kh nng phõn tớch mi quan h di truyn gia cỏc loi v cỏc nhúm loi, cỏc cỏ th cựng mt loi [14] Vớ d: Mackill (1995) cng Nguyễn Thị Thoa 8K Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học bng k thut ny ó xỏc nh s a dng di truyn ca 143 ging lỳa cú ngun gc khỏc v ch rng s bin d di truyn ca cỏc nhõn t RAPD l rt quan trng b sung thờm cho vic lp bn gene v in du võn ADN K thut RAPD cũn c ng dng chn ging Vic xỏc nh cỏc ch th RAPD c trng, lm c s cho chn ging giỏn tip Cn c vo sn phm in di RAPD ngi ta cú th thit lp bng thng kờ s cú mt cỏc phõn on ADN c nhõn (s 1: cú mt on ADN; s 0: on ADN khụng c nhõn) Trờn c s ú xỏc nh c h s ng dng di truyn gia cỏc i tng nghiờn cu, lp s ph h T kt qu ú s xỏc nh c s sai khỏc v b gene ca cỏc i tng nghiờn cu 2.2.2.4 im trt t c ỏnh du (STS) STS l mt kiu ch th ca di truyn hin ang c s dng rt ph bin vic lp bn genom l im trt t c ỏnh du (Sequence Tagget Site = STS), cũn l mt on ADN ngn gm khong 60-1000 bp v cú th phỏt hin bng k thut PCR Nú cho phộp xỏc nh nhng v trớ c dỏnh du bng cỏch s dng cỏc trỡnh t nucleotide bit trc ca ADN ch th STS c to u tiờn bi Olsen v cs STS da vo nhng locus ó bit (gene, cADN, hoc gene tỏch dũng) v nhõn trc tip bi mi PCR c thit k t trỡnh t u cui ca nhng locus c trng ny [Olsen v cs, 1989] STS khụng ũi hi s phõn lp nhng ũi hi trỡnh t Cỏc on mi STS thng ln khong 20 nucleotide nờn cú tớnh c hiu cao vi PCR c xỏc nh ti mt im trờn bn nh l mt ch th chun h gen ng dng ca STS l da trờn kt qu phõn tớch v ch th STS, RAPD ngi ta cú th xõy dng c bn di truyn liờn kt mt ging cõy trng no ú Nh vy, vic tỡm kim cỏc gen kim soỏt hoc liờn quan cht ch n tớnh trng di truyn no ú cú th tin hnh mt cỏch d dng [3] Khụng c ng dng rng nh ch th SSR nhng cng cú nhiu kt qu v vic ng dng ch th STS cho chn ging cõy trng ó cú cụng b v chn ging chu bnh s dng ch th STS liờn kt vi gen quy nh Nguyễn Thị Thoa 8K Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học mu sc bt bt m [Langridge v cs, 2004]; gen khỏng bnh bc lỏ lỳa [Ramalingam v cs, 2004] 2.2.2.5 S lp li trỡnh t ADN n gin (SSR) Cỏc chui lp li n gin (SSR) hay cũn gi l tiu v tinh (Microsatellite), l nhng on ADN ngn gm mt s nucleotide lp li liờn tip, mi n v cú chiu di t n cp baz s lng n v lp li thay i t n 40 n v Nhng on SSR phõn b u v cui tõm ng NST cú tỏc dng bo v v liờn quan n s di truyn ca NST SSR c nghiờn cu ln u tiờn ngi, õy h ó tỡm cỏc SSR tn ti v phõn b genome v sau ny cũn c tỡm thy rt nhiu c th sinh vt nhõn thc khỏc Tuy nhiờn, tựy vo tng loi m s lng nucleotide mi n v lp li cú th thay i t mt n hng chc v s n v lp li cú th bin ng t hai n hng chc ngn ln [6] K thut SSR da trờn nguyờn lý PCR dựng cỏc cp mi c hiu nhõn cỏc on trỡnh t SSR S khỏc cỏc cu trỳc n v lp li dn n s thay i di on lp li nhõn lờn v c xỏc nh chy in di trờn gel agarose hoc gel polyacrylamide Cho n nay, ó cú rt nhiu nghiờn cu v cỏc ch th SSR cho hng lot cỏc c im v nng sut, cht lng nh cỏc cụng b v ch th SSR liờn kt vi gen Waxy lỳa [Ramalingam v cs, 2004], hoc ỏnh giỏ s khỏc bit di truyn lỳa [Dongling v cs, 2009] Vỡ vy, m hin k thut ny ang c s dng rng rói lnh vc di truyn phõn t nh ỏnh du gen, xỏc nh ging, chun oỏn bnh di truyn S d k thut SSR c ng dng rng rói vỡ nú khụng dựng ng v phúng x, ch cn mt lng ADN nh, thi gian quay vũng nhanh v phỏt hin ADN chớnh xỏc Tuy nhiờn, phng phỏp ny cng cú mt hn ch l tn kộm v tin ca v cụng sc vic xõy dng cp mi c hiu cho mi locus a hỡnh Vic phỏt hin v ng dng k thut phõn tớch SSR ó c dựng nghiờn cu trờn nhiu i tng ng vt, thc vt khỏc Mt s bn di truyn ó c s dng thnh cụng lỳa nh: phõn nhúm di truyn lỳa a phng, xõy dng bn gen ry nõu, xõy dng bn gen khỏng mn trờn lỳa (Nguyn Th Lang, 2002) Nguyễn Thị Thoa 8K 10 Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học + Trờn tm kớnh ngn s dng dch bụi trn l Rain ì thm trờn giy kim wipe, ch 15 20 phỳt cho khụ + Trờn tm kớnh di s dng dung dch dớnh gm 1ml hn hp (95% cn tuyt i, 0,5% acetic acid v àl bind silance), t 15 20 phỳt cho khụ (lu ý: trỏnh dung dch bỏm dớnh dy sang kớnh ngn, phi chun b kớnh ngn trc Nu chun b kớnh di trc thỡ phi thay gng tay trc chun b kớnh ngn) hai tm Spacer vo hai mộp kớnh ri ghộp hai tm li vi to khuụn gel, ú khuụn ỳc cú dy ỳng bng dy ca Spacer - Chun b dung dch gel polyacrylamide chy in di: Dựng ng ong ly 55 ml polyacrylamide, b sung thờm 55 àl TEMED v 165 àl APS 10% (amonium persulfate) lc cho u trc cho gel v bn gel chy in di Dựng xilanh 140cc hỳt dung dch gel polyacrylamid ó trn trờn v bm t t vo khong trng gia hai tm kớnh qua mt l ỏy ca h thng bn gel Khi thy gel chy gn mộp ngoi, lp lc, ch 2-3 gi cho gel ụng li Trong trng hp gi gel qua ờm nhit phũng cn bt u cú lc bng mng plastic - Tin hnh in di Sau gel ụng, dng ng bn gel lp vo h thng chy in di, dung dch m TBE buffer ì0,5(m TBE gm: 0,5 ml m TBE ì0,5; lớt nc) ó chun b trc cho chy thụng gel trc tra mu khong 20 30 phỳt cụng sut 75w - Tra mu: Nguyễn Thị Thoa 8K 20 Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học + Chy bin tớnh : Sn phm SSR thu c thờm 7àl loading (loading gm 2,5 mg brom phenol blue; 2,5 mg xylen cyanlo FF: 0,4 g sucrose thờm nc ct v 1ml.) trn u cho vo mỏy, y np, bt mỏy bin tớnh 10 phỳt Ly cho vo ỏ lnh + Ly 5àl hn hp ó bin tớnh ln lt tra vo ging Thng tra maker 100 u tiờn hoc cui cựng vi lng khong àl úng lp, n Exit cho mỏy tr li mn hỡnh ban u, chn Manual, chn consant 75w, n run cho chy gel chy xung tn bn gel mi tin hnh quy trỡnh nhum gel tng hiu qu s dng c bn gel, cú th tra mu nhiu ln, mi bn gel cú th tra t 2- ln + Sau tra mu v maker cụng sut chy gel l 75w, sau gi tt mỏy, g bn gel mỏy, tỏch bn kớnh khụng dớnh ri tin hnh nhum bc - Chun b nhum: + Dung dch c nh (11) bao gm: 125ml CH3COOH, 1lớt nc ct, dung dch ny dựng c hai ln + Dung dch nhum (11) bao gm: gam AgNO3, 1,5ml HCHO, thờm nc ct va lớt dung dch ny c dựng hai ln + Dung dch hin bao gm: 15g sodium cacbonat, 0,75ml Formandehyd (HCHO); 0,2 ml Thiosunfat, thờm nc ct va lớt Bao bỏo t lnh ớt nht 30 phỳt mi em dựng, thuc ny dựng c ln - Tin hnh nhum gel bng bc: + Sau in di, tỏch cỏc bn kớnh ra, gel phi c dớnh vo kớnh di a gel vo dung dch c nh t lờn mỏy lc 30 phỳt, n khụng cũn vch nhum na Nguyễn Thị Thoa 8K 21 Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học + Ra bn gel ln (mi ln phỳt) bng nc ct + Nhum gel bng dung dch nhum ớt nht 30 phỳt trờn mỏy lc + Ra bn gel ó nhum bng nc ct 10 giõy nu khụng bc s i ht + Cho bn gel ó vo dung dch hin, t trờn mỏy lc 5-10 phỳt cho n ni rừ bng in di + C nh gel bng dung dch c nh phỳt + Trỏng gel bng nc ct v cho gel khụ nhit phũng 3.2.4 Phng phỏp phõn tớch v x lý s liu nghiờn cu mc a dng di truyn ta thng da vo ba cụng thc h s di truyn ú l: h s Jaccard (1908), h s SM (Sokal v Michener, 1958), h s Nei v Li (1979) phõn tớch cỏc nhúm v so sỏnh cỏc ma trn tng ng vi nhau, ngi ta dựng mt s phng phỏp ma trn nh ma trn khỏc UPMGA (Sokal v Michener, 1958), ma trn ging WPGMA (Sneath v Sokal, 1973) Vic chn s dng phng phỏp tớnh toỏn no l tựy thuc vo tng i tng v mc ớch nghiờn cu Nhiu nghiờn cu ch rng h s tng ng di truyn Jaccard v phng phỏp tớnh UPGMA cho nghiờn cu a dng di truyn l phự hp hn c Nờn nghiờn cu ny chỳng tụi ó s dng h s di truyn Jaccard v phng phỏp tớnh UPGMA nghiờn cu mc bin ng di truyn gia cỏc mu lỳa qun th F3 gia cp lai CR203 v Bc thm s Cỏc phõn on ADN c ghi nhn da trờn c s cú mt hay vng mt ca chỳng cỏc ging nghiờn cu theo ADN chun (ADN marker) Nu cú thỡ kớ hiu l 1, khụng cú thỡ kớ hiu l 0, cũn khụng thu nhn c sn phm thỡ kớ hiu l (-) Cỏc s liu ny c a vo x lý theo chng trỡnh NTYSYS PC ( Rohlf F J) tớnh ma trn tng ng gia cỏc ụi mu Vic tớnh toỏn ma trn tng ng gia cỏc ụi mu Vic tớnh toỏn ma trn tng ng da trờn cụng thc: Jij = a / (n-d) Nguyễn Thị Thoa 8K 22 Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học Vi: a: s phõn on ADN cú hai dũng I v j d: s phõn on ADN cú dũng I hoc dũng j n: Tng s phõn on thu c Jij: H s tng ng Jaccard gia hai dũng I v j Sau ú cỏc mu nghiờn cu c x lý tip NTSYS SIMQUAL phõn nhúm v c biu hin trờn biu giỳp chỳng ta cú th ỏnh giỏ s a dng di truyn v mi quan h gia cỏc i tng nghiờn cu PHN KT QU V THO LUN 4.1 Kt qu tỏch chit ADN tng s Hu ht cỏc k thut Sinh hc phõn t u s dng ADN nh l nguyờn liu c bn ban u nghiờn cu Tỏch chit ADN tng s c coi l khõu u tiờn quyt nh cho s thnh cụng ca cỏc nghiờn cu tip theo trờn ADN ADN cú cht lng cao phi m bo tớnh nguyờn ca phõn t, khụng ln ARN, protein hay cỏc cht khỏc Hin nay, cú nhiu phng phỏp tỏch chit ADN tng s rt hiu qu t mụ thc vt ó c nghiờn cu Phng phỏp tỏch chit ADN chỳng tụi trỡnh by trờn l phng phỏp tỏch chit ADN tng s ca Saghai Maroof cú ci tin phự hp vi iu kin phũng thớ nghim Nguyễn Thị Thoa 8K 23 Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học Cỏc nghiờn cu c tin hnh trờn 50 dũng lỳa ADN sau tỏch chit c kim tra nng v tinh sch nh mỏy o UV bc súng 260 nm v 280 nm Sau ú tin hnh in di trờn gel agarose 1% Kt qu thu c th hin trờn hỡnh 2 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Hỡnh 2: Kt qu in di ADN tng s mt s dũng qun th F3 Trờn nh in di cho thy ADN tng s thu c cú mt bng rt gn v khỏ rừ nột, ng thi khụng thy ng ging, kt hp vi kt qu t l hp th o trờn mỏy UV gia A260/A280 khong t 1.8 2.0 tt c cỏc mu Chng t ADN tng s thu c cú tinh sch v nguyờn khỏ cao Cú th s dng cho cỏc phn ng tip theo Da trờn nng ADN tng s ca tng mu pha loóng nng 25 ng/àl s dng cho cỏc phn ng PCR 4.2 Kt qu PCR t ADN tng s vi cỏc mi SSR 4.2.1 Kt qu PCR b v m vi cỏc mi SSR Trc ỏnh giỏ s a hỡnh ca qun th F3 vi cỏc ch th SSR, chỳng tụi tin hnh ỏnh giỏ s a hỡnh ca cỏc ch th trờn cp b m chn cỏc cp mi cho s a hỡnh Di õy l kt qu in di cỏc ch th SSR vi b m Nguyễn Thị Thoa 8K 24 Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học Hỡnh 3: Kt qu in di sn phm PCR vi cỏc mi RM19, RM190, RM169, RM102, RM153, RM229, RM311, marker Kt qu in di trờn hỡnh thu c cỏc bng gn v rừ nột Chng t kt qu chy PCR vi cỏc mi SSR l rt c hiu Cú th dựng sn phm PCR kim tra trờn gel polyacrylamide cú kh nng phõn tỏch kớch thc tt hn tỡm cỏc ch th cho s a hỡnh gia b v m Sau chy in di sn phm PCR trờn gel polyacrylamide, chỳng tụi thu c cỏc mi RM19, RM190, RM169, RM102, RM153, RM229, RM311 cho cỏc bng a hỡnh gia cỏc cp b m Cỏc mi ny s c dựng kim tra s a hỡnh trờn qun th lỳa F3 4.2.2 Kt qu PCR ADN tng s ca cỏc dũng lỳa vi cỏc mi SSR Sau hon thnh phn ng PCR vi cỏc dũng qun th, sn phm c in di trờn gel agarose 2%, hoc c in di trờn gel polyacrylamide phõn tớch a hỡnh ADN ca cỏc mu nghiờn cu Cỏc bng ADN thu c, c phõn tớch da trờn s cú mt hay vng mt ca chỳng cỏc mu nghiờn cu Nu cú thỡ ký hiu l 1, cũn khụng cú thỡ ký hiu l Nhng bng m cú mu ny nhng khụng cú mu khỏc gi l bng a hỡnh Da vo mc a hỡnh ca cỏc bng ny chỳng ta cú th ỏnh giỏ mc khỏc v ging gia cỏc mu nghiờn cu Kt qu phõn tớch SSR ca 49 dũng lỳa vi mi SSR c th hin hỡnh 4, hỡnh 5, hỡnh Nguyễn Thị Thoa 8K 25 Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm BT CR 20 21 22 23 Khoa Công nghệ sinh học 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Hỡnh 4: Kt qu in di sn phm SSR - PCR vi cp mi RM190 trờn gel agarose 2% (BT: BTS7, CR:CR203, 19: Th t dũng t 109 130) T hỡnh ta thy, kt qu in di sn phm SSR - PCR vi mi RM190 cho kt qu rt tt vi hai bng rừ nột Cỏc bng xut hin ch ging b hoc m, ú cú mu 2, 4, 8, 13, 14 (tng ng vi dũng 110, 112, 116, 121, 122) xut hin hai bng ging c b v m 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Hỡnh 5: Kt qu in di sn phm PCR vi cp mi RM169 trờn gel agarose 2% (1: BTS7, 2:CR203, 25: Th t dũng t 109 - 136) Nguyễn Thị Thoa 8K 26 Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm M 12 Khoa Công nghệ sinh học 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 100bp Hỡnh 6: Kt qu in di sn phm PCR vi cp mi RM229 trờn gel polyacrylamide 5% (M: Marker, 32: Th t dũng t 109 143) M Kt qu phõn tớch 10 mi 11 12quan 13 14 15 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27lỳa 28 29trong 30 31 32 4.3 h16di17truyn gia cỏc dũng qun th F3 nghiờn cu mc a dng di truyn ngi ta thng da vo ba h s bn: H s Nei v Li (1979), h s Jaccard (1908), h s SM (Sokal v Michener, 1958) phõn tớch cỏc nhúm v so sỏnh cỏc ma trn tng ng vi nhau, ngi ta dựng mt s phng phỏp ma trn khỏc UPGMA (Sokal v Michener, 1958), ma trn ging WPGMA (Sneath v Sokal, 1973), liờn kt n (Lance v Williams, 1976) v liờn kt hon ton (Lance v Williams, 1976) Vic chn s dng phng phỏp no l tu thuc vo tng i tng v mc ớch nghiờn cu Trong nghiờn cu ny chỳng tụi ó s dng h s tng ng di truyn Jaccard v phng phỏp tớnh UPGMA phõn tớch mi quan h di truyn gia cỏc dũng lỳa trờn qun th F3 H s tng ng di truyn Jaccard cho ta bit mi tng quan v mt di truyn gia cỏc mu phõn tớch Tr s Jaccard cng tin v thỡ mc tng ng di truyn gia cỏc mu cng thp v ngc li, cng tin v thỡ mc tng ng di truyn cng cao S liu thu c t kt qu Nguyễn Thị Thoa 8K 27 Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học PCR SSR c a vo x lý bng phn mm NTSYSpc version 2.02h tớnh h s tng ng di truyn v xõy dng biu quan h di truyn gia cỏc dũng qun th F3 (hỡnh 7) T hỡnh cho thy gia cỏc mu nghiờn cu cú h s tng ng di truyn Jaccard nm khong 0,31 100 Trong ú, giỏ tr 0.50 l h s tng ng di truyn ca cỏc cp mu R125 R148 (tng ng vi cỏc dũng 125-148) Hai mu R161 v R162 cú h s tng ng di truyn rt cao l00 chng t hai mu ny cú quan h di truyn rt gn Biu quan h di truyn hỡnh c xõy dng trờn c s cỏc h s tng ng di truyn gia 50 dũng nghiờn cu cho thy rừ hn s khỏc bit v mi quan h di truyn gia cỏc dũng qun th C th h s di truyn dao ng t 0,31 n 100 Trong ú, hai dũng R138 v R158 cú s khỏc bit ln nht so vi cỏc dũng cũn li vi h s tng ng l 0,31 Vi h s tng ng 32% cõy phõn loi chia lm hai nhúm Mt nhúm ging L1 (ging BTS7), mt nhúm ging L2 (ging CR203) Cỏc dũng qun th cú quan h di truyn gn gi vi CR2003 nhiu hn l BTS7 Nguyễn Thị Thoa 8K 28 Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học Hỡnh Biu quan h di truyn gia cỏc dũng lỳa qun th F3 Qua vic phõn tớch biu quan h di truyn v bng h s tng ng di truyn cú th thy gia cỏc dũng cựng mt qun th cú s dao ng di truyn ln t 0,31 100 Tuy nhiờn, gia cỏc dũng cng cú s khỏc bit di truyn qun th Chng t gia cỏc dũng cú s phõn ly tớnh trng so vi b v m Nguyễn Thị Thoa 8K 29 Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học KT LUN V KIN NGH Kt lun T nhng kt qu thu c chỳng tụi i n cỏc kt lun sau: ó tỏch chit c ADN tng s ca cỏc dũng qun th F3 cú tinh sch v nguyờn cao ó xỏc nh c cp mi SSR cho s a hỡnh gia ging CR203 v Bc thm s Phõn tớch kt qu PCR vi ch th SSR trờn qun th F3, cho t l a hỡnh cao Qua phõn tớch a dng di truyn da trờn h s tng ng di truyn Jaccard cho thy gia cỏc dũng qun th F3 cú mc a dng di truyn cao, h s tng ng di truyn dao ng t 0,31 n 100% cho thy gia cỏc dũng qun th cú s phõn ly tớnh trng so vi b m Kin ngh Do thi gian thc tt nghip ngn v phm vi nghiờn cu ca mt ti khúa lun tt nghip nờn tn ti mt s : ti cha cú thi gian s dng cỏc ch th phõn t khỏc cho phõn tớch tớnh trng hỡnh thỏi ht Tip tc nghiờn cu bin ng di truyn i vi cỏc dũng lỳa qun th F3 ca cp lai gia CR203 v Bc thm s gúp phn vo phỏt trin cỏc ch th liờn kt ng dng chn to ging lỳa cht lng cao Nguyễn Thị Thoa 8K 30 Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học TI LIU THAM KHO Ting vit Bựi Chớ Bu, Nguyn Th Lang (1995); ng dng cụng ngh sinh hc ci tin ging lỳa; Nxb Nụng Nghip TPHCM Bựi Chớ Bu (2004); Hi ngh quc gia v chn to ging lỳa; Nxb Nụng nghip, TPHCM; 12-18 H Hunh Thựy Dng (1998); Sinh hc phõn t; Nxb Giỏo Dc, H Ni Ló Tun Ngha, V c Quang, Trn Duy Quý (2004); C s lý thuyt v ng dng cụng ngh gen chn to ging cõy trng; Nxb Nụng nghip, H Ni Lờ Duy Thnh ; C s di truyn chn ging thc vt : Nxb khoa hc v k thut, H Ni Nguyn c Thnh, Phan Th By, Lờ Hng ip (1999); Phỏt trin v ng dng cỏc ch th phõn t nghiờn cu a dng phõn t lỳa; K yu Vin Cụng ngh Sinh hc; 1205-1215 Vừ Thng Lan; Sinh hc phõn t; Nxb Giỏo Dc, H Ni Trn Duy Quý (1997); Cỏc phng phỏp mi chn to ging cõy trng; Nxb Nụng nghip H Ni; 237-255 Phan Th By, Lờ Th Mui, Nguyn c Thnh (2000), Phng phỏp tỏch trit nhanh v n gin ADN tng s t mụ lỏ lỳa (Oryza Sativa) , Tp sinh hc, Tp 22 (1), (53-54) 10 Bựi Huy ỏp, (1999), Mt s v cõy lỳa, Nh xut bn nụng nghip H Ni Ti liu ting Anh 11 Araki H, Iijima M (2005) Stable isotope analysis of water extraction from subsoil in upland rice (Oryza sativa L.) as affected by drought and soil compaction Plant Soil 270:147-157 12 Bohnert H J, Jensen R G (1996) Strategies for enginieering water stress tolerance in plants TIBTECH 14: 89 97 13 Cairns JE, Audebert A, Townend J, Price AH, Mullins CE (2004) Effect of soil mechanical impedance on root growth of two rice varieties under fied drought stress Plant Soil 267:309-318 Nguyễn Thị Thoa 8K 31 Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học 14 Causse MA, FultonY, Cho YG, Chuwongse K, Wu J, Xiao Z, Yu SE, Harrington G, Second SR, MacCouch and Tankley SS (1997) Saturated molecular map of the rice genome based on an interspecific backcross population Genetic 138 1251 1274 15 Champoux MC, Wang G, Sarkarung S, Mackill DJ, O'Toole J C, Huang N, McCouch SR (1995) Locating genes associated with root morphology and drought avoidance in rice via linkage to molecular markers Theor Appl Genet 90:969 981 16 Fu BY, Xiong JH, Zhu LH, Zhao XQ, Xu HX, Gao YM, Li YS, Xu JL and Li ZK (2007) Identification of function candidate gene for drought tolerance in rice Plant Mol Biol, 31:121-130 17 Kato Y, Kamoshita A, Abe J, Yamagishi J (2006c) Growth of rice (Oryza sativa L.) cultivars under upland conditions with different levels of water supply Root system development, water extraction and plant water status Plant Prod Sci 9(40): 422-433 18.McCouch S, Teytelman L, Xu Y, Lobos K, Clare K, Walton M, Fu B, Maghirang R, Li Z, Xing Y, Zhang Q, Kono I, Yano M, Fjellstrom R, Declerk G, Schneider D, Cartinhour S, Ware D and Stein L (2003) Development and mapping of 2240 new SSR markers for rice (Oryza sativa L.) DNA Research 9:129-207 Nguyễn Thị Thoa 8K 32 Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học MC LC PHN M U 1.1 Tớnh cp thit ca ti .1 1.2 Mc tiờu, ý ngha, yờu cu ca ti nghiờn cu 1.2.1 Mc tiờu 1.2.2 í ngha 1.2.2.1 í ngha khoa hc 1.2.2.2 í ngha thc tin 1.3 i tng v phm vi nghiờn cu .2 1.3.1 i tng nghiờn cu .2 1.3.2 Phm vi nghiờn cu 1.4 X lý s liu PHN TNG QUAN TI LIU 2.1 Tng quan v cõy lỳa 2.2 C s khoa hc 2.2.1 Ch th ADN 2.2.2 Cỏc k thut ch th ADN .6 2.2.2.1 a hỡnh cỏc on ct gii hn (RFLP) 2.2.2.2 a dng v chiu di cỏc on ADN c nhõn bn chn lc (AFLP) 2.2.2.3 ADN a hỡnh c nhõn ngu nhiờn (RAPD) .8 2.2.2.4 im trt t c ỏnh du (STS) .9 2.2.2.5 S lp li trỡnh t ADN n gin (SSR) 10 2.2.3 K thut PCR 11 2.2.4 Mt s ch th liờn quan n cht lng go 12 2.3 Tỡnh hỡnh nghiờn cu v ngoi nc 13 2.3.1 Tỡnh hỡnh nghiờn cu nc ngoi 13 2.3.2 Tỡnh hỡnh nghiờn cu nc 14 PHN 15 VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU .15 3.1 Vt liu nghiờn cu 15 3.1.1 Nguyờn liu thc vt .15 3.1.2 Húa cht v thit b .16 3.2 Phng phỏp nghiờn cu 16 3.2.1 Tỏch chit ADN tng s .16 3.2.2 Phn ng PCR vi cỏc cp mi SSR 17 3.2.3 Phõn tớch SSR .19 3.2.4 Phng phỏp phõn tớch v x lý s liu 22 PHN 23 KT QU V THO LUN .23 4.1 Kt qu tỏch chit ADN tng s .23 4.2 Kt qu PCR t ADN tng s vi cỏc mi SSR .24 4.2.1 Kt qu PCR b v m vi cỏc mi SSR .24 4.2.2 Kt qu PCR ADN tng s ca cỏc dũng lỳa vi cỏc mi SSR 25 4.3 Kt qu phõn tớch mi quan h di truyn gia cỏc dũng lỳa qun th F3 .27 KT LUN V KIN NGH .30 Kt lun 30 Kin ngh .30 TI LIU THAM KHO .31 Nguyễn Thị Thoa 8K 33 Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học Ting vit .31 Ti liu ting Anh 31 Nguyễn Thị Thoa 8K 34 Báo cáo tốt nghiệp [...]... dng cỏc dũng lỳa trong qun th F3 ca cp lai gia CR203 v Bc thm s 7, nhn c t phũng Di truyn T bo thc vt Vin Cụng ngh sinh hc Bng 1: Tờn cỏc dũng lỳa trong qun th F3 ca cp lai CR203 v Bc thm s 7 (49 dũng v 2 dũng i chng CR203 BTS 7) dựng trong nghiờn cu STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Nguyễn Thị Thoa 8K Tờn dũng 109 110 111 112 113 114 115 116 1 17 118 120 121 122... tng s ca cỏc dũng trong qun th F3 cú tinh sch v nguyờn vn cao ó xỏc nh c 7 cp mi SSR cho s a hỡnh gia ging CR203 v Bc thm s 7 Phõn tớch kt qu PCR vi 7 ch th SSR trờn qun th F3, cho t l a hỡnh cao Qua phõn tớch a dng di truyn da trờn h s tng ng di truyn Jaccard cho thy gia cỏc dũng trong qun th F3 cú mc a dng di truyn cao, h s tng ng di truyn dao ng t 0,31 n 100% cho thy gia cỏc dũng trong qun th cú... v Sokal, 1 973 ) Vic chn s dng phng phỏp tớnh toỏn no l tựy thuc vo tng i tng v mc ớch nghiờn cu Nhiu nghiờn cu ch ra rng h s tng ng di truyn Jaccard v phng phỏp tớnh UPGMA cho nghiờn cu a dng di truyn l phự hp hn c Nờn trong nghiờn cu ny chỳng tụi ó s dng h s di truyn Jaccard v phng phỏp tớnh UPGMA nghiờn cu mc bin ng di truyn gia cỏc mu lỳa trong qun th F3 gia cp lai CR203 v Bc thm s 7 Cỏc phõn on... 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 100bp Hỡnh 6: Kt qu in di sn phm PCR vi cp mi RM229 trờn gel polyacrylamide 5% (M: Marker, 1 32: Th t dũng t 109 143) M 1 Kt 2 3 qu 4 5 phõn 6 7 8 tớch 9 10 mi 11 12quan 13 14 15 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27lỳa 28 2 9trong 30 31 32 4.3 h1 6di1 7truyn gia cỏc dũng qun th F3 nghiờn cu mc a dng di truyn ngi ta thng da vo ba h s bn: H s Nei v Li (1 979 ),... Jaccard nm trong khong 0,31 100 Trong ú, giỏ tr 0.50 l h s tng ng di truyn ca cỏc cp mu R125 R148 (tng ng vi cỏc dũng 125-148) Hai mu R161 v R162 cú h s tng ng di truyn rt cao l00 chng t hai mu ny cú quan h di truyn rt gn nhau Biu quan h di truyn hỡnh 7 c xõy dng trờn c s cỏc h s tng ng di truyn gia 50 dũng nghiờn cu cho thy rừ hn s khỏc bit v mi quan h di truyn gia cỏc dũng trong qun th C th h s di truyn... 1 940C trong 5 phỳt 2 940Ctrong 1 phỳt 3 550C trong 1phỳt 4 72 0C trong 2 phỳt 5 35 chu k (2+3+4) 6 72 0C trong 5 phỳt Sn phm PCR vi cỏc mi SSR c chy in di trờn gel agarose 2% v gel polyacrylamide cú phõn gii cao, s dng nhum bc phỏt hin bng in di trờn gel agarose Húa cht : - Agarose - m 10 ì TBE : 54 g Trisbase ; 7, 5 g Boric acid; 20 ml EDTA 0,5 M; pH= 8,0 thờm nc ct ti 500 ml - m tra mu (loading buffer):... 125 1 27 128 130 131 132 133 134 135 136 STT 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 15 Tờn dũng 1 37 138 139 140 141 142 143 144 145 146 1 47 148 149 150 152 153 154 155 156 1 57 158 160 161 162 CR203 BTS 7 Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học 3.1.2 Húa cht v thit b Thit b mỏy múc: - Cõn phõn tớch (Meller, Thy s) - Mỏy o quang ph Diode... ng di truyn gia cỏc mu cng thp v ngc li, cng tin v 1 thỡ mc tng ng di truyn cng cao S liu thu c t kt qu Nguyễn Thị Thoa 8K 27 Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm Khoa Công nghệ sinh học PCR SSR c a vo x lý bng phn mm NTSYSpc version 2.02h tớnh h s tng ng di truyn v xõy dng biu quan h di truyn gia cỏc dũng trong qun th F3 (hỡnh 7) T hỡnh 7 cho thy gia cỏc mu nghiờn cu cú h s tng ng di truyn... WPGMA (Sneath v Sokal, 1 973 ), liờn kt n (Lance v Williams, 1 976 ) v liờn kt hon ton (Lance v Williams, 1 976 ) Vic chn s dng phng phỏp no l tu thuc vo tng i tng v mc ớch nghiờn cu Trong nghiờn cu ny chỳng tụi ó s dng h s tng ng di truyn Jaccard v phng phỏp tớnh UPGMA phõn tớch mi quan h di truyn gia cỏc dũng lỳa trờn qun th F3 H s tng ng di truyn Jaccard cho ta bit mi tng quan v mt di truyn gia cỏc mu phõn... tớch SSR ca 49 dũng lỳa vi 7 mi SSR c th hin trong hỡnh 4, hỡnh 5, hỡnh 6 Nguyễn Thị Thoa 8K 25 Báo cáo tốt nghiệp Trờng Cao đẳng Nông Lâm BT CR 1 2 20 21 22 23 3 4 5 6 7 8 Khoa Công nghệ sinh học 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Hỡnh 4: Kt qu in di sn phm SSR - PCR vi cp mi RM190 trờn gel agarose 2% (BT: BTS7, CR :CR203, 1 19: Th t dũng t 109 130) T hỡnh 4 ta thy, kt qu in di sn phm SSR - PCR vi mi ... th F3 ca cp lai gia CR203 v Bc thm s 7, nhn c t phũng Di truyn T bo thc vt Vin Cụng ngh sinh hc Bng 1: Tờn cỏc dũng lỳa qun th F3 ca cp lai CR203 v Bc thm s (49 dũng v dũng i chng CR203 BTS 7) ... 19 20 21 22 23 24 25 26 27lỳa 28 2 9trong 30 31 32 4.3 h1 6di1 7truyn gia cỏc dũng qun th F3 nghiờn cu mc a dng di truyn ngi ta thng da vo ba h s bn: H s Nei v Li (1 979 ), h s Jaccard (1908), h... 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 15 Tờn dũng 1 37 138 139 140 141 142 143 144 145 146 1 47 148 149 150 152 153 154 155 156 1 57 158 160 161 162 CR203 BTS Báo cáo tốt