PHƢƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT & MỘT SỐ VẤN ĐỀ THƢỜNG GẶP TRONG QUÁ TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT Nội dung PHẦN 1: Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật PHẦN 2: Các vấn đề thường gặp trình phân tích VSV PHẦN PHƢƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT Cấy mẫu Đổ 12 – 15 ml PCA (Plate count agar) đƣợc làm nguội 45 – 47oC Trộn dịch mẫu với môi trƣờng Đếm tất đĩa có số KL nằm khoảng 15 – 300 CFU (Đọc thủ công đọc máy đếm khuẩn lạc) Ngày thứ Lật ngƣợc đĩa Ủ 30±1oC/72±3h Đọc & báo cáo Chuyển 1ml mẫu độ pha loãng vào đĩa petri vô trùng Ngày thứ 10 gram mẫu + 90 gram SPW Đồng mẫu máy dập mẫu 30s Chuẩn bị mẫu TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ ISO 4833: 2003 / TCVN 4884:2005 TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ ISO 4833: 2003 / TCVN 4884:2005  V ( n1  0,1n ) d ∑ C: tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa PCA V: Số ml dịch mẫu cấy chuyển.(1ml) d: nồng độ pha loãng cấy vào đĩa n1 : số đĩa có 10 -300 khuẩn lạc nồng độ pha loãng đầu n2 : số đĩa có 10 - 300 khuẩn lạc nồng độ pha loãng sau Tính toán & báo cáo kết N  C ĐỊNH LƢỢNG COLIFORMS ISO 4832: 2006 / TCVN 6848:2007 Đổ 12 – 15 ml VRB (Violet red bile agar) đƣợc làm nguội 45 – 470C Trộn dịch mẫu với môi trƣờng, để yên chờ đông đặc Đổ thêm 5ml VRB đƣợc làm nguội 45 – 470C Ngày thứ Chuyển 1ml mẫu độ pha loãng vào đĩa petri vô trùng Cấy mẫu Chuẩn bị mẫu 10 gram mẫu + 90 gram SPW (Saline peptone water) Đồng mẫu máy dập mẫu 30s Lật ngƣợc đĩa Ủ 37±10C 24±2h (Sữa sản phẩm từ sữa ủ 300C/24h ± 3h) Nuôi Ủ Để yên chờ đông đặc a b A C.F b số khuẩn lạc cho kết dƣơng tính A số khuẩn lạc khẳng định (thƣờng 5) C số khuẩn lạc nghi ngờ đĩa F: hệ số pha loãng Ngày thứ Phản ứng dƣơng tính có khí ống Durham Khẳng định khuẩn lạc nghi ngờ Chọn 5KL cấy sang môi trƣờng BGBL (Brilliant green bile lactose), ủ 300C/37±10C 24±2h Đọc & báo cáo Chọn đĩa 10 -150 để đếm Khuẩn lạc đặc trƣng: màu đỏ tía, xung quanh khuẩn lạc có vùng kết tủa đỏ có đƣờng kính 0,5 mm lớn Ngày thứ ĐỊNH LƢỢNG COLIFORMS ISO 4832: 2006 / TCVN 6848:2007 Cấy mẫu Đổ 12 – 15 ml TBX (Tryptone-bile-glucuronic medium) đƣợc làm nguội 45 – 47oC Trộn dịch mẫu với môi trƣờng Chọn đĩa có 15 -150 để đếm Khuẩn lạc đặc trƣng màu xanh dƣơng Ngày thứ - Lật ngƣợc đĩa, ủ nhiệt độ 440C/21h ± 3h - Nếu nghi ngờ vi khuẩn bị tổn thƣơng, ủ đĩa 370C/4h sau chuyển sang ủ 440C/18-24h Đọc & báo cáo Chuyển 1ml mẫu độ pha loãng vào đĩa petri vô trùng Ngày thứ 10 gram mẫu + 90 gram SPW Đồng mẫu máy dập mẫu 30s Chuẩn bị mẫu ĐỊNH LƢỢNG E.COLI ISO 16649-2:2001 / TCVN 7924-2:2008 ĐỊNH LƢỢNG E.COLI ISO 16649-2:2001 / TCVN 7924-2:2008  V (n1  0,1n2 )d ∑C: tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa PCA V: Số ml dịch mẫu cấy chuyển.(1ml) d: nồng độ pha loãng cấy vào đĩa n1 : số đĩa có 15 -150 khuẩn lạc nồng độ pha loãng đầu n2 : số đĩa có 15 -150 khuẩn lạc nồng độ pha loãng sau Tính toán kết & báo báo N C Cấy chuyển 10ml mẫu độ pha loãng 10-1 vào ống chứa10ml LSBII cấy 1ml 10-1 10-2 10-3 vào ống chứa10ml LSBI Ngày thứ Cân 10 gram mẫu + 90 gram SPW Đồng mẫu máy dập mẫu 30s Cấy mẫu Chuẩn bị mẫu ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG E.COLI GIẢ ĐỊNH ISO 7251:2005 / TCVN 6846:2007 Ủ mẫu Ủ ống 37±10C/24 - 48h 10 ứ ht y g N Xác định kháng nguyên H: Từ khuẩn lạc TSA cấy vào motility agar ủ 37o ± 1oC/24h±3h  Tiến hành thí nghiệm ngưng kết Đọc kết & báo cáo kết ĐỊNH TÍNH SALMONELLA SPP ISO 6579:2002 / TCVN 4829:2005 Tăng sinh Tăng sinh Từ dịch ủ tăng sinh lần lần 2, thực cấy phân lập môi trƣờng TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose agar) TSAT (Tryptone sucrose tetrazolium agar) Ủ 37 ± 10C/24±3h Phân lập Lấy 1mL dịch tăng sinh chọn lọc lần vào ống nghiệm chứa 10 mL ASPW Ủ 41,50C ±10C/18h ± 1h Ngày thứ Ủ 37oC/6h (sản phẩm đông lạnh) 41,5oC/6h (mẫu tƣơi, khô, ƣớp muối) Ngày thứ 2& ASPW (Alkaline saline peptone water) Cân 25g mẫu +225g Ngày thứ ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERAE VÀ V.PARAHAEMOLYTICUS ISO 21872-1:2007 / TCVN 7905-1:2008 Chọn khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trƣờng không chọn lọc có chứa 1% NaCl (Saline nutrient agar) TSA 1%NaCl) Lật ngƣợc đĩa, ủ 37o C± 1oC SNA 1% /24h ± 3h Nhận diện khuẩn lạc Làm Khuẩn lạc Vibrio cholera điển hình TCBS có đặc điểm:nhẵn trơn, màu vàng (sucrosec dƣơng tính), đƣờng kính 2-3mm Khuẩn lạc Vibrio parahaemolytycus điển hình TCBS có đặc điểm: nhẵn trơn, màu xanh (sucrose âm tính), tròn, đƣờng kính 2-3mm Khuẩn lạc Vibrio cholera & Vibrio parahaemolytycus điển hình TSAT có đặc điểm:nhẵn trơn, màu đỏ Ngày thứ & ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERAE VÀ V.PARAHAEMOLYTICUS ISO 21872-1:2007 / TCVN 7905-1:2008 Thực ngƣng kết kháng huyết cho Vibrio cholerae với kháng huyết O1 O139 Khẳng định sơ Khẳng định sinh hoá Indole, Dãy muối 0%, 2%, 4%, 6%,8%, 10% Khẳng huyết Nếu oxidase cho kết dƣơng tính Gram âm, hình phẩy, di động  Khẳng định sinh hoá: ADH, ODC, LDC, ONPG, TSI, Ngày thứ & Thử nghiệm Oxidase: Dùng que cấy nhựa, lấy phần khuẩn lạc phát triển tốt trải lên giấy lọc thử oxidase Quan sát di động: Cấy khuẩn lạc từ SNA vào ống nghiệm ASPW ủ 37± 10C /16h Quan sát di động tiêu giọt treo Ngày thứ & ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERAE VÀ V.PARAHAEMOLYTICUS ISO 21872-1:2007 / TCVN 7905-1:2008 ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERAE VÀ V.PARAHAEMOLYTICUS ISO 21872-1:2007 / TCVN 7905-1:2008 Thử nghiệm V cholera V parahaemolytycus + + + + + + + - + + + Vàng (Sucrose +) + + + + Đỏ Vàng - Vàng - Oxidase ADH ODC LDC ONPG ( ß-galactosidase) NaCl 0% NaCl 2% NaCl 6% NaCl 8% NaCl 10% Indole TSI Mặt nghiêng Đáy ống Sinh khí 33 Báo cáo kết thử nghiệm (Môi trường thử nghiệm chứa 1% NaCl) broth Ủ 37o ± 1oC/48 ± 3h ALOA Từ môi trƣờng nuôi cấy tăng sinh lần & lần dùng que cấy có vòng, cấy ria dịch mẫu đĩa môi trƣờng ALOA PALCAM Ủ 37 ± 1oC/48 ± 3h Tăng sinh Tăng sinh Fraser Phân lập sang ống nghiệm chứa 10 mL Ngày thứ Sau ủ, chuyển 0,1mL dịch mẫu Ngày thứ 1& Cân 25g mẫu + 225g Half Fraser Đồng mẫu 30giây Ủ mẫu 30±1oC/24±3h Ngày thứ ĐỊNH TÍNH LISTERIA MONOCYTOGENES ISO 11290-1: 1996/Amd 1:2004) Chọn khuẩn lạc đặc trƣng cấy vào môi trƣờng thạch TSYEA, ủ 37 ± 1oC /18-24h Nhận diện khuẩn lạc Làm Trên môi trƣờng thạch PALCAM Listeria monocytogenes cho khuẩn lạc đặc trƣng màu xanh Olive hay xanh xám, tâm đen lõm xuống trung tâm sau 48h ủ, bao quanh khuẩn lạc môi trƣờng có màu đen, đƣờng kính khoảng 1,5-2 mm Trên môi trƣờng ALOA khuẩn lạc có màu xanh, Listeria monocytogenes Listeria ivanovii khuẩn lạc có quầng sáng bao quanh sau ủ 24 - 48h Ngày thứ & ĐỊNH TÍNH LISTERIA MONOCYTOGENES ISO 11290-1: 1996/Amd 1:2004) Thử nghiệm catalase (+) Nhuộm Gram (Gram dƣơng, que ngắn mảnh, tế bào có màu xanh tím violet) Thử nghiệm di động cần (giọt treo thạch mềm (molity agar) Di động hình tán dù 25±1oC/48h Nhận diện khuẩn lạc Khẳng định sơ Khuẩn lạc đặc trƣng TSYEA sau ủ: có đƣờng kính 1-2mm, có hình dạng lồi, đục với bờ Nếu khuẩn lạc phân lập không tốt, chọn khuẩn lạc đặc trƣng đĩa cấy lại đĩa TSYEA khác Các thử nghiệm sinh hóa phải đƣợc thự khuẩn lạc Ngày thứ & ĐỊNH TÍNH LISTERIA MONOCYTOGENES ISO 11290-1: 1996/Amd 1:2004) ĐỊNH TÍNH LISTERIA MONOCYTOGENES ISO 11290-1:1996/Amd 1:2004 Lấy khuẩn lạc mọc từ đĩa TSYEA cấy vào đĩa Sheep blood agar nhƣ hình vẽ Ủ 37 ± 10C/18 – 24h 1-2 mm S R Listeria cần khẳng định Listeria innocua (Chứng (-)) Listeria monocytogenes (Chứng (+)) Listeria ivanovii (Chứng (+)) S = Staphylococcus aureus R = Rhodococcus equi Ngày thứ & Lấy khuẩn lạc mọc từ đĩa TSYEA cấy vào ống nghiệm chứa đƣờng Xylose, Rhamnose Ủ 37 ± 10C/24h ± 2h Khẳng định Listeria monocytogenes Lấy khuẩn lạc mọc từ đĩa TSYEA cấy vào môi trƣờng Sheep blood agar Ủ 37 ± 1oC/24h ± 2h ĐỊNH TÍNH LISTERIA MONOCYTOGENES ISO 11290-1:1996/Amd 1:2004 Listeria monocytogenes cho kết CAMP dƣơng tính với Staphylococcus aureus âm tính với Rhodococcus equi Báo cáo KQ: Phát không phát L monocytogenes/25g mẫu Ngày thứ & Listeria monocytogenes cho kết Rhamnose dƣơng tính, Xylose âm tính Đọc kết thử nghiệm sinh hoá Listeria monocytogenes tan huyết ß PHẦN MỘT SỐ VẤN ĐỀ THƢỜNG GẶP TRONG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT -BIỂU HIỆN BẤT THƢỜNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT Môi trường agar không đông -Quá pH thay đổi -Quá Màu môi trường thay đổi -Quá 42 nhiệt -pH thấp -Khối lượng agar không đủ - Agar không tan -Không lắc kỹ đun tan nhiệt -Nước không đạt chất lượng -Pha tạp thành phần khác -Đo pH không nhiệt độ -Máy đo pH không hiệu chuẩn nhiệt -Nước không đạt chất lượng -Môi trường khô/thành phần không đạt CL -Không pH -Pha tạp thành phần khác -BIỂU HIỆN BẤT THƢỜNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT nhiệt -Nước không đạt chất lượng -Môi trường khô/thành phần không đạt CL -Không pH Môi trường -Quá nhiệt bị ức chế/ VSV -Nước không đạt chất lượng, chứa nhiều phát triển chất độc - Môi trường khô/thành phần không đạt CL -Pha/tổng hợp không công thức - Bình chứa/ống đĩa không Môi trường bị kết tủa 43 -Quá -BIỂU HIỆN BẤT THƢỜNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT Tính chọn lọc -Quá Bị nhiễm VSV Khử trùng không cách Kỹ thuật khử trùng không đạt yêu cầu Chất bổ sung bị nhiễm 44 nhiệt -Môi trường khô/thành phần không đạt CL -Pha/tổng hợp không công thức -Chất bổ sung cho vào nóng hay không nồng độ -Chất bổ sung bị nhiễm - Tiêu chuẩn nƣớc, loại nƣớc ứng dụng loại nƣớc phân tich theo TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987) “Siêu tinh khiết” Loại Độ dẫn điện = 0,055 µS/cm “Tinh khiết” Loại Nước siêu tinh khiết dùng cho ứng dụng cao cấp sắc ký lỏng (HPLC), sắc ký ion (IC), phổ hấp thu nguyên tử (AAS), ICPMS, sinh học phân tử Nƣớc tinh khiết dùng cho ứng dụng thông thƣờng nhƣ pha chế hoá chất, pha loãng mẫu, pha dung dịch đệm, cấp nƣớc cho máy phân tích sinh hoá, huyết học, miễn dịch… 0,055 µS/cm < Độ dẫn điện < µS/cm Loại µS/cm < Độ dẫn điện < µS/cm Lƣu ý: Giá trị độ dẫn điện tính 25 oC Nước pha môi trường vi sinh: - Đé dÉn ®iÖn : [...]... monocytogenes cho kết quả Rhamnose dƣơng tính, Xylose âm tính Đọc kết quả thử nghiệm sinh hoá Listeria monocytogenes tan huyết ß PHẦN 2 MỘT SỐ VẤN ĐỀ THƢỜNG GẶP TRONG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT 1 -BIỂU HIỆN BẤT THƢỜNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT Môi trường agar không đông -Quá pH thay đổi -Quá Màu môi trường thay đổi -Quá 42 nhiệt -pH quá thấp -Khối lượng agar không đủ - Agar không tan -Không được lắc kỹ... quả thử nghiệm (Môi trường thử nghiệm chứa 1% NaCl) broth Ủ ở 37o ± 1oC/48 ± 3h ALOA Từ môi trƣờng nuôi cấy tăng sinh lần 1 & lần 2 dùng que cấy có vòng, cấy ria dịch mẫu trên đĩa môi trƣờng ALOA và PALCAM Ủ ở 37 ± 1oC/48 ± 3h Tăng sinh 1 Tăng sinh 2 Fraser Phân lập sang ống nghiệm chứa 10 mL Ngày thứ 2 Sau khi ủ, chuyển 0,1mL dịch mẫu Ngày thứ 1& 3 Cân 25g mẫu + 225g Half Fraser Đồng nhất mẫu trong. .. CẤY VI SINH VẬT nhiệt -Nước không đạt chất lượng -Môi trường khô/thành phần không đạt CL -Không đúng pH Môi trường -Quá nhiệt bị ức chế/ VSV -Nước không đạt chất lượng, chứa nhiều phát triển kém chất độc - Môi trường khô/thành phần không đạt CL -Pha/tổng hợp không đúng công thức - Bình chứa/ống đĩa không sạch Môi trường bị kết tủa 43 -Quá 1 -BIỂU HIỆN BẤT THƢỜNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT... quả ĐỊNH TÍNH SALMONELLA SPP ISO 6579:2002 / TCVN 4829:2005 Tăng sinh 1 Tăng sinh 2 Từ dịch ủ của tăng sinh lần 1 và lần 2, thực hiện cấy phân lập trên môi trƣờng TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose agar) và TSAT (Tryptone sucrose tetrazolium agar) Ủ ở 37 ± 10C/24±3h Phân lập Lấy 1mL dịch của tăng sinh chọn lọc lần 1 vào ống nghiệm chứa 10 mL ASPW Ủ ở 41,50C ±10C/18h ± 1h Ngày thứ 2 Ủ 37oC/6h... nếu sản phẩm nhiễm vi khuẩn Gram dƣơng Đối với những thực phẩm chua (acid) và chứa thành phần gây chua: bảo đảm rằng pH không nhỏ hơn 4,5 trong suốt giai đoạn tiền tăng sinh Ngày thứ 1 Đối với mẫu sản phẩm cacao hoặc sản phẩm chứa Chuẩn bị mẫu & Tiền tăng sinh trong 30giây Ủ ở 37±10C/18h±2h ĐỊNH TÍNH SALMONELLA SPP ISO 6579:2002 / TCVN 4829:2005 Trộn đều dịch mẫu sau khi tiền tăng sinh, chuyển 0,1mL... : dƣơng tính  là C perfringens 2 Không thoả mãn điều kiện 1: âm tính  không phải là C perfringens 20 C b A a.F b A a F là số khuẩn lạc cho kết quả dương tính là số khuẩn lạc khẳng định (thường là 5) là số khuẩn lạc nghi ngờ trên đĩa là hệ số pha loãng Khẳng định lại bằng sinh hoá ở 460C±0,50C/18-24h Đọc kết quả Ủ ở điều kiện hiếu khí Ngày thứ 6 Chuyển nhanh 5 giọt dịch vào môi trƣờng Lactose suphite... gram SPW Đồng nhất mẫu trong máy dập mẫu trong 30s Trải bằng que trải vô trùng & ủ ở nhiệt độ 37± 10C/24-48h 12 Đếm các đĩa có số khuẩn lạc ít hơn 300, khuẩn lạc điển hình của Staphylococcus dƣơng tính coagulase có mầu đen hoặc xám, bóng, lồi có d=1-2,5mm, đƣợc bao quanh bởi 1 vòng trong và/hoặc 1 vòng đục  V ( n 1  0 ,1 n ∑C: tổng số khuẩn lạc có phản ứng coagulase +/các đĩa V: Số ml dịch mẫu được... định sơ bộ Khẳng định sinh hoá Indole, Dãy muối 0%, 2%, 4%, 6%,8%, 10% Khẳng huyết thanh Nếu oxidase cho kết quả dƣơng tính và Gram âm, hình phẩy, di động  Khẳng định sinh hoá: ADH, ODC, LDC, ONPG, TSI, Ngày thứ 5 & 6 1 Thử nghiệm Oxidase: Dùng que cấy nhựa, lấy một phần của khuẩn lạc phát triển tốt trải lên giấy lọc thử oxidase 2 Quan sát di động: Cấy khuẩn lạc từ SNA vào ống nghiệm ASPW và ủ ở 37±... kính 2-3mm 2 Khuẩn lạc Vibrio parahaemolytycus điển hình trên TCBS có đặc điểm: nhẵn trơn, màu xanh (sucrose âm tính), tròn, đƣờng kính 2-3mm 3 Khuẩn lạc Vibrio cholera & Vibrio parahaemolytycus điển hình trên TSAT có đặc điểm:nhẵn trơn, màu đỏ Ngày thứ 3 & 4 ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERAE VÀ V.PARAHAEMOLYTICUS ISO 21872-1:2007 / TCVN 7905-1:2008 Thực hiện ngƣng kết kháng huyết thanh cho Vibrio cholerae với... bengal chloramphenicol) Ngày thứ 5 10 gram mẫu + 90 gram Peptone water 0.1% Đồng nhất mẫu trong máy dập mẫu trong 30s Chuẩn bị mẫu ĐỊNH LƢỢNG NẤM MEN & NẤM MỐC ISO 21527-1:2008 / TCVN 8275-1:2010 Trải bằng que trải vô trùng & ủ ở nhiệt độ 25± 10C/3-5 ngày 23 Đếm các đĩa có số khuẩn lạc ít hơn 150, đếm và tính riêng số khuẩn lạc nấm men, nấm mốc trên tất cả các đĩa cấy Cấy mẫu Ủ mẫu Đọc kết quả glycerol ...Nội dung PHẦN 1: Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật PHẦN 2: Các vấn đề thường gặp trình phân tích VSV PHẦN PHƢƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT Cấy mẫu Đổ 12 – 15 ml PCA (Plate... tính Đọc kết thử nghiệm sinh hoá Listeria monocytogenes tan huyết ß PHẦN MỘT SỐ VẤN ĐỀ THƢỜNG GẶP TRONG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT -BIỂU HIỆN BẤT THƢỜNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT Môi trường... mẫu TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ ISO 4833: 2003 / TCVN 4884:2005 TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ ISO 4833: 2003 / TCVN 4884:2005  V ( n1  0,1n ) d ∑ C: tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa PCA V: Số ml