BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỈ THUẬT MÔI TRƯỜNG  oOo  Đề tài: PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ BÀI TIỂU LUẬN TỔ Môn: KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI Giảng viên hướng dẫn: Hồ Thị Tiến TP HCM, Tháng 12 năm 2015 BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỈ THUẬT MÔI TRƯỜNG  oOo  huf Đề tài: PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ BÀI TIỂU LUẬN NHÓM Môn: KỶ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA HIỆN ĐẠI Giảng viên hướng dẫn: Hồ Thị Tiến Nhóm sinh viên thực Nguyễn Văn Thanh Toàn Huỳnh Ngọc Quang Nguyễn Thanh Duy Huỳnh Thanh Hải TP.HCM, Tháng 12 năm 2015 3008140299 3008140018 3008140188 3008140339 LỜI CẢM ƠN Chúng xin trân thành cảm ơn cô Hồ Thị Tiến tận tình bảo, hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian học tập.Một lần nhóm xin trân thành cảm ơn cô Mặc dù tiểu luận hoàn thành khó tránh sai sót.Mong nhận đóng góp ý kiến thầy cô bạn để tiểu luận hoàn thiện Từ đó,chúng có thêm nhiều kinh nghiệm để thực tiều luận đồ án sau nghề nghiệp tương lai Sau xin chúc cô Hồ Thị Tiến toàn thể thầy cô Khoa thật dồi sức khỏe, niềm vui để tiếp tục thực sứ mệnh cao đẹp truyền đạt kiến thức cho hệ mai sau Trân trọng cảm ơn! NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN LỜI CAM ĐOAN Chúng xin cam đoan: Bài tiểu luận thành viên nhóm chung tay làm việc,có phân công rõ ràng công thành viên nhóm Đồng thời, không chép tiểu luận Các nội dung báo cáo tham khảo kỉ lưỡng trước đưa vào tiều luận.Chúng chịu hoàn toàn trách nhiệm trước cô Khoa cam đoan TP.HCM, ngày tháng 12 năm 2015 NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT EI Electron Impact (va chạm electron) CI Chemical Ionization (Ion hóa hóa học) ESI Electrospray Ionization (ion hóa tia lửa điện) TSI Thermospray Ionization (ion hóa nhiệt) APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionzation (ion hóa hóa học áp suất khí quyển) FAB tử) Fast- Atom Bombardment (bắn phá nhanh nguyên FIB Fast- Ion Bombardment (bắn phá nhanh ion) MALDI giải hấp laser) Matrix- Assisted Laser Desorption Ionization (ion TOF Time- Of Flight analyser (bộ phân tích thời gian bay) ICR Ion Cyclotron Resonance Analyser (bộ phân tích cộng hưởng ion cylotron) DANH MỤC CÁC BẢNG Số thứ tự Tên bảng Trang Bảng 3.1: Đồng vị bền số nguyên tố Bảng 3.2: Kết khảo sát lượng đồng vị Bảng 3.3: Thành phần hoá học tinh dầu từ gỗ Sa mộc dầu (Cunninghamia konishii Hayata) phân bố Tây Côn Lĩnh Bảng 3.4: Dư lượng kháng sinh quinolone (ng.g-1) mẫu thịt gà, thịt heo, tôm, cá diêu hồng 11 12 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH ẢNH 13 15- 16 Số thứ Tên hình tự Hình 1.1: Máy khối phổ Hình 2.1: Sơ đồ khối máy khối phổ 10 11 12 13 14 Hình 2.2 : Giao diện ESI máy khối phổ sơ đồ tạo ion dương nguồn ESI Hình 2.3: Giao diện APCI cột HPLC vả máy khối phổ Hình 2.4: Sơ đồ mô tả hoạt động hệ thống MALDI Hình 2.5: Biểu đồ lựa chọn kiểu tạo ion Hình 2.6: Bộ phân tích từ hội tụ đơn Hình 2.7: Bộ phân tích tứ cực đơn Hình 2.8: Sơ đồ bẫy ion Hình 2.9: Bộ phân tích tứ cực chập ba Hình 2.10: Sơ độ phân tích thời gian bay TOF Hình 2.11: Sơ đồ bẫy Penning trình tạo tín hiệu Hình 3.1: Sự thay đổi cấu dạng cảm ứng với cAMP Epac2 xác định DXMS Hình 3.2: Đường hồi qui quinolone Tran g 6 7 9 10 10 14 15 MỤC LỤC PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ LỜI MỞ ĐẦU Trong phát triển xã hội ngày nay, tất công việc giới hóa đại hóa phù hợp với xã hội ngày văn minh Các nghành khoa học cần phải đổi đại nghành khoa học nghiên cứu Nghành Công Nghệ Sinh Học số Là ngành khoa học nghiên cứu với kỉ thuật công nghệ cao đáp ứng nhu cầu đặt Nghành, cần kỉ thuật, phương tiện để đáp ứng nhu cầu Đây lí mà môn “Kỷ thuật phân tích sinh hóa đại “ xem môn sở nghành cung cấp cho người học cách nhìn tổng quan phương pháp, trang thiết bị phục vụ cho việc nghiên cứu môn học sau Trên sở kiến thức học môn học: nhóm giao thực đề tài “Phân tích khối phổ” với mục đích tìm hiểu thêm đề nâng cao kiến thức học cho thân bạn Mặc dù cố gắng kiến thức hạn hẹp thời gian thực không nhiều nên đề tài nhiều hạn chế sai sót Đề tài nhóm chia làm phần sau: Phần I: Giới thiệu: Tìm hiểu tổng quan nguyên lí làm việc máy khối phổ Phần II: Máy khối phổ: Trình bày sơ nét phận thức hoạt động máy:     Bộ nạp mẫu Bộ nguồn ion Bộ phân tích khối Detector Phần III: Ứng dụng: Trình bày cách khái quát ứng dụng kỷ thuật đồng thời đưa ví dụ cụ thể nhà khoa học trước thực Chúng mong góp ý cô Hồ Thị Tiến, thầy cô khoa bạn để luận hoàn thiện ngày tốt NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN Page | Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ Khối phổ (mass spectrometry – MS), kỹ thuật quang phổ nhà vật lí học người Anh Joseph John Thomson phát minh vào năm 1897 Chính nhờ kỉ thuật giúp Thomson phát đồng vị nguyên tố chứng minh tồn hai đồng vị khí Neon Với phát minh giúp Thomson giành giải thưởng Nobel năm 1906 GIỚI THIỆU I 1.1 Tổng quan Từ năm 1940 phân tích khối phổ hữu đời để ứng dụng vào phân tích sản phẩm ngành cộng nghiệp dầu hỏa Đến năm 70, khối phổ ứng dụng rộng rãi nghiên cứu y sinh Hiện phân tích khối phổ kỉ thuật phổ biến sử dụng nhiều lĩnh vực khác để xác định thành phần chất vô hữu Hình 1.1: Máy khối phổ Phương pháp khối phổ (MS) kỹ thuật phân tích hóa học giúp xác định hàm lượng loại chất hóa học có mẫu cách đo tỷ lệ khối lượng điện tích số lượng ion pha khí từ phân tử nguyên tử mẫu Tỉ số biểu thị đơn vị khối lượng nguyên tử dalton Nếu biết điện tích ion ta dễ dàng xác định khối lượng ion Như vậy, nghiên cứu khối phổ chất nào, trước tiên phải chuyển sang trạng thái bay hơi, sau ion hoá phương pháp thích hợp Các ion tạo thành đưa vào nghiên cứu phân tích khối máy khối phổ Tùy theo loại điện tích ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion dương (+) Page | 10 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ âm (-) Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin ion nghiên cứu nên dùng phổ biến 1.2 Nguyên lý khối phổ Khối phổ kỹ thuật phân tích đo phổ khối lượng phân tử tích điện chúng di chuyển điện trường Các ion tạo thành buồng ion hóa, gia tốc tách riêng nhờ phận phân tích khối phổ trước đến detector Tất trình diễn hệ thiết bị chân không, áp suất hệ giao động khoảng từ 10-3 Pa đến 10-6 Pa Tín hiệu tương ứng với ion thể số vạch (pic) có cường độ khác tập hợp lại thành khối phổ đồ phổ khối Dữ liệu phổ khối tự động ghi lại sử dụng để nhận dạng mẫu công cụ tin sinh học Đồng thời, xác định cấu trúc định lượng chất mẫu mà ta phân tích II MÁY KHỐI PHỔ 2.1 Tổng quan máy khối phổ Hệ thống khối phổ có nhiều loại ứng dụng đa dạng lĩnh vực khác Tùy theo chức nhiệm vụ mà phận cấu tạo khác thông thường máy khối phổ thường có năm phận sau: • Bộ phận nạp mẫu: Đưa mẫu vào máy, mẫu dạng lỏng rắn cần phải chuyển sang dạng biện pháp thích hợp • Bộ nguồn ion: Ion hóa phân tử, nguyên tử mẫu trạng thái khí • Bộ phân tích khối: Tách ion theo tỉ số khối lượng điện tích ion (m/z) Các ion gia tốc tách riêng nhờ tác dụng từ trường , điện trường để đến detector • Bộ phận ghi phổ (detector): Có nhiệm vụ chuyển ion đến thành tín hiệu điện đo hệ điện tử máy khối phổ • Bộ xử lí liệu: Dữ liệu ghi lại nhận dạng hệ thống tin sinh học Tín hiệu điện từ detector khuếch đại trước chuyển thành tín hiệu số phục vụ xử lí liệu theo yêu cầu khác nhau: ghi phổ khối, so sánh với liệu phổ thư viện phổ hay định lượng mẫu,…: Page | 11 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ Hình 2.1: Sơ đồ khối máy khối phổ Các phận trình bày chi tiết phần sau II.2 Nguyên lí làm việc máy khối phổ Ban đầu, mẫu nạp vào máy dạng khí Sau mẫu chuyển đến nguồn ion để ion hóa thành ion trạng thái tích điện khác nhau, ion mẫu phân tách dựa khác biệt tỉ số giá trị m/z, detector ghi liệu phổ khối ion phân tách với trợ giúp phần mềm tin sinh học cho phép tìm kiếm sở liệu phân tích kết thu Máy khối phổ không đo khối lượng (m) mà chúng đo giá trị m/z (mass/charge ratio) Tùy thuộc vào loại nguồn phân tích khối mà máy khối phổ có cấu hình nguyên tắc hoạt động khác II.3 Chi tiết phận máy khối phổ Bộ nạp mẫu: Có thể phân thành hai nhóm chính: Nạp mẫu trực tiếp Mẫu đưa trực tiếp vào máy không cần thông qua thiết bị phân tích khác Chẳng hạn, với mẫu lỏng ta đặt mẫu vào chén thạch anh bề mặt kim loại đưa vào buồng trung gian (áp suất giảm) trước đưa vào buồng chân không máy Ở phần mẫu tách nhờ màng bán thấm đưa thẳng vào buồng ion hóa Đôi người ta nhiệt phân mẫu, khí tạo đưa vào buồng ion hóa máy khối phổ dùng kết nối GC/MS (Gas Chromatography/ Mass Spectrometry) II.3.1.2 Nạp mẫu gián tiếp Ở nạp mẫu có đầu kết nối với thiết bị phân tích khác nối với máy quét phổ, chẳng hạn kiểu sau: • GC/ MS (Gas Chromatography/ Mass Spectrometry): Đầu cột mao quản hệ thống sắc kí khí (GC) nối trực tiếp với nguồn ion máy khối phổ • LC/MS (Liquid Chromatography/ Mass Spectrometry): Khi chất phân tích khó bay dễ phân hủy nhiệt phân tích GC, cần kết nối với hệ thống sắc kí lỏng (LC) Khó khăn phải chuyển chất phân tích từ pha lỏng sang pha để ion hóa.(Sẽ trình bày cụ thể phần 2.3.2) • SFC/ MS ( Supercritical Fluid Chromatography/ Mass Spectrometry): Pha động CO2 siêu tới hạn chuyển thành pha khí trước vào buồng ion hóa • CE/ MS (Capillary Electrophoresie/ Mass Spectrometry): Các chất dung dịch rữa giải từ mao quản đưa vào buồng ion hóa Trong số trường hợp cần thêm dung môi để tăng tốc độ dòng Hạn chế kết nối thể tích mẫu nhỏ cần phải dùng dung dịch đệm dễ bay II.3.2 Bộ nguồn ion Đây phận ion hóa mẫu phân tử, nguyên tử sang trạng thái khí, thực tế có nhiều phương pháp ion hóa mẫu Dưới nhiều phương pháp cụ thể sau: II.3.1 II.3.1.1 Page | 12 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ Va chạm electron (EI) Trong buồn ion hóa electron (e) phát từ catot vonfram reni đốt nóng Chùm tia e bay phía anot với vận tốc lớn (có lượng khoảng 70 eV) va chạm với phân tử nguyên tử mẫu Một e công phân tử với lượng lớn loại e khác khỏi phân tử Quá trình ion hóa mẫu phương pháp EI thường tao ion dòng điện đơn có e không cặp đôi Đó ion gốc, phân tử ban đầu mang điện tích gọi ion phân tử Quá trình ion hóa phương pháp EI tạo catot anot: M + 1eM+ + 2eM + 1eMKí hiệu + cation gốc tạo thành Ưu điểm:  Làm việc với cation gốc cho nhiều thông tin Nhược điểm:  Tạo nhiều mảnh nhỏ  Ít chí ion phân tử nên khó biện giải phổ  Không thích hợp với chất phân cực dễ bị nhiệt phân hủy (phải hóa mẫu trước) II.3.2.2 Ion hóa hóa học (CI) Ion hóa hóa học kỉ thuật ion hóa “mềm” kỉ thuật va chạm electron Ở người ta dùng khí metan (CH4), amoniac (NH3), va cham với chùm tia electron lượng cao để tạo ion gốc tự Ví dụ với khí metan: Đầu tiên va chạm electron ion hóa thuốc thử: II.3.2.1 Tiếp theo tạo ion thứ cấp: Cation CH5+ tiểu phân cho proton mạnh phản ứng với chất phân tích M mẫu: Ưu điểm:  Ít phân mảnh chất phân tích M Nhược điểm:  Tạo ion MH+ có khối lượng lớn đơn vị so với khối lượng phân tử tương đối chất phân tích II.3.2.3 Nguồn ion phun sương khử solvat Kỷ thuật tạo ion từ phân tử dung dịch, dung dịch mao quản kim loại (tốc dộ dao động từ 1- 10 ml/ phút) Người ta đặt điện trường đầu mao quản điện cực ( +4000 V) tạo giọt mịn hạt sương mang điện tích gia tốc đến điện cực ( ion hóa tia điện- ESI) Ưu điểm:  Ion hóa chất phân cực chất có khối lượng phân tử lớn (M 100000) Page | 13 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ Nhược điểm:  Chỉ thực với mẫu lỏng Hình 2.2 : Giao diện ESI máy khối phổ sơ đồ tạo ion dương nguồn ESI Ngoài dùng tia ESI ta dùng số tia sau:  Ion hóa nhiệt (TSI): Tương tự kỉ thuật ESI nhiên mẫu phải qua mạo quản nhiệt độ kiểm soát để tạo thành giọt mịn  Ion hóa học áp suất khí (APCI): Pha động chuyển thành cát giọt sương nhờ dòng Nito nhiệt (khoảng 500 oC), thường kết nối với HPLC/MS Hình 2.3 minh họa giao diện APCI cột HPLC vả máy khối phổ Hình 2.3: Giao diện APCI cột HPLC vả máy khối phổ II.3.2.4 Nguồn ion hóa giải hấp Page | 14 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ Nguyên tắc kỷ thuật dựa trình phát thứ cấp: bắn phá mẫu dạng lỏng hay rắn chùm tia sơ cấp: electron, photon ion Gồm ba kỉ thuật thường gặp:  Bắn phá nhanh nguyên tử (FAB): Dùng agon hay xenon để bắn phá  Bắng phá nhanh ion (FIB): Dùng ion Cs+ để bắn phá  Ion dãy hấp laser (MALDI): Mẫu hòa tan dung môi thích hợp ion hóa xung laser có bước sóng vùng UV-IR, thường dùng cho mẫu phân tử có khối lượng lớn (M > 100000) Hình 2.4: Sơ đồ mô tả hoạt động hệ thống MALDI Hình cung cấp cho ta thông tin lựa chọn kiểu nguồn ion hóa thích hợp với mẫu phân tích: Hình 2.5: Biểu đồ lựa chọn kiểu tạo ion II.3.3 Bộ phân tích khối Được coi tim máy khối phổ có nhiệm vụ tách ion có trị số m/z khác thành phần riêng biệt II.3.3.1 Bộ phận tích từ  Bộ hội tụ đơn: Mô tả hình 2.6 Page | 15 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ Hình 2.6: Bộ phân tích từ hội tụ đơn Tỉ số khối lượng điện tích ion (m/z) xác định theo công thức: Trong đó: m: Khối lượng ion z: Điện tích ion B: Cường độ từ trường r: Bán kính chuyển động điện tích V: Gia tốc cường độ điện trường  Bộ hội tụ kép Gồm hai phần để tăng độ phân giải khối: • Bộ tách tĩnh điện • Bộ phân tích từ Nhờ cách quét ta nhận phổ khối có độ phân giải cao dao động khoảng từ 100000- 150000 Nhiều trường hợp cho tỉ số m/z xác đến dùng để xác định thành phần nguyên tố chất phân tích II.3.3.2 Bộ phân tích tứ cực  Bộ tứ cực đơn Bao gồm cực kim loại đặt song song sát nhau, có khoảng không cực ion bay qua (Hình 2.7) Có điện chiều tín hiệu xoay chiều cao tần áp vào cặp đối diện bốn cực Page | 16 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ Hình 2.7: Bộ phân tích tứ cực đơn  Bẫy ion tứ cực Hoạt động theo nguyên lí phân tích khối tứ cực đơn, khác điểm ion lưu giữ đưa dần khỏi bẫy.(Hình 2.8) Hình 2.8: Sơ đồ bẫy ion  Bộ tứ cực chập ba Gồm ba phận tứ cực nối tiếp Bộ Q Q3 làm nhiệm vụ phân tích, Q1 tách ion (một số ion chọn lọc), Q2 (áp suất cao) tạo phân ly va chạm làm ion bị phân mảnh chuyển đến Q để tách riêng sau đến detector.(Hình 2.9) Page | 17 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ Hình 2.9: Bộ phân tích tứ cực chập ba II.3.3.3 Bộ phân tích thời gian bay (TOF) Các ion khỏi buồng ion hóa gia tốc nhờ điện 10- 20 Kv bay qua ống phân tích ( điện từ trường) có chiều dài đến 2m Thời gian bay hết ống tỉ lệ với ion Chủ yếu dùng để phân tích chất có khối lượng phân tử lớn (khoảng vài ngàn đơn vị) Hình 2.10: Sơ độ phân tích thời gian bay TOF II.3.3.4 Bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotron (ICR) Bộ phận dùng cho máy khối phổ kết hợp với chuyển đổi Fourier (FT- ICR) Các ion tạo buồng ion hóa qua hệ thống bơm đảm bảo độ chân không cao ( từ 10-10- 1011 mBar) vào bẫy ion (bẫy Penning) đặt từ trường B Các ion nằm bẫy bị kích thích điện trường xoay chiều tần số radio (RF) chúng chạm vào thành bẫy (cộng hưởng) Một dòng xoay chiều tạo ion chuyển động gần tới detector ghi lại theo thời gian chuyển thành tính hiệu ghi theo vận tốc góc c Sau chuyển phổ tốc độ thành phổ khối Phương trình mô tả quan hệ c m : Hình 2.11: Sơ đồ bẫy Penning trình tạo tín hiệu Page | 18 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ Kỷ thuật ICR- MS có độ nhạy cao độ phân giải đến 107 II.3.4 Detector II.3.4.1 Nhân electron Tác động ion lên bề mặt chất bán dẫn tạo electron, tiếp tục tăng tốc va chạm với bán dẫn khác tạo nhiều electron Các electron thu nhận số lượng chúng tỉ lệ với cường độ tín hiệu detector II.3.4.2 Nhân quang Các electron tạo cách va chạm tương tư phần nhân electron thay va chạm vào bề mặt bán dẫn va cham vào bề mặt phát quang để tạo hat photon Các hạt photon thu nhận số lượng chúng tỉ lệ với cường độ tín hiệu detector III ỨNG DỤNG 3.1 Xác định đồng vị 3.1.1 Cơ sở lí thuyết Các nguyên tử đồng vị nguyên tố có số điện tích hạt nhân khác số notron, nên khối lượng nguyên tử khác Có thể dùng kỉ thuật khối phổ để xác định đồng vị nguyên tố mẫu Bảng 3.1 cho biết khối lượng thành phần đồng vị bền số nguyên tố Bảng 3.1: Đồng vị bền số nguyên tố Khối lượng Thành phần xác thiên nhiên đồng vị (%) H 1,0078 99,985 D 2,0141 0,015 12 12,0000 98,893 C 13 13,0034 1,107 14 14,00031 99,634 N 15 15,0001 0,366 16 15,9949 99,529 O 17 16,9991 0,037 18 17,9992 0,204 35 34,9698 75,529 17 Cl 37 36,9659 24,471 79 78,9183 50,537 35 Br 81 80,9163 49,463 Trong thiên nhiên nguyên tố thường gồm hỗn hợp nhiều đồng vị, nên với ion phân tử tín hiệu ion M + thu nhận tín hiệu ion phân tử khác có khối lượng (M- 1)+, (M +1)+, (M+2)+ tạo thành từ đồng vị Vì khối phổ có nhiều tín hiệu lân cận M +, trường hợp người ta tính toán cường độ pic dựa vào số tổ hợp có đồng vị chất Số hiệu nguyên tử (Z) Kí hiệu nguyên tố Khối lượng đồng vị Page | 19 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ 3.1.2 Ví dụ minh họa Xác định thành phần đồng vị kim loại có sữa bột khào sát lượng đồng vị thêm vào mẫu sữa Để đánh giá ảnh hưởng lượng đồng vị thêm vào, cần biết khoảng nồng độ đồng vị mẫu cần phân tích Trước tiên mẫu sữa bột phân tích ICPMS thông thường Sau có số liệu khoảng nồng độ, nhà khoa học thực nghiệm khảo sát lượng thêm đồng vị Pha mẫu nước có nồng độ nguyên tố có nồng độ tương ứng với nồng độ mẫu sữa bột sau phân hủy (Cd: 0,1 µg/L, Cu: 60 µg/L, Pb: 1,5µg/L, Zn: 400 µg/) Thêm lượng đồng vị nguyên tố vào mẫu tương ứng với giá trị R (R = lượng đồng vị thêm (nồng độ nguyên tố ) từ 0,05 đến 20 lần Kết phân tích thể bảng 3.2 sau: Bảng 3.2: Kết khảo sát lượng đồng vị III.2 Định tính III.2.1 Cơ sở lí thuyết Phân tích khối phổ cho xác khối lượng ion phân tử M +, (M +1)+, (M+2)+ Đây thông số đặc trung quan hợp chất hóa học, xem xét thêm pic đồng vị, tỷ số cường độ chúng với khối lượng vài mảnh ion, từ xác đinh công thức nguyên tử chất phân tích Thường kết hợp với GC/ MS, HPLC/ MS sau so sánh liệu thu thông qua dụng cụ tin sinh học III.2.2 Ví dụ minh họa Định tính thành phần hóa học có tinh dầu Sa mộc dầu (Cunninghamia konishii Hayata) Chưa có nhiều công trình nghiên cứu thành phần hóa học loài Sa mộc dầu (C konishii) Trong nghiên cứu công bố Page | 20 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ gân nhà khoa học Việt Nam phân tích thành công thành phần hóa học tinh dầu từ loài Sa mộc dầu (Cunninghamia konishii Hayata) phân bố Hà Giang Bằng kỉ thuật Sắc ký khí-khối phổ (GC/MS): việc phân tích định tính thực hệ thống thiết bị sắc ký khí phổ ký liên hợp GC/MS Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu từ gỗ loài sa mộc dầu (C konishii) Tây Côn Lĩnh phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS), 40 hợp chất tách từ tinh dầu, 34 hợp chất xác định (chiếm 97,3% tổng lượng tinh dầu).Được trình bày cụ thể bảng 3.3 Bảng 3.3: Thành phần hoá học tinh dầu từ gỗ Sa mộc dầu (Cunninghamia konishii Hayata) phân bố Tây Côn Lĩnh RIa: Retention indices on HP-5MS capillary column.(Chỉ số cột mao quản HP5MS) Page | 21 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ III.3 TỔ Xác định công thức cấu tạo III.3.1 Cơ sở lí thuyết Sau xác định công thức nguyên tử mẫu lúc định tính, ta cần dùng kỉ thuật ion hóa mẫu thích hợp muốn xác định công thức cấu tạo Trong trường hợp khối phổ thường kết hợp với phổ cộng hưởng hạt nhân phổ hồng ngoại (IR) III.3.2 Ví dụ minh họa Xác định cấu trúc protein kỹ thuật khối phổ Các nhà khoa học dùng kỹ thuật khối phổ cải tiến để xác định cấu trúc protein tín hiệu có vai trò quan trọng trình sinh lý số bệnh phổ biến bệnh tiểu đường ung thư Protein Epac2 (exchange protein directly activated by cAMP - protein trao đổi hoạt hóa trực tiếp cAMP 2) yếu tố trao đổi nucleotide guanine, có khả điều hòa nhiều trình nội bào tương tác với hợp chất truyền tín hiệu thứ cấp cAMP (cyclic adenosine monophosphate) Một dự án hợp tác thực nhà nghiên cứu Đại học Y Texas (University of Texas Medical Branch) Đại học California (University of California) sử dụng kỹ thuật khối phổ trao đổi hydrogen/deuterium (DXMS) để xác định cấu trúc ba chiều Epac2 có mặt cAMP Hình 3.1: Sự thay đổi cấu dạng cảm ứng với cAMP Epac2 xác định DXMS Kết nghiên cứu đưa tạp chí Biological Chemistry cho biết cAMP có hai vùng liên kết để tương tác với Epac2 theo kiểu phù hợp trình tự làm thay đổi cấu dạng Epac2 theo cách đặc thù Sự thay đổi cấu dạng chuyển động khớp nối tập trung đầu C vùng gắn thứ hai cAMP Sự thay đổi hình dạng xếp lại thành phần điều hòa Epac2 nằm cách xa trung tâm hoạt động xúc tác, tạo điều kiện cho việc gắn nối yếu tố khác “Nghiên cứu sử dụng phương pháp phân tích cấu trúc protein mạnh mẽ để xác định cách thức tín hiệu hóa học gọi cAMP bật “công tắc” protein Epac2”, Ts.Xiaodong Cheng Đại học Y Texas cho biết “DXMS chứng minh phương pháp hiệu đến kinh ngạc, sử dụng riêng kết hợp với kỹ thuật khác để phát cách thức protein làm việc “chiếc máy” phân tử, thay đổi cấu dạng theo chức cụ thể chúng,” Gs Virgil Page | 22 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ Woods Đại học California nói “Đây công cụ tuyệt vời để xác định phát triển liệu pháp thuốc điều trị hướng vào dịch chuyển protein này.” III.4 Định lượng III.4.1 Cơ sở lí thuyết Phân tích định lượng khối phổ cần thiết lập đưởng chuẩn hay thêm đường chuẩn với đo cường độ vạch phổ để xác định nồng độ chất phân tích Trong phân tích dược thường kết nối với GC/ MS, HPLC/ MS, CE/ MS để tăng tính chọn lọc giới hạn định lượng cho phương pháp phân tích mẫu Phân tích định lượng khối phổ có độ nhạy tính chọn lọc cao, giới hạn phát lên đến 10-14 gram Vì vậy, người ta thường dùng kỉ thuật để phân tích hàm lượng siêu vết mẫu phức tạp III.4.2 Ví dụ minh họa Phân tích đồng thời kháng sinh quinolone thịt, tôm, cá phương pháp sắc kí lỏng ghép khối phổ Trong nghiên cứu, nhà khoa học tìm chương trình gradient pha động tách quinolone cột sắc kí pha đảo C18 khoảng thời gian ngắn 15 phút thông số cho nguồn ion hóa ESI, phân tích khối phân tích đồng thời quinolone Qui trình phân tích áp dụng để khảo sát dư lượng quinolone mẫu thịt gà, thịt heo, tôm, cá mua chợ Phú Thọ, Bình Dương Hình 3.2: Đường hồi qui quinolone Từ nhà khoa học xác định hàm lượng kháng sinh mẫu gà, heo, tôm, cá diêu hồng trình bày cụ thể bảng 3.4 Bảng 3.4: Dư lượng kháng sinh quinolone (ng.g-1) mẫu thịt gà, thịt heo, tôm, cá diêu hồng Hợp Gà Heo Tôm Cá diêu hồng chất Không định Không định Không định Nor 64,8 lượng lượng lượng Không định Không định Không định Không định Cip lượng lượng lượng lượng Page | 23 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ Không định Không định lượng lượng Không định Không định Không định Dano 0,9 lượng lượng lượng Không định Enro 5,3 1,2 4,1 lượng Không định Không định Oxo 0,4 2,4 lượng lượng Nal 1,0 0,8 0,4 2,6 Không định Flu 3,6 0,9 5,0 lượng Nhận thấy mẫu có diện chất khảo sát nồng độ nhỏ nằm giới hạn cho phép (nhỏ 100 ng.g-1)Với mẫu thịt gà mua chợ tìm thấy dư lượng kháng sinh norfloxacin cao (64,8 ng.g-1) hàm lượng cho phép Lome 3,5 Không định lượng Page | 24 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] PGS TS Trần Tử An Hóa phân tích ( Tập II) NXB Y học Hà Nội ( năm 2007) [2] Đỗ Ngọc Đại, Nguyễn Quang Hùng "Chemical composition of the essential oil from woods of Cunningamia konishii Hayata from Ha Giang." TAP CHI SINH HOC 34.4 (2013): 469-472 [3] Vũ Văn Tú, Phạm Hải Long, Nguyễn Thị Huệ "XÁC ĐỊNH Cd, Cu, Pb Zn TRONG SỮA BỘT BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG ĐỒNG VỊ (IDICP-MS)." Tạp chí Phân tích Hóa, Lý Sinh học 20.1 (2015): 100 [4] Trần Thanh Trúc,Trần Thị Như Trang "Phân tích đồng thời kháng sinh quinolone thịt, tôm, cá phương pháp sắc kí lỏng ghép khối phổ."Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ 16.2T (2014): 39-46 [5] http://biology.vn/phuong-phap-khoi-pho-ms/ [6]http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/X%C3%A1c_ %C4%91%E1%BB%8Bnh_c%E1%BA%A5u_tr%C3%BAc_protein_b %E1%BA%B1ng_k%E1%BB%B9_thu%E1%BA%ADt_kh%E1%BB %91i_ph%E1%BB%95 [7] http://case.vn/vi-VN/34/96/119/details.case Page | 25 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường [...]...PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ 4 hoặc âm (-) Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn 1.2 Nguyên lý của khối phổ Khối phổ là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các phân tử tích điện khi chúng di chuyển trong điện trường Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối phổ trước khi... dữ liệu phổ về khối của các ion đã phân tách với sự trợ giúp của các phần mềm tin sinh học cho phép tìm kiếm trên các cơ sở dữ liệu và phân tích kết quả thu được Máy khối phổ không đo khối lượng (m) mà chúng đo giá trị m/z (mass/charge ratio) Tùy thuộc vào các loại nguồn và bộ phân tích khối mà máy khối phổ có cấu hình và nguyên tắc hoạt động khác nhau II.3 Chi tiết các bộ phận của máy khối phổ Bộ nạp... Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ 4 Hình 2.6: Bộ phân tích từ hội tụ đơn Tỉ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được xác định theo công thức: Trong đó: m: Khối lượng ion z: Điện tích của ion B: Cường độ từ trường r: Bán kính chuyển động của điện tích V: Gia tốc cường độ điện trường  Bộ hội tụ kép Gồm hai phần để tăng độ phân giải khối: • Bộ tách tĩnh điện • Bộ phân tích từ Nhờ cách quét... một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối Dữ liệu phổ khối được tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng mẫu bằng các công cụ tin sinh học Đồng thời, có thể xác định cấu trúc cũng như là định lượng các chất trong mẫu mà ta phân tích II MÁY KHỐI PHỔ 2.1 Tổng quan về máy khối phổ Hệ thống khối phổ có nhiều loại và được ứng dụng rất đa dạng trong các lĩnh vực... II.3.2.1 Tiếp theo là tạo ra ion thứ cấp: Cation CH5+ là tiểu phân cho proton mạnh sẽ phản ứng với chất phân tích M của mẫu: Ưu điểm:  Ít phân mảnh chất phân tích M Nhược điểm:  Tạo ra ion MH+ có khối lượng lớn hơn một đơn vị so với khối lượng phân tử tương đối của chất phân tích II.3.2.3 Nguồn ion bằng phun sương khử solvat Kỷ thuật này tạo ra ion từ phân tử trong dung dịch, dung dịch ở trong một mao... Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ 4 Woods của Đại học California nói “Đây là công cụ tuyệt vời để xác định và phát triển các liệu pháp thuốc điều trị hướng vào sự dịch chuyển của các protein này.” III.4 Định lượng III.4.1 Cơ sở lí thuyết Phân tích định lượng khối phổ cần thiết lập đưởng chuẩn hay thêm đường chuẩn cùng với đo cường độ vạch phổ để xác định nồng độ chất phân tích Trong phân tích dược thường... 20 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ 4 gân đây các nhà khoa học Việt Nam đã phân tích thành công thành phần hóa học trong tinh dầu từ loài Sa mộc dầu (Cunninghamia konishii Hayata) phân bố ở Hà Giang Bằng kỉ thuật Sắc ký khí -khối phổ (GC/MS): việc phân tích định tính được thực hiện trên hệ thống thiết bị sắc ký khí và phổ ký liên hợp GC/MS Nghiên cứu thành phần hóa... suất cao) tạo ra phân ly do va chạm làm các ion bị phân mảnh và được chuyển đến Q 3 để tách riêng ra sau đó mới đến detector.(Hình 2.9) Page | 17 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ 4 Hình 2.9: Bộ phân tích tứ cực chập ba II.3.3.3 Bộ phân tích thời gian bay (TOF) Các ion ra khỏi buồng ion hóa được gia tốc nhờ điện thế 10- 20 Kv bay qua một ống phân tích ( không có điện... định lượng cho phương pháp phân tích mẫu Phân tích định lượng khối phổ có độ nhạy và tính chọn lọc cao, giới hạn phát hiện có thể lên đến 10-14 gram Vì vậy, người ta thường dùng kỉ thuật này để phân tích hàm lượng siêu vết trong những mẫu phức tạp III.4.2 Ví dụ minh họa Phân tích đồng thời các kháng sinh quinolone trong thịt, tôm, cá bằng phương pháp sắc kí lỏng ghép khối phổ Trong một nghiên cứu, các... Học Và Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ 4 Hình 2.1: Sơ đồ khối của máy khối phổ Các bộ phận này sẽ được trình bày chi tiết ở phần sau II.2 Nguyên lí làm việc của máy khối phổ Ban đầu, mẫu được nạp vào máy ở dưới dạng khí hoặc hơi Sau đó mẫu được chuyển đến bộ nguồn ion để được ion hóa thành các ion ở các trạng thái tích điện khác nhau, tiếp theo các ion mẫu sẽ được phân tách dựa trên sự khác ... năm 1940 phân tích khối phổ hữu đời để ứng dụng vào phân tích sản phẩm ngành cộng nghiệp dầu hỏa Đến năm 70, khối phổ ứng dụng rộng rãi nghiên cứu y sinh Hiện phân tích khối phổ kỉ thuật phổ biến... phổ biến 1.2 Nguyên lý khối phổ Khối phổ kỹ thuật phân tích đo phổ khối lượng phân tử tích điện chúng di chuyển điện trường Các ion tạo thành buồng ion hóa, gia tốc tách riêng nhờ phận phân tích. .. nhau: ghi phổ khối, so sánh với liệu phổ thư viện phổ hay định lượng mẫu,…: Page | 11 Khoa Công Nghệ Sinh Học Và Kỉ Thuật Môi Trường PHÂN TÍCH KHỐI PHỔ TỔ Hình 2.1: Sơ đồ khối máy khối phổ Các