Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC K29 SERMINA BỆNH GUMBORO VÀ CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Sinh viên thực hiện: Giáo viên hướng dẩn Trương Minh Dũng TS Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Hồng Phong Nguyễn Thị Minh Thư Ngô Thị Thu Ngân 11/2006 -1- Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử I LỜI MỞ ĐẦU Sinh học phân tử môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật mức độ phân tử Phạm vi nghiên cứu môn có phần trùng lặp với ngành khác sinh học đặc biệt di truyền học hóa sinh Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác hệ thống cấu trúc khác tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại trình tổng hợp DNA, RNA protein tìm hiểu cách thức điều hòa mối tương tác Sinh học phân tử môn khoa học non trẻ có nhiều bước tiến vượt bậc tác động toàn diện đến nhiều ngành khoa học, tới sản xuất đời sống Ngành kinh tế nông nghiệp gia cầm gặp nhiều nguy đe dọa trình phát triển Trong đó, dịch bệnh ảnh hưởng lớn lợi nhuận, trình sản xuất, tình hình chăn nuôi gia cầm giới Vì vậy, việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào việc chẩn đoán, điều trị bệnh gia cầm tất yếu Ngày 30 tháng 11 năm 2006 Nhóm báo cáo -2- Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử II MỤC LỤC I LỜI MỞ ĐẦU .1 III TỔNG QUAN U III.1 IV Bệnh Gumboro .4 III.1.1 Khái niệm III.1.2 Sơ lược túi Fabricius III.1.3 IBDV .4 III.1.4 Lịch sử phát .6 III.1.5 Cơ chế .7 III.1.6 Triệu chứng .8 III.1.7 Bệnh tích PHƯƠNG PHÁP-VẬT LIỆU 12 U IV.1 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang 12 IV.1.1 Nguyên lý sở phát huỳnh quang 12 IV.1.2 Các phương pháp kháng thể huỳnh quang 12 IV.2 Phản ứng kết tủa khuếch tán thạch (Agar gel precipitation test, AGP) 17 IV.3 RT-PCR 19 IV.3.1 Nguyên tắc 19 IV.4 RFLP 23 IV.5 Phản ứng trung hòa virus(Virus neutralization=VN) 26 IV.6 ELISA 26 IV.6.1 Enzyme linked immuno Sorbent assay (Elisa) phát kháng thể: 26 IV.6.2 Elisa phát kháng nguyên: antigen capture (AC)-elisa 29 IV.7 Vaccine .30 V KẾT LUẬN 32 VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 -3- Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử III TỔNG QUAN III.1 Bệnh Gumboro III.1.1 Khái niệm Infectious bursal disease (IBD) bệnh có khả lây lan cao đàn gà Bệnh gây Infectious bursal disease virus (IBDV) Bệnh làm suy giảm hệ thống miễn dịch gây tử vong gà từ 3-6 tuần tuổi Một mặt, làm gia tăng tính nhạy cảm bệnh khác; mặt khác, trơ với việc chủng ngừa có hiệu Trong năm gần đây, nhiều dòng chủng IBDV (vvIBDV), nguyên nhân gây tử vong đồng loạt gà, xuất châu Âu, Mỹ Latin, Đông Nam Á, châu Phi Trung Đông III.1.2 Sơ lược túi Fabricius Túi Fabricius quan dạng lympho, nằm gần hậu môn Trong trình phát triển bào thai, xuất sau tuyến ức giống tuyến ức, túi Fabricius có cấu trúc lympho biểu mô Túi Fabricius quan dạng lympho trung ương, trình biệt hóa túi diễn không bị ảnh hưởng kích thích kháng nguyên từ bên Túi Fabricius nhỏ sớm: gà khoảng tháng thứ (tuổi dậy thì), bắt đầu teo tới tháng 11-12 hẳn Chia túi thành đơn vị cấu trúc gọi nang (Foliculum) Mỗi nang gồm có vùng vỏ giàu lympho bào vùng tủy tế bào có chứa tương bào Đây nơi biệt hóa dòng lympho B III.1.3 IBDV IBDV có dạng hình khối, nhiều gốc cạnh, khích thước: 55-65 nm, phân tử khối: 2.106 Dalton (Nick, 1976) IBDV virus dạng trần, vỏ bọc IBDV có cấu trúc mạch đôi RNA cuộn tròn phân thành đoạn riêng biệt, thuộc loài Avibirnavirus họ Birnaviridae (Leong et al., -4- Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử 2000) Quanh nhân vỏ protein (vỏ capsid) Lớp capsid hợp thành 32 capsomer (đơn vị hình thái) Mỗi capsomer tạo loại protein cấu trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 VP5 (Viral Protein-VP) IBDV genome chứa hai mạch, A B Mạch B (2.9kb) mã hóa cho VP1 (VP1: 95kDa), người ta cho enzyme RNA polimerase phụ thuộc RNA (RNA dependent RNA polimerase-RdRp) (Bruenn, 1991; Macreadie & Azad, 1993; Spies et al., 1987) Polipeptide diện dạng virus nghỉ tế bào chủ (virion), mang chất protein tự protein liên kết genome (còn gọi VPg) VPg cố định vào đuôi 5’ sợi dương mạch genome (Dobos, 1993; Spies & Muller, 1990) Mạch A lớn (3.2kb) chứa hai khung đọc mở thành phần (overlapping open reading frame-ORF) ORF nhỏ mã hóa cho protein không cấu trúc VP5, không cần thiết cho trình chép virus in vitro lại quan trọng khả gây bệnh virus (Mundt et al., 1997; Yao et al., 1998) ORF lớn mã hóa cho polyprotein 110 kDa, tự xác tác phân cắt hình thành loại polipeptide: pVP2 (48 kDa), VP3 (32 kDa) VP4 (28 kDa) VP4, loại enzyme protease phân cắt serine-lysine (Birghan et al., 2000), tham gia trình tự tách RNA dư thừa (Lejal et al., 2000; Sanchez & Rodriguez, 1999) pVP2 tách thêm RNA dư thừa Carbon cuối để trở thành VP2 (40 kDa) (Da Costa et al., 2002; Lejal et al., 2000) VP2 VP3 protein cấu trúc Trong đó, VP2 chứa vị trí kháng nguyên quan trọng hệ thống đáp ứng miễn dịch (Heine and Boyle, 1993) Về miễn dịch: IBDV có hai serotype khác biệt rõ ràng, có loại serotype có khả gây bệnh gia cầm Serotype 1: gồm nhiều chủng gây bệnh cho gà Có khoảng loại kháng nguyên phụ serotype xác định thử nghiệm trung hòa ống nghiệm Những virus thuộc loại kháng nguyên phụ thường biết dạng biến thể, nguyên nhân gây tỉ lệ tử vong gà từ 60-100% Có khác kháng nguyên chủng cổ điển biến thể Miễn dịch chéo biến chủng nhỏ (Mc Ferran Cs 1980) -5- Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử Serotype 2: gồm có chủng virus gây bệnh cho gà tây Về phương diện miễn dịch, hai serotype khả miễn dịch chéo với Tuy nhiên gà gà tây bị nhiễm chủng virus mà không phát bệnh Sức đề kháng: IBDV có sức đề kháng cao với tác nhân lý hóa môi trường Chịu đựng pH từ 2-12 (Benton cs, 1967) Ở 56oC, IBDV tồn 5h, 70oC bị tiêu diệt sau 30 phút, -50oC 18 tháng độc lực không suy giảm (Landgraf cs, 1967) Trong chất thải, phân, nước tiểu, IBDV giữ nguyên tính gây nhiễm gây bệnh vòng 52 ngày IBDV đề kháng hoàn toàn với ether, chloroform Trong phenol 0.5% timerosal 1.125% 50oC 1h, formalin 0.5% 6h, chloramin 0.5% 10 phút Các hợp chất như: dẫn suất phenol, phức hợp iode, formol nồng độ cao, diệt IBDV Chất chứa mầm bệnh: thận túi Fabricius, nơi chứa nhiều virus Ngoài ra, chất tiết, thức ăn, nước uống, chất độn chuồng chứa virus Đường xâm nhiễm: tự nhiên, lay truyền qua đường tiêu hóa phổ biến nhất, việc lây nhiễm qua không khí quan trọng Trong phòng thí nghiệm, dùng đường mũi mắt Sự lan truyền: Bệnh truyền ngang từ gà ốm sang gà khỏe qua thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi, Bệnh mang tính phức tạp đường lây lan sức chịu đựng virus môi trường nhiệt độ cao, với số hóa chất sát trùng III.1.4 Lịch sử phát Năm 1962, Cosgrove phát mô tả bệnh mới, xuất thành phố Gumboro, vùng Dalaware Hoa Kỳ Bệnh thường thấy gà với bệnh tích thường gặp chủ yếu thận túi Fabricius -6- Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử Lúc đầu, người ta cho rằng, bệnh biến thể bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis, IB) bệnh tích thận tương đối giống Sau này, Winterfield Hitchner chứng minh gà miễn dịch với IB nhiễm bệnh viêm túi Fabricius Cuối năm 1962, Winterfield phân lập từ phôi trứng tác nhân gây bệnh truyền nhiễm gà (bệnh tích túi Fabricius thận) Năm 1986-1987, lần dòng biến thể IBDV công bố Năm 1987, nguy hiểm IBDV lần công bố Belgium The Netherlands Năm 1970, Hitchner đề nghị tên thức cho bệnh Infectious Bursal Disease (IBD) hay gọi Gumboro Virus gây bệnh Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) III.1.5 Cơ chế IBDV công chủ yếu vào mô lympho Tế bào lympho B túi Fabricius bị phá hủy Tế bào lympho T tuyến Thymus bị tổn thương Sau ngày xâm nhập vào thể, thấy xuất biến đổi viêm túi Fabricius Đặc biệt đến ngày 3-4 túi Fabricius, thấy xung huyết, xuất huyết, phù thủng thâm nhiễm tế bào viêm đạt độ cực đại Cùng với phóng virus, thân nhiệt tăng đột ngột; sau đó, gây hoại tử tiến triển nang (Foliculu) túi, phá hủy tất mô lympho cuối sau 5-7 ngày túi teo nhanh Những thay đổi suy thoái phát triển nơi tế bào lympho B hay tụ tập -7- Seminar III.1.6 Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử Triệu chứng Thể lâm sàng: gà từ 3-6 tuần tuổi 10 tuần tuổi Biểu vòng hậu môn co bóp, sốt cao, bỏ ăn khát nước, sau ỉa chảy Phân loãng có màu trắng, lẫn máu; gà ủ rũ, lông xù, xã cánh, nằm quẹo chết Thể ẩn: thường xảy tuần tuổi gây suy giảm miễn dịch Vì thể lâm sàng không rõ nên dễ nhầm với bệnh khác, bệnh Newcatle -8- Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử III.1.7 Bệnh tích Bệnh tích đại thể: -Lách sưng -Thận sưng, biến đổi màu, ống niệu quản đầy muối urat -Xuất huyết đám ngực, đùi -Da chân khô tóp lại (cơ thể bị nước tiêu chảy) -Dịch niêm mạc tăng -Túi Fabricius không ngừng bị biến đổi: Sau ngày nhiễm túi Fabricius tăng kích thước trọng lượng thủy thủng nang túi Đến ngày thứ trọng lượng tăng gấp 2-3 lần bình thường, nang viêm không Dịch nhày vàng lẫn hồng nang, có đám xuất huyết nang dẫn đến dịch chuyển màu vàng đục sánh, có kèm bã đậu (fibrin) Có trường hớp dịch nhày bao quanh bên túi Đến ngày thứ trọng lượng túi Fabricius bắt đầu giảm teo dần, nang túi không đồng Ngày nhiễm 2-3 Hình thái Kích thước Bursa gia tăng nhanh Bị phù, chất tiết sền sệt màu kích thước trọng lượng Bursa tăng gấp đôi kích trắng sang màu kem Những đốm xuất huyết xuất thước trọng lượng Bursa trở trọng lượng Chất tiết, tình trạng phù biến Bursa có xu hướng hóa ban đầu vàng Màu sắc biến đổi từ màu Bursa teo nhỏ (=!/3 kích nâu trọng lượng nguyên thủy) -9- Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử Bệnh tích vi thể: Có hoại tử thành phần tế bào lympho như: túi Fabricius, van hồi manh tràng, lách Các thành phần tế bào lympho bị phá hủy, nhân tế bào bị teo rỗng - 10 - Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử Huyết thanh: Sử dụng huyết dương tính tự chế IV.3 RT-PCR IV.3.1 Nguyên tắc Kỹ thuật sinh học phân tử phát triển cho phép ta xác định IBDV cách nhanh cách phân lập virus Trong số phương pháp sinh học phân tử thường sử dụng để phát gene, phương pháp RT-PCR sử dụng phổ biến Phương pháp phát gene IBDV mà không cần phải tăng sinh môi trường nuôi cấy trước khuyếch đại RT-PCR tiến hành bước: B1: Ly trích acid nucleic từ mẫu nghiên cứu B2: thực phiên mã ngược RNA IBDV thành cDNA B3: khuyếch đại cDNA thu PCR.Chọn mồi oligonucleotide trình tự ngắn bổ sung với trình tự nucleotide đặc hiệu virus Những vùng khác gen khuyếch đại phụ thuộc vào định vị từ primer chọn Sự khuyếch đại gen mã hoá protein vỏ bên (protein capsid outer) - 19 - Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử Ly trích acid nucleic: Trong RNA chuỗi đơn dễ bị phân huỷ enzyme Rnase, gene RNA IBDV chuỗi đôi (dsRNA) kháng phân huỷ enzyme RNase - 20 - Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử Trong thực tế, tế bào nhiễm (dương tính với IBDV) chứa chủng RNA chuỗi đơn sử dụng mẫu bước RT Sự ly trích RNA tiến hành cách cẩn thận: sử dụng găng tay, tác nhân RNase phòng thí nghiệm nhân tạo RNA IBDV ly trích từ mô nhiễm cách sử dụng vài kit có sẵn Bằng cách khác RNA IBDV ly trích cách bổ sung 1% SDS (sodium dodecyl sulphate) 1mg/ml protein K 700 µl dịch huyền phù virus (như dịch đồng bìu) Ủ ấm khoảng 60 phút 370C Acid nucleic thu cách sử dụng protocol chuẩn cho việc ly trích phenol/chloroform ( ý: phenol chất độc nên xử lý loại bỏ sau đó) Acid nucleic thu hoạch từ giai đoạn dịch cuối việc kết tủa ethanol giữ nước cất RNase dung dịch đệm bền RNA pha loãng nước nên giữ lạnh nhiệt độ -200C sử dụng Sự phiên mã ngược ( Reverse transscription) Sử dụng mồi PCR “lower” ( bổ sung với mạch dương gen IBDV) tổng hợp cDNA từ dsRNA IBDV từ RNA chuỗi đơn lấy từ IBDV lấy từ tế bào nhiễm Hỗn hợp RNA IBDV phải biến tính trước chuyển vào hỗn hợp phản ứng RT Thêm 20% (bằng thể tích) dimethylsulphoxide vào dung dịch RNA IBDV giải lạnh Đun nóng khoảng phút 920C làm lạnh đá; phương pháp khác đun nóng khoảng phút ủ ấm hỗn hợp tức nitơ lỏng Chuyển thể tích hỗn hợp biến tính vào hỗn hợp phản ứng Ủ ấm theo dẫn nhà cung cấp enzyme Dung dịch cDNA thu sau bước RT nên giữ lạnh < -20oC Việc trì hoãn bước PCR vài tuần sau tổng hợp cDNA nguyên nhân gây kết PCR âm tính giả PCR Enzyme DNA polymerase dùng cho phản ứng PCR thương mại hóa Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR theo hướng dẫn nhà sản xuất - 21 - Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử Cặp mồi U3/L3 dùng để khuyếch đại gen VP2 thuộc dòng IBDV serotype thiết kế: Upper U3: 5'-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-GCA-TGCGGT-ATG-TGA-GGC-TTG-GTG-AC-3' Lower L3: 5'-CAG-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-GAA-TTCGAT-CCT-GTT-GCC-ACT-CTT-TC-3' Những mồi U3 L3 mồi lai dài 44 nucleotide Chúng bao gồm đầu tận 3’ đặc hiệu IBDV (ở chỗ nghiêng trình tự trên) bắt cặp vị trí nucleotide 657 đến 676 1193 đến 1212 đoạn IBDV Đầu tận đặc hiệu IBDV ghép với đầu tận 5’ không đặc hiệu (loại bôi đen trình tự trên), sản phẩm PCR tinh từ trình khuếch đại với cặp mồi U3/L3 thuận lợi cho giải trình tự Trong mồi U3 L3 có vị trí cắt giới hạn enzyme endonuclease restriction (gạch trình tự trên), kết sản phẩm PCR ứng dụng việc tạo dòng Cặp mồi U3/L3 tạo sản phẩm 743 bp chúng đặc hiệu cho trình tự IBDV khuyếch đại Sau đó, ta tiến hành bước biến tính lần cuối với 35 chu kỳ (mỗi chu kỳ gồm bước biến tính, bước bắt cặp bước kéo dài) Đối với cặp mồi U3/L3, chu kỳ, biến tính 950C/30 giây bắt cặp 640C/ 45 giây (nhiệt độ biến tính điều chỉnh thích ứng mồi khác sử dụng) Những thông số bước kéo dài nên thiết lập theo lời dẫn nhà cung cấp Sự phát tiến hành điện di với sản phẩm PCR marker trọng lượng phân tử DNA gel agarose 1% nhuộm với ethidium bromide ( ý: EB độc chất tác nhân gây ung thư Nên xử lý loại bỏ sau đó) Ưu điểm: Phát nhanh, sớm, lượng mẫu dùng để phát đòi hỏi không nhiều Nhược điểm: - 22 - Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử Ba bước phản ứng PCR phải tiến hành mẫu cDNA (tinh sạch, cDNA pha loãng 10-100 fold) để tránh kết âm tính Mỗi phản ứng PCR phải có phản ứng đối chứng âm dương Việc trì hoãn PCR khoảng vài tuần sau bước RT gây kết PCR âm tính giả IV.4 RFLP Những năm gần đây, kĩ thuật phân tử sử dụng để kiểm tra thay đổi di truyền IBDV tăng nhanh ( Wu cộng sự,1992; Stram cộng sự, 1994; Jackwood Jackwood, 1997; Akin cộng sự, 1998) Kĩ thuật thông dụng cho định dạng IBDV bao gồm phương pháp phân tử để khuếch đại đoạn đặc trưng gen IBDV RT/PCR tiếp sau RFLP (Dybing Jackwood, 1996; Jackwood Niselsen, 1997; Jackwood Sommer, 1997; Ture cộng sự, 1998) Những nghiên cứu phân tích chuỗi nucleotide VP2 giúp ta phân tích gen mã hoá cho nhóm kháng nguyên xác định virus (Schnitzler, 1993) Phân tích RT/PCR-RFLP cho thấy nhạy phương pháp khác bao gồm ACELISA Sử dụng RT/PCR RFLP cho phép ta xác định đặc trưng kháng nguyên phụ cho phép phân lập mầm bệnh khác từ virus vaccine (Lin cộng sự, 1993; Liu cộng sự, 1994; Jackwood Jackwood, 1994, 1997; Jackwood Nielsen, 1997) Những enzyme cắt giới hạn khác sử dụng cho RFLP IBDV BstNI EcoRII, Sty1, DraI, SspI, SacI, SauAI NboI, StuI HaeIII, TaqI BspMI, tất sử dụng kết hợp sử dụng riêng rẽ ( Jackwood Jackwood, 1997; Jackwood Neilsen, 1997; Dormitorio cộng sự, 1997; Jackwood Sommer, 1998, 1999; Banda cộng sự, 2001) RFLP thành công việc tìm vùng biến đổi gen VP2 IBDV RNA IBDV sau chiết tách thực phản ứng RT-PCR thu sản phẩm 743bp Sản phẩm 743bp gọi 700+RTPCR Phân tích RT/PCR-RFLP sản phẩm 743 bp diện vùng đa - 23 - Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử dạng vị trí cắt giới hạn BstNI MboI cách so sánh với kích thước đoạn giới hạn kết (jackwood Sommer, 1997) Những enzyme cắt giới hạn khác sử dụng RFLP cho IBDV enzyme BstNI EcoRII, Sty1, DraI, SspI, SacI, SauAI NboI, StuI HaeIII, TaqI BspMI sử dụng kết hợp riêng rẽ ( Jackwood Jackwood, 1997; Jackwood Neilsen, 1997; Dormitorio cộng sự, 1997; Jackwood Sommer, 1998, 1999; Banda cộng sự, 2001) Giữa chúng, BstNI MboI xuất để cung cấp nhận biết đắn cho phân lập IBDV ( Jackwood Sommer, 1998) Jackwood Sommer (1998) báo cáo vài đáp ứng RFLP đạt sử dụng enzyme BstNI so với enzyme MboI Enzyme BstNI ghi nhận trình tự base sản phẩm RT/PCR Như vậy, khả đạt RFLP BstNI thấp so với MboI đạt BstNI chứa trình tự nhận biết base đoạn sản phẩm RT/PCR 743 bp so với trình tự nhận bíêt base MboI (Jackwood Sommer, 1998) Do lí này, sử dụng MboI phân tích giới hạn để phân tích đa dạng di truyền dòng IBDV phân lập Một lượng sản phẩm 700+RT-PCR phân cắt BstNI lượng khác phân cắt MboI Sau profile RFLP đoạn giới hạn BstNI MboI đuợc xác định khác gel agarose, tốt gel 2.5% agarose Proflie tốt nên xác định cách nhuộm màu gel với thuốc nhuộm SYBR.TM green I Những liệu RFLP đạt phân cắt sản phẩm RT/PCR dòng vaccine dòng phòng thí nghiệm cho biết dòng đặt vào bên nhóm phân tử có liên quan với tính trạng phụ kháng thể nhận biết trước Nhóm chứa đựng dòng biến đổi, nhóm chứa đựng dòng truyền thống, nhóm bao gồm giống Lukert/Edgar Nhóm phân tử chứa đựng giống truyền thống đặc trưng tìm thấy bên nước Mỹ Kết cắt ezyme cắt giới hạn MboI BstNI - 24 - Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử Enzyme Đọan cDNA cắt giới hạn Nhóm virus MboI BstNI 229 &b 234 119, 424, 172 229 & 403 119, 424, 172 229 & 362 119, 172, 154, 139 229 & 362 119, 209, 172, 154 229 & 480 119, 424, 172 229 & 362 119, 424, 172 Sau đó, liệu RFLP từ gà nhiễm bệnh đem so sánh với liệu RFLP từ phân loại virus thu thập trước trên1 nhóm gà nhiễm bệnh khác phương pháp cho phép không xác chuẩn đóan diện IBDV gà , mà xác định đặc trưng kiểu kháng nguyên phụ IBVD Có thể xác định virus từ nhóm kháng nguyên phụ 1,2,3,4,5,6 hay nhóm khác Khi sử dụng RT- PCR Elazig, phía đông Thỗ Nhĩ Kỳ, người ta kiểm tra 40 mẫu dương tính với IBVD tổng số 56 mẫu bursa gà thu Sử dụng RFLP với enzyme cắt giới hạn MboI cho 40 mẫu người ta thu kết sau: đọan dài 349 236 tìm thấy 40 mẫu IBDV dương tính đọan 142 tìm thấy 10 mẫu Điều cho thấy độ đồng di truyền tồn chủng virus thấp - 25 - Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử IV.5 Phản ứng trung hòa virus(Virus neutralization=VN) Bình thường virus gây độc cho tế bào môi trường nuôi cấy Nếu trộn virus với huyết miễn dịch tương ứng bị ức chế không gây độc cho tế bào Đó chế kiểm tra trung hòa virus Sử dụng môi trường tế bào xơ phôi gà lớp BIDV chuẩn thích ứng tốt môi trường tế bào cho bệnh tích tế bào (Cytopathic Effect=CPE) rõ nhằm phát kháng thể chống IBDV huyết cần chẩn đoán IBDV sử dụng nộng độ 100 liều TCID50 (Tissue Cultrure Infective Dose 50%)(liều hủy hoại 50% tế bào), huyết pha loãng theo số Hỗn hợp huyết IBDV cho vào môi trường tế bào Nếu có bệnh tích tế bào huyết kháng thể chông BIDV Nếu có bệnh tích tế bào huyết có kháng thể chống BIDV IV.6 ELISA IV.6.1 Enzyme linked immuno Sorbent assay (Elisa) phát kháng thể: Elisa phương pháp tiên tiến để phát mầm bẹnh hay kháng thể dựa phản ứng đặc hiệu kháng nguyên kháng thể Phương pháp nhanh, nhạy dể thực Hiện thị trường có nhiều kít phát kháng thể kháng BIDV, trình bày kít công ty FLOCKSCREENTM Mục đích kit: phát kháng thể để kiểm tra đáp ứng miển dịch tiêm vaccin Về phản ứng thực sau: giếng phủ kháng nguyên virus Mẩu huyết loãng ủ giếng để kháng thể kết hợp đặc hiêu với kháng nguyên Một kháng thể thứ cấp kháng kháng thể gà thu từ lừa có gắn với enzyme alkaline phosphastase thêm vào để gắng với kháng thể gà Những phần không liên kết rửa bỏ Chất PMP thêm vào Mức độ màu (optical density) liên quan trực tiếp đến lượng kháng thể huyết Thành phần kit: - 26 - Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử dĩa 96 giếngcó phủ sẵng kháng nguyên IBD Mẩu đối chứng dương có sẵng kháng thể kháng IBDV đệm phosphate có protein ổn định ProClin 0.063% (500µl).(ProClin chất kháng vsv không ngăn cản việc gắn kết kháng thể) Đối chứng âm mẩu huyết gà bệnh đệm phosphate có protein ổn định ProClin 0.063% (500µl) Kháng thể IgG thứ cấp kháng kháng thể chống IBDV gà thu nhận từ lừa có gắn với enzyme alkaline phosphastase đệm tris với thuốc nhuộn trơ màu xanh sodium azide (NaN3) 0.1% (11ml) Chất phản ứng bao gồm phenolphthalein monophosphate coenzyme đệm diethanolamine (11ml) Dung dịch dừng phản ứng NaOH đệm diethanolamine (11ml) Dung dịch rửa:đệm phosphate với ProClin 0.63% (50ml) đủ để pha 1000ml dung dịch rửa Dung dịch pha loãng mẩu:đệm phosphate, protein ổn định Proclin 0.63% (50ml) đủ pha 500 ml dung dịch pha loãng Không pha loãng đối chứng Nếu giữ mẩu 4oC phải kiểm tra vòng ngày sau thu mẩu muốn giữ lâu phải bảo quản 20oC Pha loãng huyết với tỉ lệ 1:500 (5µl huyết 2.5 ml dung dịch pha loãng mẩu) Dưới sơ đồ quy trình: - 27 - Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử Quy trình cụ thể: Đánh đấu vị trí mẩu đối chứng (nên có lặp lại) Thêm 50 µl huyết vào giếng đậy lại ủ 37oC 30’ Đổ rửa lại lần với dung dịch rửa (300µl/giếng), úp ngược vào giấy thấm Thêm 50 µl Thêm dung dịch enzyme liên kết kháng thể thứ cấp, lắc Che ủ 37oC 30’ Tương tự Thêm 50 µl chất phản ứng, lắc Che ủ 37oC 15’ Dung dịch chuyển thành màu hồng nhạt Thêm 50 µl dung dịch kết thúc phản ứng, lắc 10 Đọc kết Microtitre Plate Reader buớc sóng 550nm vòng 15’ sau thêm dung dịch kết thúc - 28 - Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử Theo khuyến cáo kit tốt khi: độ hấp thu đối chứng âm phải 0.6 Để tính kết ta dùng tỉ số S/P (thể quan hệ mẩu đối chứng dương): Nếu S/P >0 ta kết luận có kháng thể kháng BIDV Ngoài nhà sản xuất cho ta công thức xác định mồng độ kháng thể (X) dựa vào S/P: Log10X=0.557*(log10S/P)+3.6845 Ö X=10^[0.557*(log10S/P)+3.6845] IV.6.2 Elisa phát kháng nguyên: antigen capture (AC)- elisa Đĩa elisa phủ với kháng thể đặc biệt có nguồn gốc từ gà đệm PBS, kháng thể loại kháng thể đơn dòng, hổn hợp nhiều kháng thể đơn dòng hay huyết đa dòng Ủ đĩa có kháng thể 37oC khoảng 12 Mẫu pha loãng đệm thích hợp ủ với giếng (37oC/1h) phủ kháng thể kháng nguyên IBDV kết hợp với kháng thể đặc biệt Sau đó, kháng nguyên không liên kết loại bỏ rửa dung dịch rửa (PBS, pH=7.2 với Tween20 0.2%) Phức hợp enzyme alkaline phosphastase liên kết với kháng thể kháng IBDV thu nhận từ loài thú khác thêm vào Phức hợp liên kết với kháng nguyên bị bắt giữ Cuối cùng, enzyme thêm vào Kết phát cách đo mật độ quang tương tự phát kháng thể - 29 - Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử IV.7 Vaccine Hiện nay, giới để phòng bệnh Gumboro người ta hay dùng vaccine nhược độc vaccin vô hoạt dầu Tuy nhiên, phân phối vaccine bất hoạt gà tốn nhiều thời gian khó khăn tiêm da hay Bên cạnh đó, gà thừa hưởng miễn dịch thụ động từ mẹ lại nhanh làm cho chúng dễ mắc bệnh Vì vậy, thông thường người ta tiêm chủng cho gà để kiểm soát bệnh Độ tuổi tối ưu để chủng vaccine sống khó đóan trước hệ thống miễn dịch gà non yếu, khó đáp ứng mạnh với vaccine sống Ở đây, trình bày DNA vaccine chủng cho phôi gà Điểm mạnh DNA vaccine vừa sử dụng cho gà nở miễn dịch thụ động không cản trở đến DNA vaccine (Babiuk, 1999; Seigrist, 2001; Hasset, 2000) Để làm vaccine DNA, hay nhiều gen quy định kháng nguyên mầm bệnh li trích chuyển vào plasmid, tạo thành DNA tái tổ hợp Plasmid chuyển vào vsv nhận cho nhân lên Ly trích Plasmid chuyển vào vật chủ Bằng chế tế bào sủ dụng gen gen tiến hành tổng hợp protein kháng nguyên gen quy định Hệ thống miển dịch sẻ đáp ứng lại protrin kháng nguyên hình thành tính miển dịch Plasmid pVAX1 chứa gene VP2 giống GLS-BIDV giống D78IBDV có sẳn Gene VP3, VP4 từ D78 chuyển vào pUC19 thêm vào gene mã hóa protein không cấu trúc bị cắt bỏ tạo thành pUC19B69GLSVP2_NS pUC19B69GLSVP2_NS pVAX1 cắt EcoR1 Đoạn 3.2 kb (pUC19B69GLSVP2_NS) pVAX1được tách gel agarose 1% nối lại ligase tạo plasmid pVAX1B69GLSVP2_NS Plasmid chuyển vào Ecoli Chọn lọc khuẩn lạc thích hợp ly trích DNA Hàm lượng DNA vaccin xác định cách đo mật độ quang Sự tạp nhiểm kiểm tra điện di gel agarose - 30 - Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử Hình pVAX1 - 31 - Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử V KẾT LUẬN Gumboro, bệnh có tốc độ lây nhiễm cao, có khả gây chết đồng loạt gia cầm Gây thiệt hại nhiều cho ngành kinh tế nông nghiệp gia cầm toàn giới Ngày nay, với kỹ thuật sinh học phân tử đại, việc chẩn đoán, điều trị bệnh Gumboro nghiên cứu phát triển rộng rãi Một vài kỹ thuật điển hình sử dụng như: -Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang -Phản ứng kết tủa khuếch tán thạch (Agar gel precipitation test, AGP) -RT-PCR -RFLP -Phản ứng trung hòa virus(Virus neutralization=VN) -ELISA -Vaccine - 32 - Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.http://en.wikipedia.org/wiki/Infectious_Bursal_Disease 2.http://www.gumboro.com/ 3.http://www.oie.int/eng/normes/MMANUAL/A_00102.htm 4.Mirriam G.J Tacken, Patricia A.J Van Den Beuken, Ben P.H Peeters, Adri A.M Thomas, Peter J.M Rottier, Hein J Boot Homotypic interactions of the infectious bursal disease virus proteins VP3, pVP2, VP4 and VP5: mapping of the interacting domains Virology 2003, 312:306-319 5.Katarzyna Domanska, Gaelle Rivallan, Krzysztof Smietanka, Didier Toquin*, Zenon Minta, Nicolas Eterradossi* Antigenic characterization of polish infectious bursal disease virus strains Department of Poultry Diseases, National Veterinary Research Institute 6.Lenita Moura, Doctor of Philosophy (2004) Delivery of DNA and recombinant infectious bursal disease virus vaccines in ovo 7.http://www.freepatentsonline.com/6114112.html - 33 - [...]... Seminar Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử IV PHƯƠNG PHÁP-VẬT LIỆU IV.1 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang Một trong những kỹ thuật đánh dấu được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu miễn dịch học là kỹ thuật kháng thể huỳnh quang do Coons đề xướng năm 1942 Trong dịch tể học, kỹ thuật kháng thể huỳnh quang dùng để phát hiện nhanh chóng và phân biệt rõ ràng các tác nhân gây bệnh IV.1.1 Nguyên lý và. .. chứng bệnh, bệnh tích đặc trưng đem nghiền nhỏ pha với dung dịch PBS với tỷ lệ ½, xử lý kháng sinh, đông tan 3 lần - 18 - Seminar Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử Huyết thanh: Sử dụng huyết thanh dương tính tự chế IV.3 RT-PCR IV.3.1 Nguyên tắc Kỹ thuật sinh học phân tử phát triển cho phép ta có thể xác định IBDV một cách nhanh hơn bằng cách phân lập virus Trong số những phương pháp sinh học. .. thuộc vào sự định vị từ những primer được chọn Sự khuyếch đại gen mã hoá protein vỏ bên ngoài (protein capsid outer) - 19 - Seminar Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử Ly trích acid nucleic: Trong khi RNA chuỗi đơn rất dễ bị phân huỷ bởi enzyme Rnase, thì bộ gene RNA IBDV chuỗi đôi (dsRNA) kháng sự phân huỷ bởi enzyme RNase - 20 - Seminar Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử Trong... lọc các khuẩn lạc thích hợp rồi ly trích DNA Hàm lượng DNA vaccin được xác định bằng cách đo mật độ quang Sự tạp nhiểm được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose - 30 - Seminar Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử Hình pVAX1 - 31 - Seminar Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử V KẾT LUẬN Gumboro, một bệnh có tốc độ lây nhiễm cao, có khả năng gây chết đồng loạt ở gia cầm Gây thiệt hại... các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, việc chẩn đoán, điều trị bệnh Gumboro đã được nghiên cứu và phát triển rộng rãi Một vài kỹ thuật điển hình đã được sử dụng như: -Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang -Phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (Agar gel precipitation test, AGP) -RT-PCR -RFLP -Phản ứng trung hòa virus(Virus neutralization=VN) -ELISA -Vaccine - 32 - Seminar Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh. .. Cuối cùng, enzyme nền được thêm vào Kết quả được phát hiện bằng cách đo mật độ quang tương tự như phát hiện kháng thể - 29 - Seminar Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử IV.7 Vaccine Hiện nay, trên thế giới để phòng bệnh Gumboro người ta hay dùng vaccine nhược độc và vaccin vô hoạt trong dầu Tuy nhiên, sự phân phối vaccine bất hoạt trong gà tốn nhiều thời gian và khó khăn do tiêm dưới da hay...Seminar Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử Trong trường hợp nhẹ: Trong nang có những đám thâm nhiễm lớn của tế bào viêm ở mô giữa các nang Ở các nang có những tế bào rỗng tạo thành các không bào (Vacuolas) hoặc thấy hiện tượng hoại tử của các tế bào cùng những mảnh vụn của tế bào bị phá hủy, làm thành một khối Phản ứng viêm nhiễm không phân biệt rõ Việc các tế bào bị phá hủy... của loài thì có thể kiểm tra được nhiều loại kháng nguyên *Để chẩn đoán bệnh Gumboro, ta sử dụng kỹ thuật kháng thể huỳnh quang gián tiếp (Indirect Flourescent Antibody Test) -Kháng nguyên: Sử dụng thận của những con gà có triệu chứng, bệnh tích đặc trưng của bệnh Gumboro - 15 - Seminar Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử -Conjugate: Sử dụng Conjugate ở hiệu giá 1/40 (đã được thử hiệu giá... 1997; Jackwood và Sommer, 1998, 1999; Banda và cộng sự, 2001) RFLP đã thành công trong việc tìm vùng biến đổi của gen VP2 trên IBDV RNA của IBDV sau khi được chiết tách và thực hiện phản ứng RT-PCR sẽ thu được sản phẩm 743bp Sản phẩm 743bp này còn được gọi là 700+RTPCR Phân tích RT/PCR-RFLP sản phẩm 743 bp về sự hiện diện và vùng đa - 23 - Seminar Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử dạng của... Seminar Bệnh Gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử +Nếu kháng nguyên và kháng thể tương đồng thì phức hợp không bị rữa trôi và gắn với Conjugate sẽ phát sáng dưới KHV huỳnh quang-mẫu dương tính +Nếu kháng nguyên và kháng thể không tương đồng thì kháng thể sẽ bị rửa trôi và do đó không gắn được với Conjugate, không phát sáng dưới KHV huỳnh quang-mẫu âm tính -Ưu điểm: Chẩn đoán nhanh, độ chính xác cao và ...Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử I LỜI MỞ ĐẦU Sinh học phân tử môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật mức độ phân tử Phạm vi nghiên cứu môn có phần trùng lặp với ngành khác sinh học. .. xử lý kháng sinh, đông tan lần - 18 - Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử Huyết thanh: Sử dụng huyết dương tính tự chế IV.3 RT-PCR IV.3.1 Nguyên tắc Kỹ thuật sinh học phân tử phát triển... toàn trình nhiễm có mủ hoại tử với xuất không bào - 11 - Seminar Bệnh Gumboro kỹ thuật sinh học phân tử IV PHƯƠNG PHÁP-VẬT LIỆU IV.1 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang Một kỹ thuật đánh dấu ứng dụng