Đang tải... (xem toàn văn)
Hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính (AHPNS) là căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở tôm nuôi. Căn bệnh này có thể được phát hiện quanh năm nhất là vào mùa hè từ tháng 4 đến tháng 8 khi điều kiện khí hậu thuận lợi cho vi sinh vật phát triển. Gặp điều kiện phù hợp bệnh có thể bùng phát nhanh và phát triển thành đại dịch và gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi tôm. Các triệu chứng ban đầu của tôm bị bệnh như là: lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn. Tôm bệnh thường có xu hướng tách đàn, có thể được nhìn thấy ở mặt ao, gần bờ hay bơi lòng vòng. Tôm bị bệnh chết thường có các biểu hiện: vỏ tôm bị mềm, xuất hiện các vết thương hoại tử, ăn mòn trên vỏ và gan tụy tôm. Nguyên nhân gây bệnh AHPNS được cho là do nhóm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra.Mục đích của nghiên cứu này là phân lập và xác định vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus từ các mẫu tôm bệnh thu thập được từ các ao nuôi tôm ở một số tỉnh miền Tây Nam Bộ. Bằng việc sử dụng phương pháp sinh hoá và PCR với các đoạn mồi chuyên biệt cho nhóm V. parahaemolyticus như AP3, 16srDNA, và các gen độc tố của nó như là ToxR, tdh, tlh, trh. Kết quả của nghiên cứu này là có một chủng vi khuẩn V. Parahaemolyticus đã được phân lập và xác định, bên cạnh đó các chủng vi sinh vật khác bao gồm Vibrio spp. và staphylococcus cũng đã được phát hiện từ mẫu tôm bệnh. Kết quả nghiên cứu làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu sâu hơn về sự biểu hiện của các gen độc nhằm xây dựng và phát triển các vaccin điều trị V.parahaemolyticus trên tôm cũng như cho những nghiên cứu tiếp theo về sự đa dạng của các loài vi khuẩn Vibrio ở Việt Nam
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC GENE ĐỘC TÍNH CỦA VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH TRÊN TÔM Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HOÀNG PHƯƠNG Niên khóa: 2010 – 2014 Tháng 02 năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC GENE ĐỘC TÍNH CỦA VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH TRÊN TÔM Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS NGUYỄN BẢO QUỐC NGUYỄN HOÀNG PHƯƠNG Tháng 02 năm 2015 LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn Cha, mẹ người thân ủng hộ giúp đỡ hoàn thành khóa luận Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, tất thầy cô truyền dạy kiến thức cho suốt năm học vừa qua TS Nguyễn Bảo Quốc tận tình hướng dẫn , giúp đỡ, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian làm đề tài hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Các bạn lớp DH10SH đặc biệt thành viên phòng thí nghiệm Bệnh học người giúp đỡ, động viên, chia sẻ thời gian làm đề tài vừa qua Sinh viên thực Nguyễn Hoàng Phương TÓM TẮT Hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính (AHPNS) bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở tôm nuôi Căn bệnh phát quanh năm vào mùa hè từ tháng đến tháng điều kiện khí hậu thuận lợi cho vi sinh vật phát triển Gặp điều kiện phù hợp bệnh bùng phát nhanh phát triển thành đại dịch gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi tôm Các triệu chứng ban đầu tôm bị bệnh là: lờ đờ, ăn bỏ ăn Tôm bệnh thường có xu hướng tách đàn, nhìn thấy mặt ao, gần bờ hay bơi lòng vòng Tôm bị bệnh chết thường có biểu hiện: vỏ tôm bị mềm, xuất vết thương hoại tử, ăn mòn vỏ gan tụy tôm Nguyên nhân gây bệnh AHPNS được cho là nhóm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây Mục đích nghiên cứu phân lập xác định vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus từ mẫu tôm bệnh thu thập được từ các ao nuôi tôm ở một số tỉnh miền Tây Nam Bộ Bằng việc sử dụng phương pháp sinh hoá PCR với đoạn mồi chuyên biệt cho nhóm V parahaemolyticus AP3, 16s-rDNA, gen độc tố ToxR, tdh, tlh, trh Kết nghiên cứu có chủng vi khuẩn V Parahaemolyticus phân lập xác định, bên cạnh chủng vi sinh vật khác bao gồm Vibrio spp staphylococcus phát từ mẫu tôm bệnh Kết nghiên cứu làm sở khoa học cho việc nghiên cứu sâu biểu gen độc nhằm xây dựng phát triển vaccin điều trị V.parahaemolyticus tôm cho nghiên cứu sự đa dạng loài vi khuẩn Vibrio Việt Nam SUMMARY The acute pancreatic necrosis liver (AHPNS) has been considered as one of the most dangerous diseases in shrimp AHPNS can be detected throughout the year, particularly in the summer (April-August) when climatic conditions are favorable for microbial growth The initial symptoms of AHPNS in shrimp are not clear, but they showed lethargy, listlessness, poor appetite Then AHPNS based patients manifest with soft shelled shrimp, prawns change color, liver, pancreas limp, shrink or swell The causal agent of AHPNS disease in shrimp has been known to be the bacteria Vibrio parahaaemolyticus producing a potent toxin rapidly that can destroy tissue and liver dusfunction in the pancreatic digestive system In this study, the bacteria Vibrio parahaemolyticus was isolated from infected shrimp samples collected from various shrimp raising ponds at some provinces in the South West of Vietnam The detection of V parahaemolyticus was conducted by using biochemical methods and PCR with specific primers of AP3, 16S rDNA and tbe toxin genes such as ToxR , tdh, tlh and trh The results obtained here will be helpful for further studies involving in the expression profiles of toxic genes in vitro and in vivo to build and to develop the vaccine based treatment to V parahaemoliticus on shrimp as well as for further research on the diversity of Vibrio species in Vietnam MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC BẢNG DANH SÁCH CÁC HÌNH DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AHPNS: Acute hepatopancreatic necrosis disease EMS: Early Moratlity Syndrome PCR: Polymerase Chain Reaction KIA: Kligler Iron Agar NB: Nutrient Broth tdh: Themostable direct hemolysin trh: Themostable related hemolysin tlh: Themostable hemolysin TCBS: Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose TSA Tryptica Soy Agar Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngành nuôi tôm thương phẩm giới có từ lâu thực phát triển vào năm 1980, lần tôm giống sản xuất với số lượng lớn cung cấp cho người nuôi Ngày nay, nhiều nơi giới, ngành nuôi tôm thương phẩm gặp nhiều khó khăn các nạn dịch bệnh nguy hiểm, có tốc độ lan truyền rất nhanh như: bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh còi, bệnh xuất huyết,… bị tác nhân virus, vi khuẩn, nấm,…gây gây nhiều thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi tôm Trong đó, đối tượng gây bệnh đáng quan tâm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nguyên nhân gây bệnh chết sớm (EMS) bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPNS) Căn bệnh nguy hiểm tôm mắc bệnh bị chết lên đến 100 % vài ngày Nhiều nước giới xác nhận diện bệnh như: Australia, Ấn Độ, Indonesia, Philippines, Đài Loan, Thái Lan, có Việt Nam Căn bệnh gây giảm sút nghiêm trọng về mặt sản lượng tôm gần các nước Việt Nam, Ấn Độ, Bangladesh, Philippines Trung Quốc Tôm nhiễm bệnh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus thường có các dấu hiệu như: biếng ăn, bơi yếu, xuất vùng hoại tử vỏ mô gan Xuất phát từ thực trạng trên, đề tài “phân lập, xác định và đánh giá diện gene độc tính vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh tôm” đã được thực hiện Tòa nhà A1, Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học Môi trường - Trường ĐH Nông Lâm TP Hồ Chí Minh từ tháng 01 năm 2014 đến tháng 02 năm 2015, nhằm mục đích phân lập xác định V.parahaemolyticus làm nguồn vật liệu ban đầu cho nghiên cứu biểu gen độc cho việc xây dựng quy trình chuẩn đoán vi khuẩn tôm 1.2 Yêu cầu - Xác định diện vi khuẩn Vibrio spp tôm tiêu sinh - hóa Thiết lập quy trình PCR việc chuẩn đoán vi khuẩn V.parahaemolyticus - việc sử dụng đoạn mồi chuyên biệt AP3, 16S rDNA Xác định diện gen độc là: ToxR, tdh, tlh, trh chủng V parahaemolyticus phân lập 1.3 Nội dung thực hiện - Phân lập Vibrio spp mẫu tôm thu thập Đánh giá tiêu sinh hoá chủng vi khuẩn Vibrio spp phân lập - Định danh diện vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phương - pháp PCR Xác định diện gene gây độc vi khuẩn V.parahaemolyticus phương pháp PCR 10 4.2 Kết quả phân tích tiêu sinh hoá Căn vào đặc tính sinh hóa vi khuẩn Vibrio spp tiêu sinh hóa quy định để định danh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (Trần Linh Thước, 2007) Một số tiêu sinh hóa thực như: Nhuộm gram, thử tính di động, sinh hơi, sinh khí H2S, sử dụng đường sucrose, lên men, sử dụng muối NaCl % % Với môi trường KIA thay đổi số thành phần như: thay đường lactose đường sucrose, nồng độ muối tăng từ % lên %, môi trường KIA trở thành môi trường kiểm tra tổng hợp tiêu sinh hóa trừ tính di động Kết trình bày bảng 4.1 Bảng 4.1 Kết kiểm tra sinh hóa số chủng vi khuẩn Vibrio phân lập Chủng STT VSV 10 11 Gram P10 P12 P13 P15 P16 P18 P20 P21 P22 C6 C7 Di H2S + + động - KIA + + + + + + + + + + + K/A K/A K/A K/A K/A K/A K/A K/A K/A K/A+ K/A TCBS NaCl NaCl 3% 7% + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Vàng Vàng Ghi chú: - K/A: phần thạch nghiêng có tính kiềm, phần thạch đứng có tính acid - K/A+: sinh làm vỡ thạch Bảng 4.2 Kết thử sinh hóa số chủng vi khuẩn đối chứng Chủng VSV V.cholerae V.parahaemolyticus V harveyi Gram H2S Di động KIA TCBS - - + + + K/A K/A K/A Vàng Xanh Xanh 29 NaCl NaCl 3% 7% + + + + + + Staphylococcus Ghi chú: + NA NA K/A Vàng + + K/A: phần thạch nghiêng có tính kiềm, phần thạch đứng có tính acid NA: Chưa xác định nghiên cứu Đối chiếu với bảng 4.2 tiêu sinh hóa chủng vi khuẩn Vibrio biết, chủng vi khuẩn có khuẩn lạc màu xanh phân lập có đặc tính sinh hóa giống với chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đồng thời giống với chủng vi khuẩn Vibrio harveyi nên chưa thể kết luận xác tên dòng vi khuẩn phân lập Để kết luận xác tên dòng vi khuẩn cần tiến hành thực phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt để định danh vi khuẩn 16S-rDNA cặp mồi chuyên biệt dùng để xác định vi khuẩn V.parahaemolyticus AP3 ToxR Cặp mồi AP3 nghiên cứu phát triển để phát vi khuẩn V.parahaemolyticus mẫu tôm mắc bệnh AHPNS (Kongrueng ctv, 2014) Bên cạnh việc sử dụng 16s rDNA cho phổ biến việc định danh vi khuẩn Ngoài chủng vi khuẩn trên, với chủng vi khuẩn có khuẩn lạc màu vàng có tiêu nhuộm gram khác với chủng vi khuẩn Vibrio cholerae đối chứng nên mẫu phân tích xác định 16s rDNA Kết định danh dòng vi khuẩn có tên khoa học Staphylococcus sciuri với tỉ lệ tương đồng 100 % (Xem phần phụ lục 3) Chúng sử dụng chủng vi khuẩn để làm đối chứng âm thí nghiệm 4.3 Đánh giá phương pháp ly trích DNA tổng số vi khuẩn Để có nguồn vật liệu việc xác định diện Vibrio parahaemolyticus mẫu phân lập DNA tổng số mẫu vi khuẩn ly trích phương pháp khác trình bày phần phương pháp thí nghiệm Kết hình 4.2 cho thấy sản phẩm DNA thu từ phương pháp có khác biệt Về nồng độ DNA: phương pháp ly trích hóa chất kit cho lượng DNA cao nhiều lần so với phương pháp boiling; đó, phương pháp sử dụng kit cho nồng độ DNA cao Về độ tạp thành phần không mong muốn: phương pháp sử dụng kit cho sản phẩm DNA với độ tinh cao so với phương pháp sử dụng hóa chất phương pháp boiling Về khả PCR mẫu: sản phẩm PCR mẫu ly trích kit cho kết tốt 30 sản phẩm PCR mẫu DNA ly trích phương pháp hóa chất phương pháp boiling lại không tổng hợp Nguyên nhân mẫu DNA thu từ phương pháp tạp số chất gây ức chế trình tổng hợp mạch enzyme Taq polymerase như: với phương pháp hóa chất phenol hay chlorofom, phương pháp boiling tạp nhiều protein Thời gian ly trích: phương pháp boiling cho phép thu DNA thời gian nhanh nhất, phương pháp sử dụng kit cuối phương pháp sử dụng hóa chất Phương pháp sử dụng hóa chất nhiều công sức so với phương pháp lại Chi phí để thực phương pháp sử dụng kit cao nhất, phương pháp sử dụng hóa chất tốn chi phí phương pháp boiling Vì vậy, phương pháp sử dụng kit phương pháp thích hợp cho việc ly trích DNA Tuy chi phí cao cho kết tốt nhất, tốn công sức thời gian so với phương pháp lại 31 Hình 4.2 Kết ly trích DNA tổng số từ chủng vi khuẩn phân lập đươc 4.4 Xác định vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phương pháp PCR Hiện có nhiều phương pháp xác định diện chủng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh tôm PCR, multiplex PCR, realtime PCR, multiplex realtime PCR, kỹ thuật LAMP v.v…Dựa vào nghiên cứu trước đây, chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh AHPNS tôm phát cặp mồi AP3 (Kongrueng ctv, 2014) Các dòng vi khuẩn Vibrio spp phân lập nghiên cứu kiểm tra phương pháp PCR trước tiên với cặp mồi AP3 sau cặp mồi 16S rDNA Chủng Staphylococcus dùng làm đối chứng âm để khẳng định tính chuyên biệt Kết cho thấy mẫu vi khuẩn thể màu xanh môi trường TCBS, có mẫu P22 thể 32 kích thước sản phẩm PCR mong đợi (không thể kết quả) Kết hình 4.3 sản phẩm PCR gen AP3 với kích thước 336 bp thể chủng vi khuẩn P22 không thấy vi khuẩn Staphylococcus Kết tương đồng với kết nghiên cứu Kongrueng ctv, 2014 Vì vậy, kết luận dòng vi khuẩn P22 chủng vi khuẩn V.parahaemolyticus Hình 4.3 Kết chạy PCR với cặp mồi AP3 16S-rDNA mẫu vi khuẩn P 22 M: Marker 4.5 Xác định diện gen độc chủng Vibrio parahaemolyticus phân lập Sau xác nhận vi khuẩn V.parahaemolyticus, chủng vi khuẩn có kí 500 bp hiệu P22 sử dụng để kiểm tra diện gen độc tính Các gen bao gồm toxR, tdh, trh tlh gen tlh mã hóa độc tố hemolysin không bền nhiệt, gen tdh, trh mã hóa độc tố hemolysin bền nhiệt Cả hai loại gen tdh, trh nằm operon độc tố Vp-toxRS điều hòa gen toxR gen có trình tự bảo tồn cao loài vi khuẩn V.parahaemolyticus 33 Việc xác nhận diện gen độc tố cho phép so sánh khác biệt chủng vi khuẩn V.parahaemolyticus phân lập từ vùng khác Từ kết đó, đánh giá đa dạng loài vi khuẩn nước nước khác giới 500 bp Hình 4.4 Xác định diện gen độc tố vi khuẩn Vibrio Parahaemolyticus VP: Vibrio parahaemolyticus; SC: Staphylococcus sp.;(-): PCR đối chứng âm; M: Marker Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy có diện gen điều hòa độc tố toxR có khích thước band đích 368 bp gen mã hóa hemolysin không bền nhiệt tlh có kích thước band đích 500 bp Kết tương đồng với kết báo cáo Nguyễn Văn Duy ctv, 2012 Trong đó, sản phẩn PCR hai gen lại tdh trh xuất nhiều band tạp không thấy diện band mục tiêu Để khẳng định chắn có diện hai loại gen hay không cần tiến hành tối ưu hóa quy trình PCR để loại bỏ band không đặc hiệu tăng khả bắt cặp chuyên biệt cho hai cặp mồi Với kết chưa thể khẳng định khác biệt chủng vi khuẩn V.parahaemolyticus phân lập mẫu tôm Nha Trang theo báo cáo Nguyễn Văn Duy ctv, 2012 với chủng vi khuẩn phân lập nghiên cứu 34 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Môi trường TCBS sử dụng làm môi trường chọn lọc với chủng vi khuẩn thuộc chi Vibrio Trong nghiên cứu này, có chủng vi khuẩn có khuẩn lạc màu xanh chủng vi khuẩn có khuẩn lạc màu vàng - phân lập môi trường Có thể sử dụng cặp mồi AP3 để phát vi khuẩn V.parahaemolyticus mẫu tôm bệnh 5.2 Kiến nghị - Cần tối ưu hóa quy trình PCR để loại bỏ band tạp không mong muốn Mẫu vi khuẩn P22 cần tiếp tục xác nhận thểm cặp mồi 16s rDNA để khẳng định cặp mồi AP3 mang tính xác chuyên biệt - việc phát chủng V parahaemolyticus gây bệnh tôm Phát triển kĩ thuật realtime PCR RT-PCR để đánh giá mức độ biểu - gen độc tố vi khuẩn V parahaemolyticus Phát triển kĩ thuật LAMP với cặp mồi chuyên biệt AP3 để phát nhanh diện loài vi khuẩn mẫu tôm bệnh TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước 35 Bùi Quang Tề, (1996) Bệnh tôm cá giải pháp phòng trị Tạp chí thuỷ sản số 4/1996 Đỗ Thị Hoà, (1994) Nghiên cứu số bệnh tác nhân vi khuẩn, nấm nguyên sinh, động vật giun tròn Đỗ Thị Hoà, (1996) Nghiên cứu số bệnh chủ yếu tôm sú (Penaeus monodon) nuôi khu vực Nam Trung Bộ Luận văn P.TS khoa học nông nghiệp Đỗ thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Huy Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004) Bệnh học thủy sản NXB Nông Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Kiều Ngọc Hà, (2013) Tình hình dịch bệnh tôm nuôi năm 2013 Lê Hằng, Nguyễn Thị Bích, (2012) Báo cáo ngành nuôi tôm Việt Nam năm 2012 xu hướng năm 2013 Hà Nội Nguyễn Văn Duy, Nguyễn Thị Cẩm Ly (2012) Phân lập và xác định gene độc tố của Vibrio.Parahaemolyticus hải sản tươi sống ở Nha Trang Trần Linh Thước, (2007) Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm NXB Giáo dục Tài liệu nước ngoài 36 Bej, A K et al., (1999) Detection of total and hemolysin - producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amlification of tlh, tdh and trh J.Microbiol Methods 36, 215 Phillips, B (2013) Lobsters: Biology,Management,Aquaculture and Fisheries Fisher, S G, (1977) Organic matter processing by a stream-segment ecosysterm: Fort River, Massachusetts, USA.701-727 Fisher, W S (2009) Shell disease of lobster In:C.J.Sindermann, editor Disease diagnosis and control in North Americanaquaculture Developments in aquaculture and fisheries science Vol.6 Amsterdam:Elsevier 158-167 Honda, T., and Iida, T (1993) The pathogenicity of Vibrio parahaemolyticus and the role of the thermostable direct haemolysin and related haemolysins Reviews in Medical Microbiology Kongrueng, J., Yingkajom, M., Bunpa, S., Sermwittayawong, N., Singkhamanan, K., and Vuddhakul, V (2014) Characterization of Vibrio parahaemolyticus causing acute hepatopancreatic necrosis disease in Southern Thailand J Fish Dis.doi:10.1111/jfd.12308 Kim, YB, Okuda, J., Matsumoto, C., Takahashi, N., Hashimoto, S and Nishibuchi, M (1999) Identification of Vibrio parahaemolyticus strains at the species level by PCR targeted to the toxR gene J Clin Microbiol 37: 1173–1177 Lavilla-Pitogo, C R., Baticados, C L., Cruz-Lacierda, E R and de la Pena, L (1990) Occurrence of luminous bacteria disease of Penaeus monodon larvae in the Philippines Aquaculture 91: 1-13 Lightner D V., Redman R M., Pantoja C R., Noble B L., and Tran L H (2012), Early mortality syndrome affects shrimp in Asia in Glob Aquacult Advocate 37 10 Luan, X Y., Chen, J X., Zhang, X H., Jia, J T., Sun, F.R., and Li, Y (2007) Comparison of different primers for rapid detection of Vibrioparahaemolyticususing the polymerase chain reaction Lett Appl Microbiol, 44(3): 242-7 11 Motarjemi, Y., and Adams, M., (2006), Emerging Foodborne Pathogens 12 Nordstrom, J.L., Vickery, M.C., Blackstone, G.M., Murray, S.L., and DePaola, A (2007) Development of a Multiplex Real-Time PCR Assay with an Internal Amplification Control for the Detection of Total and Pathogenic Vibrio parahaemolyticus Bacteria in Oysters.Appl Environ Microbiol 73(18): 5840-7 38 Tài liệu web http://xetnghiemdakhoa.com/diendan/printthread.php?tid=522 (http://www.nihe.org.vn/new-vn/dao-tao-ngan-han tap-huan- 412312272/511/Dac-tinh-mot-so-moi-truong-phan-lap-va-chan-doan-vi-khuangay-benh.vhtm http://tailieu.vn/doc/benh-do-vi-khuan-vibrio-o-dong-vat-thuy-san-vibrio-spp1495638.html) http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-tim-hieu-ve-vibrio-sp-gay-benh-tren-thuy-san-11372/ 39 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần hóa chất loại môi trường - - Thành phần hóa chất cho 1l môi trường TSA o Tryptone o Soytone – enzyme tiêu hóa từ bột đậu nành o NaCl o Agar Thành phần môi trường TCBS: o Pepton o Cao men o Natri citrat o Natri thiosulfat o Mật bò khô o Natri clorid o Natri cholat o Feric citrat o Saccharose o Dung dịch xanh thymol 1% o Dung dịch xanh bromothymol 0,2% o Thạch sợi o Nước cất vừa đủ 15g 5g 7g 15g 10g 5g 10g 10g 5g 10g 3g 1g 20g ml 20 ml 15g 1000 ml Yêu cấu: Môi trường có màu xanh, đĩa thạch mịn, nước, độ dày vừa phải - - - Thành phần môi trường Nutrient Gelatin (CDC): o Infusion Broth o Gelatin o Nước cất 25g 120g 1000 ml Thành phần hoá chất cho 1l môi trường tăng sinh Nutrient Broth (NB): o Peptone 5g o Meat extract 3g o NaCl 7g o Nước cất 1000 ml o pH 7,0 Thành phần môi trường KIA (Kligler Iron Agar): o Peptone 20g o Sucrose 20g 40 Dextrose NaCl Ferric ammonium citrate Sodium thiosunfate Agar Phenol Red Nước cất Thành phần môi trường thạch lỏng: o Agar o Nước cất o o o o o o o - 1g 7g 0,5g 0,5g 15g 0,025g 1000ml 5–8g 1000ml Phụ lục 2: Thành phần hóa chất cho phản ứng sinh học phân tử Thành phần hóa chất STE Buffer (pH = 8,0): NaCl 100mM Tris/HCl 10mM EDTA 1mM Thành phần hóa chất TE Buffer(pH = 8,0): o Tris/HCl 10mM o EDTA 1mM o o o o - Phụ lục Kết giải trình tự định danh vi khuẩn Mẫu vi khuẩn C6 Mẫu vi khuẩn C7 41 16S-F: Vibrio parahaemolyticus 42 43 [...]... không sinh H2S Phân loại Vibrio Bộ: Eubacteriales Họ: Vibrionaceae Giống: Vibrio Loài: V.alginolyticus; V .parahaemolyticus; V.anguillarum; V.harveyi; V salmonicida; V.splendidus 2.2 Lịch sử phát hiện và sự phân bố của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Bệnh do vi khuẩn Vibrio (Vibriosis) đã được phát hiện từ rất sớm trên các động vật thủy sản thuộc họ giáp xác Cho đến nay bệnh Vibriosis đã được... tên của các dòng vi khuẩn phân lập được Để có thể kết luận chính xác tên của các dòng vi khuẩn này cần tiến hành thực hiện các phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt để định danh vi khuẩn như 16S-rDNA hoặc các cặp mồi chuyên biệt dùng để xác định vi khuẩn V .parahaemolyticus như là AP3 hay là ToxR Cặp mồi AP3 đã được nghiên cứu và phát triển để phát hiện vi khuẩn V .parahaemolyticus trên các mẫu tôm mắc bệnh. .. chủng vi khuẩn V .parahaemolyticus Hình 4.3 Kết quả chạy PCR với cặp mồi AP3 và 16S-rDNA trên mẫu vi khuẩn P 22 M: Marker 4.5 Xác định sự hiện diện của các gen độc trong chủng Vibrio parahaemolyticus phân lập được Sau khi được xác nhận là vi khuẩn V .parahaemolyticus, chủng vi khuẩn có kí 500 bp hiệu là P22 được sử dụng để kiểm tra sự hiện diện của các gen độc tính Các gen này bao gồm toxR, tdh, trh và. .. nghiêng có tính kiềm, phần thạch đứng có tính acid NA: Chưa được xác định trong nghiên cứu này Đối chiếu với bảng 4.2 về các chỉ tiêu sinh hóa của các chủng vi khuẩn Vibrio đã biết, 9 chủng vi khuẩn có khuẩn lạc màu xanh đã phân lập được có các đặc tính sinh hóa giống với chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhưng đồng thời cũng giống với chủng vi khuẩn Vibrio harveyi nên chưa thể kết luận chính xác được... hiện các chủng V parahaemolyticus gây bệnh trên tôm Phát triển các kĩ thuật realtime PCR hoặc RT-PCR để đánh giá mức độ biểu - hiện trên các gen độc tố của vi khuẩn V parahaemolyticus Phát triển các kĩ thuật LAMP với cặp mồi chuyên biệt là AP3 để phát hiện nhanh sự hiện diện của loài vi khuẩn này trên mẫu tôm bệnh TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nước 35 1 Bùi Quang Tề, (1996) Bệnh tôm cá và giải... 10 chủng vi khuẩn cho khuẩn lạc màu xanh là các chủng được kí hiệu: P10, P12, P13, P15, P16, P17, P18, P20, P21, P22 và 2 chủng vi khuẩn 27 cho khuẩn lạc màu vàng là còn khả năng mọc lại trên môi trường nuôi cấy sau khi cấy truyền từ các ống mẫu đông sâu Các chủng vi khuẩn này có thể là Vibrio paraheamolyticus, Vibrio harveyi Vibrio cholera v.v Để có thể biết chính xác tên của các chủng vi khuẩn này... tiến hành thử các phản ứng sinh hóa và PCR mới có thể biết được h 4.1 Hình ảnh các khuẩn lạc trên môi trường TCBS 28 Hìn 4.2 Kết quả phân tích các chỉ tiêu sinh hoá Căn cứ vào các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Vibrio spp và các chỉ tiêu sinh hóa quy định để định danh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (Trần Linh Thước, 2007) Một số chỉ tiêu sinh hóa đã được thực hiện như: Nhuộm gram, thử tính di động,... phát hiện trên các mẫu tôm bệnh Tại Vi t Nam, 2 loài vi khuẩn thuộc giống này đã được - phân lập là V.alginolyticus và V .parahaemolyticus Ký chủ: Hầu hết các loài động vật thủy sản nước lợ, mặn đều có thể mang và bị ảnh hưởng của bệnh Vibriosis như: các loài tôm he (Penaeus spp.) và tôm thẻ 12 (Metapenaeus spp.), các loài tôm hùm châu Mỹ (Homarus spp.) và tôm hùm châu Á - (Panulirus spp.), các loài... công sức và thời gian so với 2 phương pháp còn lại 31 Hình 4.2 Kết quả ly trích DNA tổng số từ các chủng vi khuẩn phân lập đươc 4.4 Xác định vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp PCR Hiện nay có rất nhiều phương pháp xác định sự hiện diện của các chủng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm như PCR, multiplex PCR, realtime PCR, multiplex realtime PCR, kỹ thuật LAMP v.v…Dựa vào một nghiên... trên tôm nuôi (Lightner và ctv, 2012) Bệnh này xảy ra và phát triển thành dịch phụ thuộc vào nhiều điều kiện khác nhau: tôm bị bệnh truyền nhiễm hoặc các bệnh về dinh dưỡng, tôm bị thương hoặc điều kiện môi trường khắc nghiệt Vi c phân lập Vibrio parahaemolyticus từ mẫu tôm bệnh không khó nhưng xác định được vai trò của chúng trong một bệnh là điều không đơn giản và vi c gây bệnh thực nghiệm khó thành ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC GENE ĐỘC TÍNH CỦA VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus. .. chủng V parahaemolyticus phân lập 1.3 Nội dung thực hiện - Phân lập Vibrio spp mẫu tôm thu thập Đánh giá tiêu sinh hoá chủng vi khuẩn Vibrio spp phân lập - Định danh diện vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. .. pháp PCR Xác định diện gene gây độc vi khuẩn V .parahaemolyticus phương pháp PCR 10 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm về giống Vibrio Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae loài vi khuẩn