Đang tải... (xem toàn văn)
Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của enzyme - chất xúc tác sinh học.
Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau [4]. Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp… Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20-30% [6]. Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm thu được chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết. Để tách và tinh chế enzyme nói riêng và protein nói chung thường có một loạt phương pháp hóa-lý và hóa học khác nhau. Có thể chia làm ba nhóm phương pháp sau: - Phương pháp kết tủa - Phương pháp sắc ký SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 1 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô - Phương pháp phân tách hệ hai pha nước Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 2 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô Chương 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYM PROTEASE 1.1. Tình hình nghiên cứu enzyme. 1.1.1. Vấn đề nghiên cứu enzyme ở nước ta Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của enzyme - chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác. Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực tế. Nghiên cứu về công nghệ enzyme đã được tiến hành bởi nhiều tác giả như sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, trypsin . sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase. Đã có những thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng protease, bột protein thịt bằng bromelain từ đọt dứa, lên men rượu bằng enzyme cố định trên cột. Cũng đã có những nghiên cứu sử dụng peroxydase, cyt-P 450 trong chế tạo biosensor và thuốc phát hiện chất độc . Trong lĩnh vực y dược, việc nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của một số enzyme nhằm mục đích kiến tạo nên một số thuốc dùng điều trị một số bệnh đặc biệt là tạo ra một số chế phẩm thuốc chống suy dinh dưỡng ở trẻ em, đồng thời đã tiến hành sản xuất đại trà. Đây là một đóng góp rất thiết thực và kịp thời trong việc phòng chống suy dinh dưỡng ở nước ta. 1.1.2. Công nghệ sản xuất enzyme trên thế giới. Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%), và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%) [4]. 1.2. Tổng quan về enzyme Protease. SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 3 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô 1.2.1. Giới thiệu chung. Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-) n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin. Hình 1.1. Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa .) và động vật (gan, dạ dày bê .). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 4 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. Hình 1.2. Cấu trúc không gian enzyme Protease. 1.2.2. Phân loại Protease Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) . SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 5 Peptidase (Protease) (E.C.3.4) Exopeptidase (E.C. 3.4.11-17) Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) Aminopeptidase Carboxypeptidase Serine proteinase Cystein proteinase Aspartic proteinase Metallo proteinase Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô Hình 1.3. Sơ đồ phân loại protease Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase. * Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại: + Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide. + Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide. * Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: + Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. + Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. + Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin. SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 6 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. + Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA. Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: - Protease acid: pH 2-4 - Protease trung tính: pH 7-8 - Protease kiềm: pH 9-11 SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 7 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô Chương 2: NGUỒN THU NHẬN ENZYM PROTEASE 2.1. Nguồn động vật: - Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều enzyme nhất. - Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm Protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ phomat. Renin làm biến đổi cazein thành paracazein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca 2+. Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiểm pepxin (trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì. Khi đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepxin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi. Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus. 2.2. Nguồn thực vật: Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein. Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hoá. Ficin thu được từ nhựa cây cọ (Ficus carica). Enzyme được sử dụng thuỷ phân protein tự nhiên. SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 8 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô Hình 2.1. Nguồn thu enzyme Protease từ thực vật 2.3. Nguồn vi sinh vật: Enzyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số và một số loại nấm men. Vi khuẩn Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng [6]. Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein [6]. Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998). Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 9 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Hình 2.2. Clostridium Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ 20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12 . SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 10 [...]... 3.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng... sinh tổng hợp enzyme Protease Ví dụ: Vi khuẩn Bac Subtilis có khả năng sinh tổng hợp Protease ở môi trường tinh bột >8% SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 21 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô Nhiều xạ khuẩn ưa nhiệt, trong đó Micromonospora vulgaris 42, mọc tốt và sinh tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột Tăng nồng độ tinh bột từ 0,251,5% sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu xuất tổng hợp enzyme.Nếu... cameberti, P roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho mát SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 11 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô Hình 2.4 Nấm mốc Xạ khuẩn Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus,... đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác 3.1.3.1 Nguồn cacbon Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit, tùy thuộc vào đặc tính của enzyme và nòi vi... sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 13 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô Chương 3: THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH ENZYM PROTEASE TỪ VI SINH VẬT VÀ THỰC VẬT 3.1 Thu nhận và làm sạch enzyme Protease từ vi sinh... giảm hoạt lực protease tới 30- 50% , còn amylaza giảm 7- 10 lần Còn trong môi trường chỉ có nguồn nitơ hữu cơ hoạt lực protease và amylaza cũng thấp hơn trong môi trường đối chứng (NH4)2HPO4 và nước chiết đậu tương Đối với xạ khuẩn ưa nhiệt Actynomyces Vulgaris U2 thì pepton là chất cảm ứng để sinh tổng hợp enzyme protease là tốt nhất Các axit amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme bằng vi... để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính như sau: • Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật • Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16÷ 100 giờ nên có thể thu hoặc nhiều lần quanh năm • Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi)... Hình 2.3 Bacillus Nấm Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A terricola, A fumigatus, A saitoi, Penicillium chysogenum)… Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3... awamori, A niger, A flavus) trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp protease axit cao Trên môi trường kzapek NaNO3 được thay bằng cả cazein hoạt lực protease của nấm mốc được tăng lên 3,5 lần, còn khi thay tinh bột bằng glucoza và bổ sung pepton hoạt lực enzyme tăng 6 lần Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme được nâng cao khi trong môi trường có đồng thời cả nguồn nitơ hữu... các nguồn nitơ và hữu cơ hoạt lực enzyme protease tăng 22- 74% Còn trường hợp dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinh tổng hợp protease nói chung Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn, trong đó có B subtilis và B mesentericus, các hợp chất nitơ vô cơ và hữu cơ được dùng phối hợp trong môi trường sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sinh tổng hợp protease Trong số các nguồn nitơ