CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT Phương pháp nuôi cấy Phương pháp sở kỹ thuật sinh học phân tử Phương pháp sở miễn dòch học PHÂN TÍCH VSV BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY • Phương pháp đổ đóa (pour plate) • Phương pháp cấy bề mặt (spread) • Phương pháp MPN (most probable number) • Phương pháp nuôi cấy kỵ khí PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA • Mục đích sử dụng đònh lượng VSV • Kỹ thuật – Môi trường agar đun chảy làm nguội đến 45±1oC – Cấy tối đa 1ml dòch mẫu hay dòch pha loãng vào đóa petri trống vô trùng (Þ – 10cm) – Đổ 10-15ml môi trường vào đóa – Lắc ngược xuôi chiều kim đồng hồ – Đặt đóa lên mặt phẳng ngang cho môi trường đông đặc – Ủõ ngược đóa, điều kiện thời gian xác đònh PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA • Ưu điểm – Cấy thể tích mẫu lớn (1ml) – Xác đònh VSV cần dinh dưỡng tiếp xác từ nhiều phía – Cho phép đếm mật độ VSV cao, khoảng 150 300 khuẩn lạc Nhược điểm - Không đònh lượng VSV nhạy nhiệt - Không xác đònh hình dạng khuẩn lạc đònh - Khó làm dòng VSV PHƯƠNG PHÁP CẤY BỀ MẶT • Môi trường phải chuẩn bò đóa trước 1-2 ngày để khô mặt • Phương pháp – Cấy 0,1 – 0,3ml vào đóa môi trường (đóa Þ 90mm) Cấy tối đa 1ml vào đóa môi trường (đóa Þ 140mm) – Trải mẫu lên bề mặt môi trường que trang tam giác – Để nhiệt độ phòng 15-20 phút cho khô mặt – Lật ngược đóa để ủ PHƯƠNG PHÁP CẤY BỀ MẶT • Ưu điểm – Đònh lượng VSV nhạy nhiệt – Có thể nhận dạng đựơc dạng khuẩn lạc đặc trưng – Dễ dàng làm chủng VSV mục tiêu Nhược điểm - Chỉ cấy đựơc thể tích mẫu nhỏ (nếu dùng đóa thông thường Þ90-100mm) - Chỉ cho phép đếm số lượng khuẩn lạc thấp PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER) • Khái niệm – Còn gọi phương pháp pha loãng tới hạn – Giá trò kết nhận số lượng VSV mục tiêu có xác suất cao theo nguyên tắc thống kê – Giá trò MPN giá trò có xác xuất cao • Hệ thống MPN – Gồm lần lặp lại nồng độ – Lặp lại nồng độ pha loãng liên tiếp – Chọn độ pha loãng cho hệ thống có ống dương tính ống âm tính – Kết MPN có độ xác cao số ống dương tính âm tính hệ thống tương đương PHƯƠNG PHÁP MPN Chia theo số lượng ống hệ thống - Hệ thống ống: độ pha loãng lặp lại lần - Hệ thống 15 ống: độ pha loãng lặp lại lần Nguyên tắc - Dựa kết đònh tính VSV mục tiêu lần lặp lại độ pha loãng độ pha loãng khác - Vi sinh vật mục tiêu phải có biểu đặc trưng môi trường nuôi cấy lỏng Sự tạo hơi: Coliforms, E coli … Sự đổi màu: S aureus Đặc điểm Cho phép đònh lượng mật độ VSV thấp thể tích mẫu lớn HỆ THỐNG MPN Hệ thống 15 ống • Hệ thống ống 10ml môi trường nồng độ thường (đơn) HỆ THỐNG MPN 10ml môi trường nồng độ đôi 10ml môi trường nồng độ đơn (thường) PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG ATP • Nguyên tắc E + LH2 + ATP E – LH2 AMP + O2 Mg2+ E – LH2 AMP + PPi (1) Oxyluciferin + AMP + CO2 + hv (2) Phản ứng viết lại sau: E + LH2 + ATP +O2 Oxyluciferin + AMP + CO2 + hv +PPi E : luciferase LH2 :luciferin nh sáng phát có bước sóng 562nm, có màu vàng PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG ATP • ATP chủ yếu diện tế bào VSV sống • Đònh lượng VSV thông qua số lượng ATP VSV mẫu • Số lượng ATP phụ thuộc vào điều kiện dinh dưỡng, trạng thái tế bào • Không phân biệt dòng, loài hay nhóm VSV khác PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG ATP • Ưu điểm – Cho phép đònh lượng tổng số vsv mẫu – Cho kết đònh lượng nhanh – Thích hợp cho việc giám sát vệ sinh dây chuyền sản xuất PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG ATP • Nhược điểm – Không phân biệt ATP VSV mẫu – Không phân biệt dòng, loài hay nhóm VSV khác – Cần thiết bò tinh vi, có độ nhạy độ xác cao – Các hoá chất khó bảo quản, nhạy cảm với ánh sáng PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG ATP PHƯƠNG PHÁP ELISA (enzym linked immunosorbent assay • Thiết lập nguyên tắc phản ứng kháng nguyên – kháng thể • Kháng nguyên: đối tượng cần phân tích mẫu • Kháng thể: cố đònh giếng (well) trong kít • Có hai loại phương phát ELISA – ELISA thường (thuận) – ELISA cạnh tranh PHƯƠNG PHÁP ELISA (enzym linked immunosorbent assay) • Bộ kít phản ứng ELISA thuận + Có kháng thể phản ứng - Kháng thể sơ cấp: cố đònh giếng - Kháng thể thứ cấp tự có gắn enzym tạo màu + Cơ chất tạo màu với enzym + Chất rửa + Chất dừng phản ứng enzym NGUYÊN TẮC PHẢN ỨNG ELISA THUẬN Kháng thể thu kháng nguyên Kháng nguyên Cơ chất Kháng thể mang enzyme đánh dấu “Sandwich” Phát quang ĐẶC ĐIỂM • Cường độ màu tỉ lệ thuận với hàm lượng kháng nguyên • Khó phát hàm lượng kháng nguyên thấp PHƯƠNG PHÁP ELISA (enzym linked immunosorbent assay) • Bộ kít phản ứng ELISA cạnh tranh + Có kháng thể - Kháng thể sơ cấp, cố đònh giếng kháng nguyên kháng thể sơ cấp - Kháng thể thứ cấp tự có khả liên kết miễn dòch với kháng thể sơ cấp chất cần phát hiện, không mang enzym + Chất cạnh tranh có mang enzym + Cơ chất tạo màu với enzym + Chất rửa + Chất dừng phản ứng enzym SƠ ĐỒ PHẢN ỨNG ELISA CẠNH TRANH Giếng có kháng thể sơ cấp Mẫu chất cạnh tranh Sự tạo sandwich xãy Rửa Kháng thể thứ cấo cho vào Dừng phản ứng, so màu Hiện màu ƯU, NHƯC ĐIỂM CỦA ELISA • Ưu điểm – Nhanh, nhạy – Dễ dàng tự động hoá – Có thể thực lúc nhiều mẫu Nhược điểm – Tỉ lệ kết dương tính giả cao cần phải khẳng đònh lại – Mỗi đối tượng phân tích phải có kít riêng – Hoá chất dễ hỏng, thời gian bảo quản ngắn PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG MẪU DÒ • Ngyên tắc – Trên sở phương pháp lai phân tử – Có thể phát đối tượng DNA hay RNA – Mức độ chuyên biệt phương pháp phụthuộc vào chuyên biệt mẫu dò (probes) – Mẫu dò mạch RNA hay DNA Phương pháp Lateral Flow Test (LFT) antibody gold particle bacterium membrane Phương pháp Lateral Flow Test (LFT) -Antigen -Antigen 51 [...]... cho vi c phân tích các mẫu thực phẩm rắn KHUẨN LẠC VSV TRÊN MÀNG LỌC 1A 1B 1C 1D E coli trên môi trường ID 2A 2C Coliforms 2B 2C trên môi trường ID PHƯƠNG PHÁP MÀNG PETRI-FILM • Cải biên từ phương pháp đếm khuẩn lạc trên đóa • Thích hợp cho vi c phân tích mẫu tại hiện trường • Không phải bảo quản hay vận chuyển mẫu Nhược điểm - Chỉ áp dụng hạn chế ở một số chỉ tiêu dể nuôi cấy - Chỉ cấy được thể tích. .. ĐỔI KẾT QUẢ MPN • Cs = M x F/V0 x Vs Cs: là khả năng lớn nhất của vi sinh vật có trong thể tích Vs M : chỉ số MPN tra từ bảng đối với độ pha lỗng cơ bản V0 F : nghịch đảo hệ số pha lỗng tương ứng với độ pha lỗng thấp nhất của dãy Vs: Thể tích chuẩn được chọn để biểu thị mật độ vi sinh vật • Nếu tính kết quả là MPN/g thì Vs = 1 PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC • Kích thước lổ lọc 0,47µm hay 0,22µm • Đường kính và... (MULTIFOLDER) CÁC BỘ PHẬN CỦA THIẾT BỊ LỌC VSV PHƯƠNG PHÁP LỌC VSV • Phểu lọc, giá đở màng lọc phải được vô trùng sau mỗi lần lọc • Mật độ VSV trong dòch lọc thích hợp: ... yếu diện tế bào VSV sống • Đònh lượng VSV thông qua số lượng ATP VSV mẫu • Số lượng ATP phụ thuộc vào điều kiện dinh dưỡng, trạng thái tế bào • Không phân biệt dòng, loài hay nhóm VSV khác PHƯƠNG... NHIỀU PHỂU (MULTIFOLDER) CÁC BỘ PHẬN CỦA THIẾT BỊ LỌC VSV PHƯƠNG PHÁP LỌC VSV • Phểu lọc, giá đở màng lọc phải vô trùng sau lần lọc • Mật độ VSV dòch lọc thích hợp: