ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ PHƯƠNG KHANH NUÔI CẤY VÀ TẠO RỄ CÂY HOÀN NGỌC (Pseuderanthemum Bracteatum) TRONG ĐIỀU KIỆN IN-VITRO ĐỂ THU NHẬN BETULIN- HỢP CHẤT THỨ CẤP CHUYÊN NGÀNH: SINH LÝ THỰC VẬT Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS BÙI VĂN LỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2011 LỜI CẢM ƠN Luận văn hoàn thành nhờ giúp đỡ hỗ trợ từ thầy cô, bạn em trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên TPHCM phòng thí nghiệm Nuôi Cấy Mô trường Đại Học Mở TPHCM Do xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến: Thầy Bùi Văn Lệ trực tiếp ướng dẫn, gợi ý đề tài dẫn tận tình cho suốt thời gian thực đề tài Thầy Bùi Trang Việt, Thầy Nguyễn Du Sanh, cô Võ Thị Bạch Mai thầy cô môn Sinh Lý Thực Vật giảng dạy, cung cấp kiến thức kỹ suốt thời gian học tập Bạn Nguyễn Thành Hải giúp đỡ hỗ trợ cho kinh nghiệm làm việc quý báu Các em Từ Thêu Anh, Nguyễn Hoàng Phong hỗ trợ trình thực đề tài Ba mẹ hỗ trợ suốt bước sống Chồng hỗ trợ nhiều để yên tâm học tập thực đề tài i MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY HOÀN NGỌC 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Nguồn gốc phân bố 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.1.4 Thành phần hoá học 1.1.5 Công dụng 1.2 HỢP CHẤT THỨ CẤP VÀ BETULIN 1.2.1 Giới thiệu sơ lược hợp chất thứ cấp 1.2.2 Ứng dụng công nghệ tế bào thu nhận hợp chất thứ cấp 11 1.2.2.1 Tầm soát (screening) chọn lọc (selection), tối ưu hóa môi trường nuôi cấy (medium ptimization) 11 1.2.2.2 Biệt hóa tế bào 12 1.2.2.3 Cố định tế bào (Immobilized cells) 14 1.2.2.4 Gợi kích thích (Elicitation) 14 1.2.2.5 Công nghệ đường biến dưỡng 15 1.2.3 BETULIN 16 1.3 NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT ĐỂ THU NHẬN HỢP CHẤT THỨ CẤP 17 1.3.1 Các hệ thống tế bào in vitro 17 1.3.3.1 Mô sẹo 17 1.3.3.2 Biện pháp làm tăng sản lượng hợp chất thứ cấp nuôi cấy tế bào 18 Tối ưu hoá điều kiện môi trường 18 ii • Môi trường 18 • Nhiệt độ, pH, ánh sáng, nồng độ oxy 18 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 Vật liệu phương pháp 20 2.1 Vật liệu 20 2.1.1 Địa điểm thời gian thực thực đề tài 20 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.3 Mẫu cấy 20 2.1.4 Môi trường nuôi cấy 20 2.1.4.1 Môi trường chung 20 2.1.4.2 Các loại môi trường 21 2.1.5 Điều kiện nuôi cấy 21 2.1.6 Dụng cụ kỹ thuật 21 2.1.7 Dụng cụ trang thiết bị hóa chất nuôi cấy 23 2.2 Phương pháp 24 2.2.1 Khử mẫu 24 2.2.2 Bố trí thí nghiệm 25 2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy dung dịch canxi hypocloric với nồng độ khác 25 iii 2.2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát phát triển chồi từ đoạn đốt thân ảnh hưởng kết hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA BA 26 2.2.2.3 Thí nghiệm 3: Tăng sinh rễ từ chồi thu đoạn đốt thân 26 2.2.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả tạo mô sẹo từ thân non non in vitro 27 2.2.2.5 Thí nghiệm 5: Tái sinh rễ từ mô sẹo thân non hoàn ngọc 27 2.2.2.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng BA lên khả tạo chất thứ cấp betulin thân in vitro hoàn ngọc 28 2.2.2.7 Phân tích hàm lượng betulin thu giai đoạn 29 2.2.2.8 Phương pháp khuếch tán môi trường thạch……………………………… 30 2.2.3 Phương pháp thu nhận số liệu 31 2.2.4 Bố trí thí nghiệm 31 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy dung dịch canxi hypocloric với nồng độ khác 32 3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát phát triển chồi từ đoạn đốt thân ảnh hưởng kết hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA BA 34 3.3 Thí nghiệm 3: Tăng sinh rễ từ chồi thu đoạn đốt thân 37 3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả tạo mô sẹo từ thân non non in vitro 40 3.5 Thí nghiệm 5: Tái sinh rễ từ mô sẹo thân non hoàn ngọc 46 3.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng BA lên khả tạo chất thứ cấp betulin thân in vitro hoàn ngọc 48 iv 3.7 Phân tích hàm lượng betulin thu giai đoạn 50 3.8 Vòng vô khuẩn: thân in vitro hoàn ngọc chiết dung môi ethanol 96o với tỷ lệ 1g trọng lượng khô / 100ml ethanol 96o 54 3.9 Hình thái giải phẫu mẫu rễ thân hoàn ngọc in vitro phát sinh từ mô sẹo thân 55 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 Kết luận 59 Kiến nghị……………………………………………………………………………… 59 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Các nghiệm thức sử dụng khảo sát phát sinh chồi từ đoạn đốt thân sau khử mẫu đạt 21 Bảng 2: Các nghiệm thức sử dụng khảo sát tạo mô sẹo từ đoạn đốt thân in vitro hoàn ngọc 22 Bảng 3: Các nghiệm thức sử dụng khảo sát ảnh hưởng NAA qua trình tái sinh rễ từ mô sẹo thân hoàn ngọc 22 Bảng 4: Các nghiệm thức sử dụng khảo sát ảnh hưởng BA trình tái sinh từ mô sẹo thân in vitro hoàn ngọc 23 Bảng 6: Hàm lượng betulin thu 29 Bảng 7: Tỉ lệ mẫu bị nhiễm tái sinh sau thời gian nồng độ chất khử trùng khác 32 Bảng 8: Tỉ lệ mẫu tạo chồi từ đoạn đốt thân hoàn ngọc môi trường khác nhau35 Bảng 9: Hàm lượng betulin quan hoàn ngọc 38 Bảng 10: Ảnh hưởng nồng độ 2,4-D kết hợp với BA lên tạo mô sẹo từ thân non hoàn ngọc in vitro 41 Bảng 11: Ảnh hưởng nồng độ 2,4-D kết hợp với BA lên tạo mô sẹo từ non hoàn ngọc in vitro 43 Bảng 12: Chiều dài rễ số rễ in vitro nhân sinh khối môi trường khác 46 Bảng 13: Sự tăng sinh in vitro 48 viii DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1: Tỷ lệ sống tái sinh đoạn đốt thân hoàn ngọc 33 Biểu đồ 2: Tỷ lệ mẫu tạo chồi từ đoạn đốt thân hoàn ngọc 35 Biểu đồ 3: So sánh hàm lượng betulin quan hoàn ngọc in vitro tự nhiên 39 Biểu đồ 4: Sự tạo mô sẹo từ thân non hoàn ngọc in vitro 41 Biểu đồ 5: Sự tạo mô sẹo từ non hoàn ngọc in vitro 43 Biểu đồ 6: Chiều dài rễ số rễ biệt hóa từ mô sẹo thân non in vitro 47 Biểu đồ 7: Sự tăng sinh in vitro từ mô sẹo 49 Biểu đồ 8: Biểu đồ betulin thu giai đoạn 51 v DANH MỤC HÌNH Hình Cây hoàn ngọc trồng chậu Đà Nẵng Hình Sơ đồ: Con đường sinh tổng hợp sản phẩm chuyển hóa bậc hai tế bào thực vật Hình Mối quan hệ chất cấp chất thứ cấp thực vật 10 Hình Lông rễ tạo thành nuôi cấy rễ Atropa belladonna 13 Hình Khung betulin 16 Hình 6: Mẫu cấy 20 Hình 7: Các đoạn đốt thân hoàn ngọc sống tái sinh 34 Hình 8: Các đoạn đốt thân hoàn ngọc không nhiễm không tái sinh 34 Hình 9: Ảnh hưởng BA kết hợp NAA lên phát sinh chồi từ đoạn đốt thân hoàn ngọc 36 Hình 10: Cây phát triển sau 12 tuần nuôi cấy 37 Hình 11: Mô sẹo hình thành từ đoạn thân non phát triển tốt 42 Hình 12: Mô sẹo hình thành từ đoạn thân non bị hóa nâu 42 Hình 13: Mô sẹo hình thành từ in vitro hoàn ngọc 44 Hình 14 : Rễ biệt hóa từ mô sẹo thân non in vitro 47 Hình 15: Cây in vitro tái sinh từ mô sẹo sau tuần nuôi cấy 49 vi Hình 16: Cây in vitro tái sinh từ mô sẹo sau 12 tuần nuôi cấy 50 Hình 17: Đối chứng – dung môi ethanol 96o 54 Hình 18: Vòng kháng khuẩn betulin 54 Hình 19: Hình giải phẫu rễ 55 Hình 20: Hình giải phẫu thân non hoàn ngọc 56 Kết thảo luận 48 Ngay phôi, tiền bì trở thành biểu bì, mô trở thành vỏ nội bì, phần tạo mô dẫn truyền sơ cấp, chu luân tượng tầng libe gỗ Sự tăng trưởng theo đường kính rễ tùy thuộc vào thành lập mô thứ cấp hoạt động mô phân sinh bên, đặc biệt tượng tầng libe gỗ Dưới ảnh hưởng auxin, tế bào tạo phía tượng tầng chuyên hóa thành mô libe thứ cấp, tế bào tạo phía tượng tầng tạo nên mô gỗ thứ cấp Do chuyển mô sẹo vào môi trường bổ sung 0,4 mg/l NAA có tượng biệt hóa rễ tăng sinh rễ xẩy mạnh mẽ 3.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng BA lên khả tạo chất thứ cấp betulin thân in vitro hoàn ngọc a Mục đích thí nghiệm: Tìm môi trường tối ưu cho tái sinh từ mô sẹo Tìm nồng độ BA thích hợp tác động tạo betulin nhiều b Tiến hành thí nghiệm: Mô sẹo sau tuần biệt hóa thành rễ cấy chuyền qua môi trường MS có bổ sung BA có nồng độ thay đổi theo bảng Sau tuần nuôi cấy ta thu số liệu theo bảng sau: Bảng 13: Sự tăng sinh in vitro Ký hiệu môi Trọng lượng Trọng lượng khô trường tươi (g) (g) D18 0,630 ± 0,018a 0,400 ± 0,022a 1,910± 0,108c 1,520 ± 0,064b 0,770 ± 0,025b 0,470 ± 0,028a (MS+0,2mg/lBA) D19 (MS+0,4mg/lBA) D20 (MS+0,6mg/lBA) Kết thảo luận 49 T r ọ n g lư ợ n g (g ) Sự tăng sinh in-vitro Trọng lượng tươi(g) Trọng lượng khô(g) D18 D19 D20 Môi trường Biểu đồ 7: Sự tăng sinh in vitro từ mô sẹo Kết cho thấy in vitro tái sinh từ mô sẹo tăng sinh nhiều môi trường D19 ( MS + 0,4mg/l BA) Tiến hành nuôi cấy tiếp tuần để thu thân in vitro hoàn ngọc Đem thân in vitro thu chiết xuất cao gửi mẫu chạy sắc ký HPLC-UV 2cm Hình 15: Cây in vitro tái sinh từ mô sẹo sau tuần nuôi cấy Kết thảo luận 50 2cm 2cm 2cm D18 (MS + 0,2mg/l BA) D19 (MS + 0,4mg/l BA) D20( MS + 0,6mg/l BA) Hình 16: Cây in vitro tái sinh từ mô sẹo sau 12 tuần nuôi cấy 3.7.Phân tích hàm lượng betulin thu giai đoạn: Ký hiệu Cơ quan thu Giai đoạn thu Phương Hàm lượng Ghi mẫu pháp betulin(µg/ g) Rễ Rễ Cây hái mẫu in 0,85 vivo Thân Thân Cây hái mẫu in 8,0 vivo Lá Lá Cây hái mẫu in [...]... giữa hợp chất sơ cấp và thứ cấp được mô tả như hình dưới: Hình 3 Mối quan hệ giữa các chất nhất cấp và chất thứ cấp ở thực vật (Dörnenburg H and Knorr D (1996)) [5]   11    Tổng quan tài liệu 1.2.2 Ứng dụng công nghệ tế bào trong thu nhận hợp chất thứ cấp Nuôi cấy tế bào thực vật với qui mô lớn từ lâu đã được xem là một nguồn tiềm năng trong việc sản xuất các hợp chất thứ cấp Các mô tế bào nuôi cấy. .. các hợp chất thứ cấp từ mô sẹo đã qua vài lần cấy chuyền thường ổn định hơn mô sẹo khởi đầu hay dịch treo tế bào Mặt khác, người ta thường nuôi cấy mô sẹo để giữ giống vì có thời gian nuôi cấy dài hơn (Razdan, 2003) [13] 1.3.1.2 Biện pháp làm tăng sản lượng các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào Tối ưu hoá điều kiện môi trường • Môi trường Vài trò của một số chất hoá học và các yếu tố vật lý trong. .. vật kích thích sự tạo lông rễ (hairy roots) (Hình 4)   13    Tổng quan tài liệu Hình 4 Lông rễ được tạo thành trong nuôi cấy rễ cây Atropa belladonna (Yun et al 1992) Ưu điểm của lông rễ khi so sánh với rễ bình thường là lông rễ có thể tăng trưởng trong môi trường mà không cần dùng đến hormone Lông rễ cũng tạo ra các hợp chất thứ cấp tương tự cây mẹ Một ví dụ cho thành công này về thu nhận tropane alkaloids... lá và rễ cây làm thu c từ thời kỳ xa xưa Y học dân gian cổ truyền của các dân tộc cũng có nhiều kinh nghiệm trong việc dùng lá, thân và rễ cây hoàn ngọc để chữa nhiều bệnh trong đó có công dụng chữa những rối loạn do nhiễm khuẩn đường tiêu hóa Các nhà khoa học cũng có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng chữa bệnh của cây hoàn ngọc ngoài tự nhiên nhưng nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy cây hoàn ngọc. .. được áp dụng Một trong số đó là phương pháp nuôi cấy các tế bào biệt hóa Theo lý thuyết, các hợp chất thứ cấp là một dạng của sự biệt hóa Ở thực vật, có mối liên hệ rất rõ ràng về biệt hóa tế bào và biến dưỡng hợp chất thứ cấp Cấu trúc lông rễ và hoa là những ví dụ rất điển hình về mối liên hệ này Thông thường, các chồi và rễ in vitro được tạo thành nhờ vào sự kết hợp các nồng độ auxin và/ hoặc cytokinin... định trong các nghiên cứu khi nuôi cấy tế bào để sản xuất hợp chất thứ cấp Nhiệt độ thích hợp cho việc nuôi cấy mô sẹo và tế bào là khoảng 17 – 25oC Toivonen và cộng sự (1992) nhận thấy khi giảm nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy sẽ làm tăng lượng acid béo tổng số trong mỗi tế bào (tính theo trọng lượng khô) [9] Độ pH tối ưu thu c vào khoảng 5 – 6 trước khi hấp khử trùng pH rất cần được kiểm soát trong. .. 100.000 các hợp chất thứ cấp ở thực vật khác nhau, và hàng năm một số lượng lớn các chất mới được phát hiện thêm Nguồn gốc của các chất thứ cấp là các điểm cuối cùng của quá trình biến dưỡng, với chức năng ít chuyên biệt (Harborne 1978, Harborne & Tomas-Barberan 1991) [7] Tại sao cây lại sản xuất những hợp chất này đến nay chưa rõ hết được Trong nhiều trường hợp, thực vật tạo ra các hợp chất thứ cấp để chống... bracteatum Tên thông thường: cây hoàn ngọc, cây tú linh, cây con khỉ   Hình 1 Cây hoàn ngọc trồng trong chậu tại Đà Nẵng     3    Tổng quan tài liệu 1.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố: Phần lớn là cây thân thảo, cây bụi nhiệt đới Họ này có thể được tìm thấy trong các rừng rậm và rừng thưa, trên các bụi cây hay trên các cánh đồng và thung lũng ẩm ướt, ven biển và trong các khu vực biển, đầm lầy Cây mọc phổ biến ở... đóng vai trò quan trọng trong việc cấu trúc nên cơ thể, những chất đó được gọi là những hợp chất sơ cấp Gồm có các polysaccharide, đường, protein và chất béo Ngoài những chất đó ra, còn có những hợp chất khác có nồng độ ít hơn gọi là các hợp chất thứ cấp, gồm có alkaloid, terpenoid, phenolic, steroid và flavonoid Các chất này rất đa dạng về cấu trúc và kích thước, và được tìm thấy trong rất nhiều loài... thực vật, tuy nhiên kỹ thu t nuôi cấy phải phù hợp với từng loài (Pierik, 1987) [10] Mô sẹo hình thành từ mô hay cơ quan thực vật có khả năng tổng hợp các hợp chất biến dưỡng thứ cấp tương tự cây mẹ do đặc tính này được qui định bởi yếu tố di truyền Mô sẹo thường không được sử dụng để sản xuất hợp chất thứ cấp mà để dùng làm   18    Tổng quan tài liệu nguyên liệu ban đầu nuôi cấy tạo huyền phù tế bào ... Rửa lại nước máy 4-5 lần - Tiến hành sát trùng cồn 70o 30 giây - Rửa lại nước cất vô trùng 3-4 lần - Sau đưa mẫu vào bình erlen, đạy nút lại đưa vào tủ cấy Thao tác tủ cấy - Lắc khử trùng canxi... leucin cao (2 5-1 50mg% 4 6-8 5mg%) Đó acid amin giữ vai trò quan trọng sinh tổng hợp protein bắp chống mỏi mệt cho thể Thiếu chúng thể bị sụt cân nhanh Lá hòan ngọc giàu valin (2 9-1 001mg%).Thiếu... chung: Sử dụng môi trường nuôi cấy MS bản, bổ sung số thành phần: 21 - Đường: 30g/l - Agar Việt Xô: 7,5g/l - pH: 5, 8-5 ,9 - Than hoạt tính: 1g/l Kết thảo luận 2.1.4.2.Các loại môi trường: Chất