CHUYÊN ĐỀ: VI SINH VẬT LÊN MEN VÀ ỨNG DỤNG MỤC LỤC PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ Vi sinh vật sinh vật nhỏ bé đặc trưng phổ khả trao đổi chất rộng Một số hoạt động bao gồm tổng hợp, chuyển hóa, phân hủy chất người sử dụng để sản xuất thực phẩm, đồ uống sản phẩm khác ứng dụng bảo vệ môi trường Ngay từ buổi đầu văn minh nhân loại, chưa nhận thức tồn vi sinh vật nhiều tác dụng vi sinh vật ứng dụng sản xuất đời sống Nhiều tài liệu khảo cổ cho thấy cách 6000 năm, người dân Ai Cập có tập quán nấu rượu, Trung Quốc rượu sản xuất từ thời đại văn hóa Long Sơn (cách 4000 năm) Việc muối dưa thực từ năm 3500 trước Công nguyên Cùng với sản phẩm lên men khác rượu vang ủ từ nho loại trái khác, dấm, tương… Cùng với phát triển khoa học nói chung ngành Vi sinh vật học nói riêng, người phát chất trình lên men ứng dụng vào nhiều lĩnh vực đời sống sản xuất sản xuất cồn nhiên liệu, sản xuất acid hữu cơ… Chính tầm quan trọng ứng dụng thực tiễn mà chọn đề tài “Vi sinh vật lên men ứng dụng” Trong phạm vi chuyên đề này, xin sâu vào trình lên men vi sinh vật ứng dụng trình lên men PHẦN II: NỘI DUNG I Khái niệm lên men: 1.1 Lên men gì? Sự lên men hiểu theo nghĩa rộng trình trao đổi chất, qua chất hữu mà trước tiên đường bị biến đổi tác dụng enzyme vi sinh vật Lên men trình oxi hóa - khử sinh học giải phóng lượng hợp chất trung gian để cung cấp chovi sinh vật thực hoạt động sống sinh trưởng, sinh sản phát triển Trong trình đó, lượng giải phóng phần cách sử dụng phân tử chất hữu làm chất nhận electron cuối thay chuỗi vận chuyển electron Hay nói cách khác, lên men phản ứng trao đổi chất oxi hóa NADH thành NAD+ khử phân tử hữu chất nhận electron cuối Tùy thuộc vào chất tiếp nhận H+ cuối mà phân biệt hô hấp lên men hô hấp yếm khí Tuy lên men hô hấp yếm khí xảy điều kiện oxi khác với lên men, hô hấp yếm khí H + giải phóng chuyển qua chuỗi vận chuyển điện tử để đến chất nhận cuối nitrat sulfat Lên men trình thu lượng, qua H + tách khỏi chất chuyển đến chất nhận cuối chất hữu Hợp chất hữu khử vào môi trường dinh dưỡng tích tụ lại Phụ thuộc vào sản phẩm tích tụ chiếm ưu sản phẩm đặc trưng mà người ta phân chia thành kiểu: lên men rượu, lên men lactic, lên men butyric… 1.2 Phân loại sản phẩm lên men: Các chất sản xuất đường lên men nhờ vi sinh vật đa dạng, dựa vào tiêu chuẩn sinh lý trao đổi chất vi sinh vật, phân loại cách đơn giản sau: - Sinh khối tế bào: Đó trường hợp nấm men dùng cho mục đích dinh dưỡng làm nở bột mỳ, trường hợp nấm ăn dùng làm thức ăn Các vi khuẩn vi tảo nuôi cho mục đích dinh dưỡng, song chưa có ý nghĩa lớn mặt thương mại Ở cần phân biệt hai trường hợp: Thuật ngữ ''protein đơn bào'' (SCP) thường dùng để tế bào vi sinh vật sản phẩm công nghiệp với lý hàm lượng protein chúng cao quan tâm mặt thương mại Còn ''giống khởi động'' (starter culture) sản phẩm công nghiệp thân tế bào vi sinh vật dùng làm nguyên liệu cấy Chẳng hạn giống vi khuẩn lactic bán dạng nguyên liệu cấy (inoculants) để sản xuất sản phẩm sữa lên men xúc xích - Các sản phẩm trao đổi chất: Gồm loại sản phẩm sau: + Các sản phẩm cuối trao đổi lượng: sản phẩm trình lên men ethanol, acid lactic, acid acetic, methane, acid propionic… + Các chất trao đổi bậc 1: chất có vai trò viên gạch cấu trúc nên vật chất tế bào, có trọng lượng phân tử thấp cao phân tử sinh học Có thể kể đến như: amino acid, nucleotide, đường, acid béo, vitamin… Ngoài bao gồm sản phẩm trình trao đổi chất trung gian acid hữu chu trình TCA (tricarboxylic acid) + Các chất trao đổi bậc 2: chất trao đổi có trọng lượng phân tử thấp, không diện tất thể sinh vật Những chất thường chức chung trao đổi chất tế bào, tế bào tồn mà không cần đến chúng, nhiên, chúng lại đóng vai trò quan trọng viêc trì loài điều kiện sinh thái định Ví dụ: chất kháng sinh, độc tố, gibberellin, alkaloid… + Các loại enzyme: protein xúc tác cho biến đổi chất tế bào Một tế bào vi sinh vật chứa khoảng 1000 loại enzyme với số phân tử lên đến 10 6, gồm enzyme nội bào (chiếm đa số) enzyme ngoại bào Ví dụ: amylase, protease, cellulase… - Các sản phẩm chuyển hoá: bao gồm steroid sản phẩm oxi hoá không hoàn toàn tạo thành acid acetic socbose 1.3 Các kiểu lên men: Dựa sản phẩm tạo thành, chia thành kiểu lên men lên men rượu, lên men lactic, lên men propionic, lên men acid hỗn hợp, lên men butiric lên men homoacetic… Có nhiều trình lên men phân loại dựa chất lên men thay sản phẩm Chẳng hạn, nhiều vi khuẩn kỵ khí tạo thành bào tử (chi Clostridium) lên men amino acidvới sản sinh acetate, amoniac H2 Các loài Clostridium khác, C acidiurici C purinolyticum lên men purine xanthine adenine với tạo thành acetate, format, CO2, amoniac Còn vi sinh vật kỵ khí khác lên men hợp chất thơm Chẳng hạn, vi khuẩn Pelobacter acidigallici lên men hợp chất thơm phloroglucinol (1,3,5-benzenetriol, C6H6O3) theo đường sau: Phloroglucinol (C6H6O3) +3H2O → 3acetate + 3H+ Kiểu lên men Phản ứng tổng quát Lên men ethylic Hexose→ ethanol + 2CO2 Lên men lactic đồng hình Lên men lactic dị hình Lên men propionic Lên men acid hỗn hợp Hexose → lactate + 2H+ Hexose → lactate + ethanol + CO2 + H+ Lactate → propionate + acetate + CO2 Hexose → ethanol + 2,3- butandiol + succinate + lactate + acetate + format + H2 + CO2 Lên men butiric Lên men butanol Hexose → butirate + acetate + H2 + CO2 Hexose → butanol + acetate + acetol + ethanol + H2 + CO2 Ethanol + acetate + CO2→ caproat + butirate + Lên men caproat H2 Lên men Fructose → acetate + 3H+ + H2 + CO2 → homoacetic acetate + H2O Lên men sinh Acetate + H2O → CH4 + HCO3methane Vi sinh vật thực Nấm men Zymomonas Streptococcus Một số Lactobacillus Leuconostoc Một số Lactobacillus Propionibacterium Clostridium propionicum Các vi khuẩn đường ruột: Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter Clostridium butyricum Clostridium acetobutylicum Clostridium kluyveri Clostridium aceticum Acetobacterium Methanothrix Methanosarcina Bảng 1: Các kiểu lên men Nhiều trình lên men không thông thường thực nhóm hạn chế vi khuẩn kị khí, số trường hợp vi khuẩn Một số ví dụ nêu bảng Nhiều số vi khuẩn xem chuyên gia trao đổi chất chúng có khả phân giải nhiều chất mà vi khuẩn khác không phân giải Kiểu lên men Acetylen Glycerin Resocxinol (hợp chất thơm) Xinamat Phản ứng tổng quát C2H2 + H2O → ethanol + acetate + H+ Glycerin + HCO3-→ acetate + H+ + H2 O Vi sinh vật thực Pelobacter acetylenicus Acetobacterium spp C6H4(OH)2 + H2O → acetate + butirate + H+ Clostridium spp C9H7O2 + H2O → C9H9O2 + benseat + acetate Acetovibrio multivorans (hợp chất thơm) Phlorogluxinol (hợp chất thơm) Putresxin Citrate Aconitrate Glyoxylate Succinate Oxalate Malonate + H+ C6H6O3 + H2O → acetate + H+ Pelobacter masiliensis Pelobacter acidigallici 10 C4H12N2 + 26 H2O → acetate + butirate + 20 NH4+ + 16 H2 + 13 H+ Các vi khuẩn kỵ khí gram dương không sinh bào tử chưa phân loại Citrate + H2O → format + acetate + HCO3- + H+ Aconitrate + H+ + H2O → CO2 + acetate + H2 glyoxylate + H+ + H2O → CO2 + H2 + Glycolate Succinate + H2O → Propionat + HCO3Oxalate + H2O → format + HCO3Malonate + H2O → acetate + HCO3- Bacteroides sp Acidaminococcus fermentans Vi khuẩn gram âm chưa phân loại Propionigenium modestum Oxalobacter formigenes Malonomonas rubra Sporomusa malonica Bảng 2: Một số trình lên men không thông thường II Các vi sinh vật tham gia trình lên men: 2.1 Nấm men: Nấm men (Yeast, Levure) thường tồn dạng đơn bào, đa số sinh sản theo lối nảy chồi, có theo hình thức phân cắt tế bào, nhiều loại có khả lên men đường thích nghi với môi trường chứa đường cao, có tính acid cao Nấm men phân bố rộng rãi tự nhiên, môi trường có chứa đường, có pH thấp, chẳng hạn hoa quả, rau dưa, rỉ đường, đất trồng loại ăn quả, đất có nhiễm dầu mỏ Nhiều loại nấm men sử dụng rộng rãi là: Saccharomyces cerevisiae (làm men nở bánh mỳ, làm đồ uống vang, rượu, bia…, thu sinh khối protein), Candida Utilis (thu sinh khối dùng làm thức ăn cho chăn nuôi) 2.2 Nấm sợi: Nấm sợi (Microfilamentous fungi) tất nấm nấm men không sinh mũ nấm Nấm sợi gọi nấm mốc, có dạng sợi phân nhánh, vách ngăn, lối sống hiếu khí, chủ yếu hoại sinh Nấm sợi phân bố rộng rãi tự nhiên, tham gia tích cực vào vòng tuần hoàn vật chất, trình phân giải chất hữu hình thành chất mùn Rất nhiều loài nấm sử dụng rộng rãi công nghiệp lên men như: Eremothecium asbyii (thu Riboflavin có tính chất vitamin), Blakeslea trispora (thu làm chất tạo màu thực phẩm)… 2.3 Nấm thể: Nấm thể mang lại nhiều giá trị cho người, đặc biệt, số nấm thể tạo chất trao đổi bậc trình lên men cung cấp cho công nghiệp dược phẩm Có thể kể đến chất ecgotamin ecgotoxin tạo trình lên men Claviceps purpurea dùng sản khoa điều trị bệnh mạch máu hay bệnh đau nửa đầu 2.4 Vi khuẩn: Vi khuẩn (Bacteria) có nhiều hình thái cách xếp khác nhau, kích thước nhỏ so với nấm sợi nấm men Phần lớn vi khuẩn thuộc nhóm dị dưỡng, đời sống hiếu khí, kị khí dạng sống tuỳ nghi Nhiều vi khuẩn có ứng dụng sản xuất Methanomonas methanica (sản xuất sinh khối dùng sản xuất thức ăn chăn nuôi), Acetobacter suboxydans (vi khuẩn lên men acetic dùng chế biến thực phẩm đồ uống), nhóm vi khuẩn lên men lactic Lactobacillus sử dụng nhiều chế biến thực phẩm, Corynebacterium glutamicium (vi khuẩn tham gia chủ yếu quy trình sản xuất mỳ chính)… 2.5 Xạ khuẩn: Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi tự nhiên Phần lớn xạ khuẩn hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ti) Xạ khuẩn nhóm vi sinh vật đóng vai trò quan trọng tự nhiên Chúng tham gia vào trình chuyển hóa nhiều hợp chất tự nhiên Trên 80% chất kháng sinh phát xạ khuẩn sinh (ví dụ dòng xạ khuẩn thuộc chi Penicillium, Streptomyces) Xạ khuẩn dùng để sản xuất nhiều loại enzyme, vitamin, acid hữu (như Actinomyces) 2.6 Vi khuẩn lam Trước vi khuẩn lam (Cyanobacteria) gọi tảo lam (Cyanophyta) hay tảo lam lục Thực nhóm vi sinh vật nhân nguyên thủy thuộc vi khuẩn thật Vi khuẩn lam có khả tự dưỡng quang nhờ có chứa sắc tố quang hợp Vi khuẩn lam phân bố rộng rãi tự nhiên, nhiều loài có ý nghĩa sản xuất sinh khối giàu protein, cố định đạm hay sử dụng công nghiệp xử lí nước thải III Một số phương pháp kỹ thuật lên men vi sinh vật: 3.1 Quá trình lên men: Lên men trình phức tạp bao gồm nhiều giai đoạn, tóm tắt giai đoạn trình lên men sơ đồ sau: Hình 1: Sơ đồ tổng quát trình lên men 3.1.1 Chọn giống vi sinh vật: Để chọn giống vi sinh vật chủng, bước phải phân lập chúng từ nguồn tự nhiên nước, không khí, đất, vật liệu hữu cơ, vô bị phân hủy Từ kĩ thuật vi sinh vật học cổ điển từ thời L Pasteur R Koch đề ra, nhiều phương pháp đặc biệt dùng để phân lập chủng giống khiết Từ ổ sinh thái tự nhiên phân lập chủng hoang dại Các chủng có số hoạt tính sinh enzyme, tích tụ chất trao đổi bậc 1, bậc Trong trình lên men, giống cấy chuyền từ chủng bảo quản kiểm tra hoạt tính Việc hoạt hóa giống thường xuyên kiểm tra chất lượng giống cần thiết thiếu Hoạt hóa giống thường tiến hành sau thời gian sử dụng cách nuôi môi trường giàu chất kích thích sinh trưởng cao nấm men, nước chiết cà chua, hỗn hợp vitamin, acid béo… Đồng thời phải có phương pháp giữ giống thích hợp để trì hoạt tính ưu việt chúng, chống thoái hóa giống hoạt tính Do cần tiến hành kiểm tra độ khiết giống lên men kiểm tra khả hồi biến giống Nhân giống thực phương pháp nuôi cấy chìm với điều kiện nuôi cấy điều khiển cho xảy sinh trưởng không tạo thành sản phẩm Đối với xạ khuẩn nấm sinh bào tử, trước nuôi chìm phải thực nhân bào tử môi trường đặc (như môi trường cám, bột bắp, thóc, trấu, mùn cưa…) cần thời gian dài để chúng tạo bào tử Bào tử thu hồi cho vào bình khô có gắn miệng bình parafin để sử dụng Nói chung chủng vi sinh vật nhân giống để đưa vào lên men cần đảm bảo yêu cầu công nghệ sau: - Dịch giống không tạp nhiễm, đặc biệt thực khuẩn thể (Bacteriophage) - Các tế bào đảm bảo độ tuổi sinh lý thời gian sinh trưởng tốt nhất, có hoạt tính cao nhất, thường nửa sau pha sinh trưởng - Các thông số kĩ thuật OD, pH, màu sắc, mùi vị… quy định dây chuyền công nghệ 3.1.2 Chuẩn bị nguyên liệu cấy: Nguyên liệu cấy Giống sản xuất thường bảo quản để tránh giảm hoạt tính Do đó, việc cấy giống môi trường thạch nghiêng trước nhân giống việc làm cần thiết Có thể coi việc “đánh thức” chủng giống đồng thời để kiểm tra hoạt tính giống sau thời gian bảo quản nhiệt độ thấp Từ những tế bào bào tử riêng rẽ chủng bảo quản, cấy số culture, culture nhân giống phòng thí 10 mẻ trước Trong lên men công nghiệp, trước cấy chuyền nấm men vào dịch để lên men, người ta tiến hành nhân giống chủng khiết phòng thí nghiệm nhân giống trung gian phân xưởng Nấm men sau nhân giống cấy vào dịch lên men với tỷ lệ 6-10% thể tích để thực lên men Nhiệt độ lên men vào khoảng 22-28 oC (tuỳ thuộc vào loại rượu vang), thời gian lên men dài hay ngắn phụ thuộc vào nhiệt độ lên men thường kéo dài 7-20 ngày Dịch lên men đạt 8-10% cồn Lên men phụ 15-18 oC 15-20 ngày Sau lên men phụ, độ cồn 14 o phải thêm cồn nồng độ cao chuyển sang tàng trữ nhiệt độ thấp 10 oC Tàng trữ 10 ngày, sau tách cặn hoàn thành sản phẩm tàng trữ tiếp tục Hình 11: Sơ đồ công nghệ sản xuất rượu vang 35 Trong thực tế có hai cách chế biến rượu vang phổ biến cách chế biến rượu vang trắng cách chế biến rượu vang đỏ Rượu vang đỏ có thực lên men nước nho lẫn với xác Trong vỏ có chứa nhiều chất màu, tanin, chất thơm Những chất phân huỷ trình lên men làm tăng lượng chất hoà tan tạo hương thơm, màu sắc đẹp cho rượu Lên men xác thường tiến hành nhiệt độ cao nhằm trích ly triệt để chất màu, chất thơm tanin Khi kết thúc lên men cần tách xác khỏi rượu Trong sản xuất lớn, trước hết người ta cho rượu chảy qua lưới để giữ xác lại Rượu thu lúc có chất lượng cao gọi rượu vang giọt, vang chảy Khi rượu ngừng chảy, xác lưới ép máy ép để thu rượu vang ép Rượu vang ép chiếm tỷ lệ khoảng 15% tổng số rượu chế đem trộn với rượu vang chảy Rượu vang đỏ có hàm lượng tanin nhiều rượu vang trắng nên có vị chát Do đó, sau lên men rượu cần tiến hành lên men malolactic nhằm chuyển hoá acid malic thành acid lactic tạo cho rượu có vị chua dịu cân vị chát tanin Có thể sử dụng vi khuẩn lactic lượng nhỏ nấm men Schizosaccharomyces để có khả lên men malolactic triệt để Rượu vang trắng lên men từ tách bã nên màu Hương vị rượu vang trắng chủ yếu nước Rượu vang trắng thường lên men nhiệt độ thấp rượu vang đỏ (khoảng 15 – 20oC) để giữ hương vị cho rượu Thời gian lên men 6-7 ngày lâu tuỳ theo nhiệt độ yêu cầu công nghệ Kết thúc trình lên men nhận thấy rượu không sủi bọt lên nữa, cặn xác men lắng xuống đáy thùng Khi tiến hành gạn cặn, rượu trẻ chuyển sang thùng mới, tiếp tục lắng đưa tàng trữ 4.2 Lên men lactic: 4.2.1 Khái niệm lên men lactic: Lên men lactic trình chuyển hóa sinh học kỵ khí chứa hợp chất đường thành acid lactic số sản phẩm khác Con người từ lâu sử dụng vi sinh vật lên men lactic để bảo quản chế biến loại thức ăn, đặc biệt thức ăn có nguồn gốc từ sữa Năm 1857, L Pasteur chứng minh sữa chua kết hoạt động nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi vi sinh vật lên men lactic 36 Những vi khuẩn lên men lactic đa dạng,có thể thuộc nhóm Streptococcus, Leuconostoc, Pedicoccus, Lactobacillus, Bifidobacterium… Tuy nhiên, tất chúng có đặc điểm chung là: - Đó vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử, catalase âm, oxidase âm, nitratoreductase âm - Khả sinh tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sống vi khuẩn yếu nên chúng vi sinh vật đa khuyết dưỡng nhiều acid amin, bazơ nitơ, vitamin… khả tổng hợp nhân hem porphyrine, bình thường chúng cytochrome - Chúng vi sinh vật kỵ khí tùy nghi, vi khuẩn hiếu khí, loại thể vừa có khả lên men hiếu khí kỵ khí 4.2.2 Cơ chế trình lên men lactic: Có kiểu lên men lactic vi sinh vật là: lên men lactic đồng hình lên men latic dị hình 4.2.2.1 Lên men lactic đồng hình: Lên men lactic đồng hình trình lên men sản phẩm acid lactic tạo chiếm đa số (trên 90%) Trong trình lên men lactic đồng hình, glucose chuyển hóa theo chu trình Embden-Mayerhoff tạo thành acid pyruvic Vì vi khuẩn lên men lactic đồng hình enzyme carboxylase nên acid pyruvic không phân hủy mà tiếp tục khử thành acid lactic Phương trình tổng quát tóm tắt sau: glucose + 2ADP + 2Pi → lactate + 2ATP 4.2.2.2 Lên men lactic dị hình: Lên men lactic dị hình trình lên men sản phẩm acid lactic (40%) tạo lượng đáng kể sản phẩm phụ acid acetic (10%), ethanol (10%), acid succinic (20%), CO2… khí mà thay vào tích lũy lượng acid formic Về bản, vi khuẩn lên men lactic dị hình enzyme sơ đồ Embden-Mayerhoff aldolase triozophosphatizomerase bước đầu phân giải đường glucose 37 nên chúng theo đường Pentose phosphate để tạo thành phân tử: 3-phospho glyceraldehyde phospho acetyl Hợp chất trisophosphate qua số phản ứng lên men đồng hình để chuyển thành acid lactic, phospho acetyl chuyển thành ethanol chuyển thành acid acetic Do đó, lên men lactic dị hình acid lactic có thêm sản phẩm phụ khác Lên men lactic dị hình trình lên men kỵ khí phức tạp gây nhiều giống vi khuẩn như: Leuconostoc, Lactobacillus, Bifidobacterium, Escherichia, Clostridium… Phương trình tổng quát trình lên men lactic dị hình tóm tắt sau: glucose + H2O + ADP + Pi → lactate + ethanol + CO + H2 + acetat + acid succinic + diacetyl + acetaldehyde 38 Hình 12: Sơ đồ trình lên men lactic đồng hình lên men lactic dị hình 4.2.3 Ứng dụng lên men lactic: 4.2.3.1 Sử dụng vi khuẩn lactic để muối chua rau, củ, ủ thức ăn gia súc: Việc sử dụng vi khuẩn lactic để muối chua rau, củ hình thức bảo quản thực phẩm công nghệ lên men vi sinh Phương pháp giúp tạo lượng sinh khối vi khuẩn có ích để át lại vi sinh vật gây thối, tạo hương vị thơm ngon cho sản phẩm, chuyển rau củ dạng “chín sinh học” nhằm tăng hiệu suất tiêu hóa Quá trình chuyển hóa sinh học muối rau củ gồm giai đoạn: 39 - Giai đoạn 1: Muối NaCl với nồng độ muối dưa 2,5-3% tạo môi trường ưu trương làm chất từ tế bào rau củ khuếch tán phần môi trường, môi trường để vi khuẩn lactic loại vi sinh vật khác phát triển - Giai đoạn 2: Vi khuẩn lactic phát triển mạnh làm pH môi trường giảm xuống 3-3,5 làm ức chế vi khuẩn khác, đặc biệt vi khuẩn gây thối, đồng thời phát triển ưu vi khuẩn lactic tạo lượng acid lactic lớn giúp rau củ trở nên chua, ngon Trong giai đoạn này, bị rửa rau không hay rau củ bị dập nát gây lẫn tạp khuẩn môi trường, nồng độ muối cao (lớn 5-6%) làm ức chế phát triển vi khuẩn có vi khuẩn lactic, nồng độ muối thấp (nhỏ 3%) tạo điều kiện cho tạp khuẩn lấn át Hơn nữa, trình lên men lactic trình lên men kỵ khí nên không đậy nén kỹ không tạo điều kiện cho lên men lactic thực hiện, thay vào lên men hiếu khí vi sinh vật khác Những bất lợi gây tượng dưa khú - Giai đoạn 3: Khi rau chua, lượng acid lactic tăng cao làm độ pH môi trường giảm xuống, pH giảm đến vi khuẩn lactic bị ức chế, tạo điều kiện cho nấm men dại, nấm mốc vi sinh vật khác phát triển, phân giải acid lactic thành CO 2, H2O làm môi trường giảm chua tạo váng bề mặt Sản phẩm rau củ muối chua vi khuẩn gây bệnh, có kháng sinh nisine, diplococcine nên có ích cho tiêu hóa điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột Tương tự trình muối rau củ, loại cỏ dùng chăn nuôi ủ chua để giữ chất lượng dinh dưỡng, phân giải số polysaccharide protein thành đoạn ngắn hơn, đồng thời bổ sung nhiều loại vitamin vi khuẩn tổng hợp nên 4.2.3.2 Lên men sữa chua: Sữa chua kết trình hoạt động vi sinh vật làm thay đổi thành phần có sữa mà đặc trưng trình lên men tạo thành acid lactic từ đường lactose Trong số sản phẩm đặc biệt có tạo thành ethanol Vi sinh vật sử dụng sản xuất sữa chua vi khuẩn lactic với hai loài đặc trưng: Lactobacillus bulgaricus (là vi khuẩn lên men điển hình, phát triển tốt nhiệt độ 45-50 oC môi trường có độ acid cao) Streptococcus thermophilus (phát triển tốt nhiệt độ 40 50oC sinh sản tốt nhiệt độ 37-40 oC) Hai loài vi khuẩn thuộc loại vi khuẩn hiếu khí chịu môi trường có độ acid thấp (pH = 4-4,5) Trong sản xuất sữa chua, việc cấy hỗn hợp hai loài vi khuẩn cho kết sinh acid lactic tốt sử dụng riêng loài L bulgaricus có khả thuỷ phân casein thành số acid amin tạo điều kiện cho S thermophilus phát triển Quá trình sản xuất sữa chua nuôi cấy hỗn hợp hai loài chia thành giai đoạn: - Giai đoạn 1: pH sữa thích hợp cho loài Streptococcus hoạt động chiếm ưu đảm bảo cho trình lên men lactic bắt đầu Hoạt độ enzyme phân huỷ casein Lactobacillus kích thích phát triển Streptococcus, độ acid tăng lên - Giai đoạn 2: pH sữa thay đổi làm cho Streptococcus khó phát triển Lúc Lactobacillus chỗ vón cục sữa bắt đầu Sữa chua sản xuất từ sữa tươi tự nhiên sữa bột hoà tan với sữa tươi Sau trùng nhiệt độ 95oC, sữa làm lạnh đến nhiệt độ 42-46 oC cấy hai loại vi khuẩn để thực trình lên men nhiệt độ 40-50oC thời gian 2-3h Để sản phẩm có độ chua nhẹ thơm, người ta sử dụng tế bào vi khuẩn Streptococcus giai đoạn trẻ môi trường lên men có độ acid thấp Ngược lại, muốn sữa chua có độ acid cao cần sử dụng tế bào Streptococcus già sử dụng Lactobacillus 41 Hình 13: Sơ đồ quy trình sản xuất sữa chua 4.2.3.3 Công nghệ sản xuất phomat: Phomat sản phẩm lên men hay không lên men, loại sản phẩm chịu tác động trình lên men lactic chủ yếu từ thành phần casein sữa tạo thành dạng gel nước Phomat giữ lại hoàn toàn lượng chất béo ban đầu Ngoài sản phẩm 42 chứa lactose dạng acid lactic tỷ lệ khác chất khoáng Sản xuất phomat gồm ba giai đoạn sau: Hình 14: Sơ đồ quy trình sản xuất phomat - Tạo gel casein hay gọi trình đông tụ sữa: Quá trình xảy tác dụng đồng thời men dịch vị dày bê acid lactic sinh từ trình lên men lactose vi khuẩn Đôi hai dạng đông tụ chiếm ưu - Quá trình tách nước phần gel thực theo nhiều phương pháp khác tuỳ thuộc vào chất trình đông tụ - Quá trình làm chín phomat nhờ hệ enzyme vi sinh vật Trong thực tế vi khuẩn lactic nấm mốc đượcc sử dụng công nghiệp sản xuất phomat nhiều Các loại vi khuẩn lactic thường sử d ụng sản xuất phomat như: Streptococcus lactis, Streptococcus thermophilus Lactobacillus helveticus Các chế phẩm nấm mốc thưòng sử dụng sản xuất phomat là: Penicillium candidum Penicillium glaucum 43 PHẦN III: MỘT SỐ CÂU HỎI VẬN DỤNG Câu 1:Trong trình sản xuất loại đồ uống chứa rượu bia, rượu vang, rượu Sake, rượu Whisky, rượu làm từ mía, rượu gạo… có điểm giống khác nhau? Đáp án: Trong trình sản xuất loại đồ uống chứa rượu bia, rượu vang, rượu Sake, rượu Whisky, rượu làm từ mía, rượu gạo… - Những điểm giống nhau: + Đều trình lên men nhờ hoạt động vi sinh vật (cho sản phẩm rượu) + Nguyên liệu sử dụng cho trình lên men đường glucose + Sản phẩm trình C 2H5OH, tùy vào quy trình sản xuất, vi sinh vật thời gian mà trở thành loại rượu - Những điểm khác nhau: + Lấy đường glucose từ nguồn khác (trái chín, tinh bột, đường mía…), bia lấy tinh bột từ đại mạch + Các vi sinh vật sử dụng trình Câu 2:So sánh trình lên men ethylic lên men lactic Đáp án: - Giống nhau: + Đều trình lên men vi sinh vật thực + Chất hữu tham gia không phân giải hoàn toàn + Đều trải qua sản phẩm trung gian acid pyruvic - Khác nhau: 44 + Lên men lactic: thực vi khuẩn Acid pyruvic chất nhận điện tử cuối bị khử thành acid lactic + Lên men ethylic: thực nấm men Acid pyruvic bị loại CO để tạo thành acetaldehyde, chất đóng vai trò chất nhận điện tử cuối sau khử thành rượu ethylic Câu 3:Kỹ thuật muối dưa làm sữa chua ứng dụng trình nào? Nhóm vi khuẩn thực trình này? Tại dưa muối lại bảo quản lâu? Đáp án: - Kỹ thuật muối dưa làm sữa chua ứng dụng trình lên men - Do nhóm vi khuẩn lactic thực - Dưa muối bảo quản lâu, acid lactic tiết với nồng độ muối cao kìm hãm sinh trưởng vi sinh vật khác nên bảo quản lâu Câu 4:Rượu vang không trùng cách dễ bị vi khuẩn lactic dị hình làm chua, không để lâu Hãy giải thích sao? Đáp án: Trong trình lên men, rượu vang dễ bị nhiễm vi khuẩn lactic dị hình (Leuconostoc oenos) Nếu rượu vang không trùng cách, vi khuẩn rượu vang biến đổi phần dư glocose thành acid lactic, CO 2, etanol, acid acetic… rượu vang có bọt bị chua Câu 5:Để sản xuất loại protein làm thức ăn chăn nuôi, người ta nuôi nấm men thùng với điều kiện: độ pH phù hợp, nhiệt độ thích hợp, đầy đủ chất dinh dưỡng thổi khí liên tục Sau ngày lấy ra, ly tâm, thu sinh khối, làm khô đóng gói Đây có phải trình lên men không? Vì sao? 45 Đáp án: - Do lên men trình hô hấp kỵ khí, chất nhận điện tử cuối chất hữu Khi oxi, nấm men tiến hành lên men, tạo rượu ethylic - Trong trường hợp trên, có oxi (thổi khí) chúng sinh trưởng cho sinh khối mà không lên men Do trình lên men Câu 6:Đặt chủng Saccharomyces vào ống nghiệm vào 5ml dung dịch đường saccharose mol/lít Nếu để ống nghiệm pha loãng đường bịt kín vào tủ ấm 28-30oC 5-6 có tượng gì? Viết tóm tắt giai đoạn trình Còn để ống nghiệm máy lắc có cung cấp oxy vô trùng sao? So sánh lượng tích lũy tế bào từ trình Đáp án: Nếu để ống nghiệm pha loãng đường bịt kín vào tủ ấm có lên men rượu Vì Saccharomyces nấm men rượu, phân giải disaccharide thành glucose theo đường từ glucose theo EMP thành pyruvat, thành etanol Nếu để ống nghiệm máy lắc có cung cấp oxy vô trùng có hô hấp hiếu khí theo sơ đồ sau: Glucose → acid pyruvic → acetyl CoA → Kreb → CO Chuỗi vận chuyển điện tử → H2O Năng lượng hữu ích dạng ATP: - Lên men: ít, khoảng ATP/glucose - Hô hấp: nhiều, khoảng 36-38 ATP/glucose Câu 7:Tại bánh phồng tôm phồng lên nhanh cho vào chảo mỡ nóng? Đáp án: Nguyên liệu làm bánh phồng tôm gồm tinh bột sắn, lòng trắng trứng gà, acid citric, đường kính, muối ăn, tôm, nấm men Saccharomyces cerevisiae Khi trộn hỗn hợp bột với nấm men, 46 chúng sinh sản nhanh chóng tạo lượng sinh khối lớn, sau tiến hành lên men rượu tạo lượng CO2 lớn Khí bị nhốt khung gluten bột.Khi đem nướng cho vào chảo mỡ nóng, tác dụng nhiệt độ, khung gluten bị vỡ, giải thoát CO làm cho bột nở tung trở nên xốp Câu 8:Vì nấu rượu, không nên mở nắp xem thường xuyên? Đáp án: Quá trình nấu rượu ứng dụng tượng lên men ethylic nấm men Trong điều kiện kỵ khí, nấm men tiến hành lên men để tạo rượu ethylic Khi mở nắp làm oxy bên lọt vào, oxy tạo điều kiện cho vi khuẩn acetic từ không khí lọt vào tiến hành oxi hóa rượu thành acid acetic tạo lượng C2H5OH + O2 → CH3COOH + H2O + Q Mặt khác, điều kiện có oxy, nấm men tiến hành hô hấp hiếu khí tạo thành nước làm rượu nhạt Câu 9:Hai bình A B chứa hỗn hợp giống hệt gồm nấm men rượu trộn với dung dịch glucose nồng độ 10 g/l Bình A để mở nắp làm sủi bọt liên tục nhờ cho dòng không khí qua Binh B bị đóng kín miệng để yên Sau thời gian, cho biết bình nhiều đường hơn? Vì sao? Đáp án: Bình nhiều đường bình A Trong binh A, nấm men thực trình hô hấp hiếu khí, trình giải phóng nhiều lượng (36-38 ATP/1 glucose), không cần phân giải nhiều đường → lượng đường lại nhiều Trong bình B, nấm men thực trình lên men, trình giải phóng lượng, cần nhiều nguyên liệu → lượng đường lại 47 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Như chuyên đề phân tích chế số trình lên men vi sinh vật trình bày số ứng dụng trình đời sống công nghiệp Đặc biệt sâu vào hai trình lên men vi sinh vật ứng dụng rộng rãi lĩnh vực, từ bảo quản, chế biến thực phẩm đến sản xuất nhiên liệu lên men ethylic lên men lactic Với khoảng thời gian hạn hẹp, chuyên đề nêu số ứng dụng bật sản xuất rượu ethylic, sản xuất bia, rượu vang, làm sữa chua, muối chua rau củ quả, ủ thức ăn gia súc, sản xuất phomat…và ứng dụng ý quan tâm nhiều quốc gia Thế giới sản xuất cồn etanol nhiên liệu Đây hướng mở để phát triển đề tài tương lai nhằm tận dụng nhiều nguồn nguyên liệu tinh bột phụ phẩm công nghiệp chế biến có chứa hàm lượng cellulose cao Trong chuyên đề này, đề xuất số câu hỏi vận dụng dùng trình bồi dưỡng Học sinh giỏi phần ứngd ụng vi sinh vật lên men Do hạn chế thời gian nên chuyên đề nội dung chưa tìm hiểu sâu, mong nhận góp ý quý thầy cô đồng nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn! 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Kiều Hữu Ảnh 1999 Giáo trình vi sinh vật công nghiệp NXB Khoa học & Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Thành Đạt 2011 Cơ sở sinh học vi sinh vật - Tập II NXB Đại học Sư Phạm Hà Nội Hoàng Đình Hòa 1998 Công nghệ sản xuất malt bia NXB Khoa học & Kỹ thuật Hà Nội Trần Thị Thanh 2007 Công nghệ vi sinh NXB Giáo dục Hà Nội Lê Thị Liên Thanh, Lê Văn Hoàng 2002 Công nghệ chế biến sữa sản phẩm từ sữa NXB Khoa học & Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Đình Thưởng, Nguyễn Thanh Hằng 2002 Công nghệ sản xuất kiểm tra cồn ethylic NXB Khoa học & Kỹ thuật Hà Nội Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành 2007 Công nghệ sinh học – Tập V: Công nghệ vi sinh môi trường NXB Giáo dục Hà Nội Phạm Văn Ty 2011 Bồi dưỡng học sinh giỏi Sinh học THPT – Phần vi sinh vật học NXB Giáo dục Hà Nội Phạm Văn Ty, Nguyễn Vĩnh Hà 2008 Tài liệu giáo khoa chuyên Sinh học THPT – Phần vi sinh vật học NXB Giáo dục Hà Nội 49 [...]... chuyên đề này, tôi chỉ xin trình bày 18 ứng dụng của hai quá trình lên men phổ biến nhất của vi sinh vật là lên men ethylic và lên men lactic 4.1 Lên men ethylic: 4.1.1 Khái niệm: Rượu ethylic là một trong số các sản phẩm lên men phổ biến nhất gặp ở vi sinh vật Vi sinh vật sản sinh rượu ethylic chủ yếu là nấm men, đặc biệt là các chủng thuộc Saccharomyces cerevisiae Lên men rượu là quá trình sinh hóa... đến 12% thì quá trình lên men bị đình chỉ hoàn toàn Lên men bia được thực hiện theo hai giai đoạn: giai đoạn lên men chính và giai đoạn lên men phụ (tàng trữ) Hiện nay, có hai phương pháp lên men được sử dụng phổ biến ở các nhà máy là lên theo phương pháp cổ điển và lên men theo phương pháp hiện đại Đối với lên men theo phương pháp cổ điển quá trình lên men chính và quá trình lên men phụlà hai giai đoạn... nghiệm và nhân giống trung gian trong phân xưởng Nấm men sau khi nhân giống được cấy vào dịch lên men với tỷ lệ 6-10% thể tích để thực hiện lên men chính Nhiệt độ lên men vào khoảng 22-28 oC (tuỳ thuộc vào loại rượu vang), thời gian lên men dài hay ngắn phụ thuộc vào nhiệt độ lên men và thường kéo dài 7-20 ngày Dịch lên men chính đạt được 8-10% cồn Lên men phụ ở 15-18 oC trong 15-20 ngày Sau khi lên men. .. cho vi c tổng hợp sản phẩm mong muốn Điều đó đúng với các nguyên tố đại lượng cũng như vi lượng Chẳng hạn bằng cách đưa Co vào mà đạt được thu hoạch cao về vitamin B12, hay sự thiếu sắt kích thích quá trình tổng hợp acid citric IV Các quá trình lên men và ứng dụng: Vi sinh vật thực hiện nhiều quá trình lên men khác nhau như lên men ethylic, lên men lactic, lên men butyric… Tuy nhiên, trong khuôn khổ chuyên. .. gấp 2 hoặc 3 lần để dịch lên men có khoảng 16-18% đường Có thể trong quá trình lên men còn bổ sung thêm đường Lên men: Trường hợp lên men tự nhiên, người ta để cho khối dịch quả tự lên men với các nòi nấm men có sẵn trong vỏ quả từ ngoài đồng ruộng mang về hoặc bổ sung các dịch đang lên men ở các 34 mẻ trước Trong lên men công nghiệp, trước khi cấy chuyền nấm men vào dịch để lên men, người ta tiến hành... trữ 4.2 Lên men lactic: 4.2.1 Khái niệm lên men lactic: Lên men lactic là quá trình chuyển hóa sinh học kỵ khí chứa các hợp chất đường thành acid lactic và một số sản phẩm khác Con người từ lâu đã sử dụng vi sinh vật lên men lactic để bảo quản và chế biến các loại thức ăn, đặc biệt là thức ăn có nguồn gốc từ sữa Năm 1857, L Pasteur đã chứng minh sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc... như môi trường đã lên men rút ra khỏi nồi lên men một cách liên tục với cùng một tốc độ Phương pháp này đơn giản, dễ ứng dụng vào sản xuất đối với tế bào nấm men để thu sinh khối hoặc sản phẩm là các chất chuyển hoá gắn trực tiếp với sự phát triển của tế bào - Phương pháp nhiều cấp: Vi sinh vật được nuôi ở hệ thống nồi lên men đặt làm nhiều cấp Nồi thứ nhất được dùng cho vi sinh vật phát triển tốt... Phương pháp lên men gián đoạn là cả quá trình lên men từ đầu đến cuối được thực hiện trong cùng một thiết bị; thời gian lên men khoảng 68-80 giờ ở nhịêt độ 36-37oC - Phương pháp lên men bán liên tục là giai đoạn lên men chính thực hiện liên tục và xảy ra trong nhiều thùng lên men (thường là 6 thùng) và thời gian này kéo dài 60-62giờ, giai đoạn cuối gián đoạn - Phương pháp lên men liên tục là rải đều các... pháp lên men vi sinh vật hoặc tổng hợp hoá học Đối với nguyên liệu tinh bột, trước khi lên men cần qua giai đoạn chuyển hoá tinh bột thành đường được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau, còn giai đoạn lên men và chưng cất tinh chế thì có nguyên lý giống nhau Vì vậy, tên gọi khác nhau của phương pháp lên men bằng vi sinh vật chính là tên của phương pháp chuyển hoá tinh bột Có những phương pháp lên. .. trạng thái sinh lí nhất định trong pha sinh trưởng Không thể duy trì được trạng thái này trong một thời gian dài Phương pháp nuôi gián đoạn được sử dụng trước hết cho sự lên men vô trùng,vì cách nuôi này là dễ dàng về mặt kỹ thuật Có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật được áp dụng đối với các quá trình lên men là nuôi chìm và nuôi nổi: - Phương pháp nuôi chìm: dùng cho cả vi sinh vật kị khí và hiếu ... trình lên men ứng dụng: Vi sinh vật thực nhiều trình lên men khác lên men ethylic, lên men lactic, lên men butyric… Tuy nhiên, khuôn khổ chuyên đề này, xin trình bày 18 ứng dụng hai trình lên men. .. men ứng dụng Trong phạm vi chuyên đề này, xin sâu vào trình lên men vi sinh vật ứng dụng trình lên men PHẦN II: NỘI DUNG I Khái niệm lên men: 1.1 Lên men gì? Sự lên men hiểu theo nghĩa rộng... biến vi sinh vật lên men ethylic lên men lactic 4.1 Lên men ethylic: 4.1.1 Khái niệm: Rượu ethylic số sản phẩm lên men phổ biến gặp vi sinh vật Vi sinh vật sản sinh rượu ethylic chủ yếu nấm men,