-1- MỞ ĐẦU Pectic oligosaccharide (POS) prebiotic hệ nghiên cứu thời gian gần POS hợp chất cacbonhydrate, bao gồm từ – 10 đơn phân D - galacturonic acid nối với liên kết α (1-4) glucoside có nhiều đặc tính quý Là oligosaccharide acid galacturonic nên POS mang tính acid tương tự số oligosaccharide sữa mẹ, chúng có khả gắn với tác nhân gây bệnh, ngăn chặn kết dính chúng vào bề mặt biểu mô ruột hiệu loại oligosaccharide trung tính Bên cạnh đó, POS lên men chọn lọc vi sinh vật có lợi đường ruột sản phẩm lên men có ảnh hưởng tích cực sức khỏe vật chủ, tham gia vào trình điều hòa trao đổi lipid, glucose, làm giảm cholesterol máu, chống ung thư, điều biến miễn dịch, chống béo phì, có tính kháng khuẩn chống oxi hóa… Với hoạt tính sinh học có lợi vậy, POS ứng dụng bổ sung vào thực phẩm chức thức ăn chăn nuôi Hiện POS thu nhận việc thủy phân giới hạn pectin nhờ phức hệ pectinase endopolygalacturonase đóng vai trò quan trọng Tuy nhiên nay, chưa có công trình nước công bố công nghệ thủy phân pectin tạo POS nhờ kỹ thuật thủy phân giới hạn enzyme Từ mối quan tâm trên, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu thu nhận pectic oligosaccharide (POS) từ pectin vỏ chanh leo endopolygalacturonase”  Mục tiêu nghiên cứu - Thu nhận nguồn endopolygalacturonase (EPG) - Xây dựng quy trình thu nhận POS từ pectin vỏ chanh leo phương pháp thủy phân giới hạn nhờ endopolygalacturonase - Nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học ứng dụng chế phẩm POS thu sản xuất thực phẩm chức  Nội dung nghiên cứu Để đạt mục tiêu đề ra, luận án gồm nội dung sau đây: - Nghiên cứu thu nhận nguồn endopolygalacturonase -2- + Phân lập tuyển chọn chủng A niger sinh tổng hợp EPG cao + Cải tạo chủng tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp EPG + Thu nhận, tinh xác định đặc tính enzyme chủng cải tạo - Xây dựng quy trình thu nhận POS từ pectin vỏ chanh leo + Nghiên cứu thu nhận pectin từ vỏ chanh leo + Nghiên cứu điều kiện thủy phân giới hạn pectin tạo POS + Tách, tinh bảo quản chế phẩm POS - Nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học ứng dụng chế phẩm POS thu sản xuất thực phẩm chức + Đánh giá hoạt tính sinh học + Đánh giá tiêu chất lượng, an toàn vệ sinh thực phẩm + Ứng dụng POS sản xuất bánh chức  Những đóng góp luận án – Tạo chủng Aspergillus niger UV06-12-23 có khả sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao góp phần làm phong phú thêm nguồn chủng giống pectinase - Là công trình Việt Nam nghiên cứu cách có hệ thống trình thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo enzyme thu nhận pectic oligosaccharide (POS) chứng minh khả tăng sinh vi khuẩn có lợi, giảm vi khuẩn có hại, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm chế phẩm POS thu được, góp phần làm phong phú thêm nguồn prebiotic cho Việt Nam Bố cục luận án Luận án trình bày 127 trang: mở đầu (3 trang), tổng quan tài liệu (28 trang), vật liệu phương pháp nghiên cứu (16 trang), kết thảo luận (63 trang với 32 bảng 37 hình), kết luận kiến nghị (2 trang), danh mục công trình công bố (1 trang) tài liệu tham khảo (13 trang với tài liệu tiếng Việt 135 tài liệu tiếng Anh) TỔNG QUAN Tổng quan vấn đề nghiên cứu luận án trình bày chi tiết phần: hoạt tính sinh học POS, chất pectin, enzyme endopolygalacturonase, yếu tố ảnh hưởng tới trình thủy phân pectin tạo POS, phương pháp thu hồi tinh POS, phương pháp định tính, định lượng đánh giá hoạt tính sinh học POS -3- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vậ  ủng n ậ A niger CĐN4, BK01, PDG, LN; 26 chủng A niger CNTP 5002 – 5055; Lactobacillus rhamnosus GG (L1), L amylovorus DSM16698 (L2), L acidophilus NCFM (L3), L reuteri DSM 17938 (L4), L casei Shirota (L5), L bulgaricus CH-3 (L6), L fermentum PCC (L7), L plantarum 299V (L8), L johnsonii La1 (L9), Bifidobacterium lactis Bb12 (Bif), Escherichia coli 0157:H7, Salmonella enterica subsp enterica serotype Typhi ATCC 19430 (S typhi) Staphylococcus aureus ATCC 25923 từ sưu tập giống Bộ môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học Phân tử, Đại học Bách Khoa Hà Nội  Vỏ chanh leo từ sở chế biến chanh leo địa bàn Hà Nội  Pectinex Utra-SPL (Novozymes – Đan Mạch) 2.2 P 2.2.1 P ậ c ủ sinh endopolygalacturonase cao Phân lập chủng A niger môi trường Czapeck sàng lọc môi trường Czapeck-pectin theo Hannan A cs (2009) Chọn chủng cho giá trị hoạt độ endopolygalacturonase cao 2.2.2 Cải tạo chủng A niger sinh tổng hợp EPG cao Bào tử chủng A niger CNTP5037 chiếu UV trang môi trường Czapeck + 1% pectin + 0,1% triton X-100, nuôi tủ ấm 30oC, ngày (theo Vu V.H cs (2009)) Tiếp tuyển chọn chủng thu dựa khả sinh tổng hợp EPG cao ổn định 2.2.3 Khảo sát, tố óa đ c sinh ổ ợ EPG cao Nghiên cứu thực môi trường lên men rắn (cám gạo 70%, trấu 20%, dịch khoáng Czapeck ml) bình tam giác 250 ml với hàm lượng pectin (8, 10, 12, 14, 16 % (w/w)), độ dày môi trường (9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 mm), độ ẩm môi trường (50, 60, 70, 80%), nhiệt độ (25, 30, 35, 40oC) thời gian lên men (1, 2, 3, 4, 5, ngày) theo Akhter N cs (2011) Tối ưu hóa trình sinh tổng hợp EPG theo phương pháp bề mặt đáp ứng quy hoạch Box-Benken, sử dụng phần mềm Design-Expert 7.15 Ma trận thực nghiệm bao gồm 17 thí nghiệm với khoảng chạy -4- yếu tố khảo sát nhiệt độ (25 – 35oC), độ ẩm (50 – 70%), hàm lượng pectin (10 – 14%) 2.2.4 cđ đ e d a ac ae Phản ứng enzyme thực với 1ml dung dịch pectin 3% 250µl dung dịch enzyme 50⁰C Độ giảm độ nhớt dung dịch thủy phân pectin xác định với nhớt kế Elcometer, tốc độ quay 200 vòng/phút, trục L2 30 phút Một đơn vị endopolygalacturonase lượng enzyme cần thiết làm giảm 50% độ nhớt dung dịch 30 phút 50oC pH 4,5 theo Hendges D.H cs (2011) 2.2.5 Tinh endopolygalacturonase Dịch enzyme chiết từ môi trường rắn nuôi cấy A niger UV0612-23 đệm pH 4,5 (tỷ lệ 7:1) kết tủa (NH4)2SO4 (40 - 80%), ethanol lạnh (0oC) (50 - 80%) lọc dòng ngang với màng 10 kDa Tiếp theo EPG tinh sắc ký trao đổi ion hệ thống FPLC với cột QFF đệm đẩy gradient NaCl 1M nồng độ – 500 mM, tốc độ dòng ml/phút theo Buga M.L cs (2010) 2.2.6 ả đ c e d a ac ae EPG tinh xác định nhiệt độ tối ưu độ bền nhiệt độ (30 70oC); pH tối ưu độ bền pH (3,0 - 7,0) thời gian – giờ; ảnh hưởng ion kim loại (nồng độ 10 mM), thông số Km Vmax 2.2.7 P ec vỏ chanh leo Thu pectin từ vỏ chanh leo acid citric pH – 6, nhiệt độ 20 120oC - 15 phút thu dịch lọc, bỏ bã Cô đặc dịch lọc 10 lần 50C, kết tủa pectin ethanol lạnh (0oC) theo tỷ lệ ethanol: dịch lọc 1: 1, 2: 1, 3:1 Lọc thu tủa, sấy 50C bảo quản pectin Pectin xác định hàm lượng theo phương pháp canxi pectat số este hóa theo Pinheiro E.R cs (2008) 2.2.8 c đ nh đ u ki n tố óa trình ủ ới hạn pectin tạo POS Pectin hòa tan đệm với nồng độ pectin thay đổi theo thí nghiệm (1 – 5% (w v)) Sau bổ sung enzyme với tỷ lệ enzyme chất 30 - 50U/g, pH - 5, nhiệt độ 40 - 60oC, tốc độ khuấy 200 - 350 vòng phút thời gian từ - theo Gomez B cs -5- (2014) Xác định hàm lượng POS phổ oligosaccharide tạo thành sắc ký lớp mỏng Tối ưu hóa trình thủy phân thực với ma trận thực nghiệm bao gồm 17 thí nghiệm với khoảng chạy yếu tố khảo sát nhiệt độ (45 – 55oC), tỷ lệ enzyme chất (30 –50 U/g), tốc độ khuấy (200 – 300 vòng/phút) 2.2.9 P ạch POS Dịch POS sau thủy phân ly tâm 6.000 vòng/phút 10 phút sau lọc cut-off với màng 10kDa, kDa Tiếp theo tinh phương pháp sắc ký lọc gel Toyopearl GigaCap Q-650M cột có kích thước 50x1 cm Chạy ml dung dịch POS lên cột, rửa chiết thu phân đoạn 1,5 ml Xác định hàm lượng, thành phần POS phân đoạn hiệu suất thu hồi POS (%) 2.2.10 cđ c P Cấy 1% (v/v - 3x10 cfu/ml) chủng thử nghiệm môi trường MR bổ sung 1% glucose (w/v) 1% POS (w/v), nuôi 37oC Cấy trang mẫu canh trường thời điểm ban đầu sau 24 vào môi trường thạch đĩa để đếm số lượng khuẩn lạc (môi trường đặc hiệu VRBL, BSA, TSA, MRS tương ứng cho E coli, S typhi, S aureus L acidophilus) Xác định điểm hoạt tính prebiotic (PAS) POS dựa số lượng khuẩn lạc ban đầu sau 24 theo Huebner J cs (2007) 2.2.11 cđ àm ợng pectic oligosaccharide Hàm lượng POS xác định dựa thủy phân hoàn toàn POS acid H2SO4 đường khử giải phóng (galacturonic acid) xác định theo Kit D-Galacturonic (Megazym, Ireland) 2.2.12 cđ àm ợng pectic oligosaccharide HPAEC Dịch POS bơm 20µl vào cột carbopac PA1 hệ thống Dionex với dung dịch chuẩn mono, di trigalacturonic Sigma với nồng độ mg/ml theo Combo A.M.M cs (2012) 2.2.13 Chế đ s y phun tạo chế phẩm POS b t Dịch POS phối trộn với maltodextrin đến hàm lượng chất khô 10, 12, 14, 16% sấy chế độ 1: nhiệt độ đầu vào 200oC, tốc độ tiếp liệu lít/giờ; chế độ 2: nhiệt độ đầu vào 170oC, tốc độ tiếp liệu 2,5 lít/giờ; chế -6- độ 3: nhiệt độ đầu vào 150oC, tốc độ tiếp liệu lít/giờ Sản phẩm bột đánh giá cảm quan hiệu suất thu hồi (%) 2.2.14 Thử nghi m đ c tính c p pectic oligosaccharide Thử nghiệm tiến hành Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương, 50 chuột nhắt trắng giống Swiss cân nặng 18 – 22 g với liều 20 – 60g POS/kg chuột 2.2.15 Thử nghi m sản xu t bánh quy xốp bổ sung POS Tiến hành sản xuất bánh quy xốp bổ sung POS – 3% (w/w) đánh giá cảm quan theo TCVN 3215-79 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu thu nhận endopolygalacturonase 3.1.1 Phân lập, tuyển ch n A niger sinh tổng hợp EPG cao Từ số nguồn vỏ giàu pectin phân lập 40 chủng nấm sợi môi trường Czapeck Trong có 16 chủng có khả phát triển môi trường chứa pectin chủng có đường kính khuẩn lạc >3 cm Các chủng mang đặc điểm hình thái tương tự A niger Tiếp sàng lọc chủng nấm mốc phân lập 30 chủng A niger thu nhận từ sưu tập giống theo phương pháp đo bán kính vòng thủy phân cho thấy có 19/37 chủng cho giá trị (D - d) ≥ 4mm chủng có hoạt độ polygalacturonase >13 U/g Xác định khả sinh tổng hợp EPG chủng (bảng 3.4) cho thấy có A niger CNTP 5037 sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao đạt 22,94 U/g sau ngày nuôi cấy Do vậy, lựa chọn A niger CNTP 5037 cho nghiên cứu Bảng 3.4 Hoạt độ EPG chủng nấm mốc thử nghiệm Hoạt độ EPG TT (U/g) 22,94 Chủng Hoạt độ EPG (U/g) 20,79 TT Chủng CNTP 5037 CNTP 5004 18,61 CNTP 5002 16,88 CNTP 5007 17,30 CNTP 5020 16,45 CF 21,09 C2 -7- 3.1.2 Cải tạo chủng A niger CNTP5037 sinh tổng hợp EPG cao 3.1.2.1 Lựa chọn thời gian chiếu UV Bào tử A niger CNTP 5037 chiếu UV với thời gian – 80 phút Kết cho thấy với thời gian chiếu UV 80 phút toàn bào tử bị tiêu diệt thời gian chiếu 70 phút cho tỷ lệ sống 0,2% Theo Zambare V cs (2010) tỷ lệ sống 0,01% thích hợp cho chọn lựa thời gian gây đột biến vi sinh vật bị đột biến nhiều lần nhiều điểm dẫn tới tăng cường khả sinh tổng hợp hoạt chất mong muốn nuôi cấy Do đó, thời gian chiếu xạ 75 phút với tỉ lệ sống 0,02% lựa chọn cho trình cải tạo chủng A niger CNTP 5037 UV 3.1.2.2 Sàng lọc dòng xử lý UV sinh endopolygalacturonase cao Qua 10 lần chiếu UV thu 458 dòng có khả sống sót môi trường Czapeck-pectin Trong số có 20 dòng có D d cao (1,76 – 3,6 lần) so với chủng gốc (bảng 3.6) Sàng lọc khả sinh tổng hợp EPG 20 dòng cho thấy có dòng sinh tổng hợp EPG cao (164,60 – 193,19%) so với dòng gốc (bao gồm: A niger UV06, UV07, UV11, UV19) Đặc biệt có A niger UV06 ổn định qua lần cấy truyền, lựa chọn A niger UV06 cho nghiên cứu Bảng 3.6 Khả tổng hợp EPG dòng đột biến Hoạt độ Hiệu suất so Ký hiệu Hoạt độ EPG với chủng gốc dòng EPG (%) (U/g) (U/g) CNTP 5037 22,94 100,00 UV11 44,32 UV01 29,41 128,00 UV12 27,89 UV02 34,11 148,69 UV13 34,12 UV03 29,64 129,20 UV14 33,24 UV04 31,76 138,44 UV15 29,78 UV05 29,47 128,46 UV16 26,78 UV17 31,34 UV06 39,59 172,58 UV18 23,78 UV07 38,68 168,61 UV08 23,47 102,03 UV19 37,78 UV09 32,45 141,51 UV20 36,24 UV10 30,46 132,70 Ký hiệu dòng Hiệu suất so với chủng gốc (%) 193,19 121,51 148,73 144,89 129,31 116,73 136,60 103,66 164,60 157,94 -8- 3.1.2.3 Cải tạo chủng chiếu UV nhiều lần Tiến hành đột biến dòng A niger UV06 nhiều lần tia UV Kết thu biểu diễn bảng 3.8 cho thấy A niger UV06-12-23 có khả sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao gấp 2,8 lần so với dòng gốc (60,82 U g môi trường) ổn định qua 15 lần cấy truyền giữ 95% hoạt độ so với hệ Bảng 3.8 Khả sinh tổng hợp EPG dòng xử lý UV nhiều lần qua lần cấy truyền Số lần Hoạt độ endopolygalacturonase (U/g) chiếu Tên dòng Số lần cấy truyền (lần) UV A niger UV06-12 45,19 45,41 44,01 44,76 44,84 A niger UV06-13 48,68 42,47 40,15 36,51 31,14 A niger UV06-14 54,32 40,01 32,94 18,16 6,09 A niger UV06-15 47,78 32,13 26,62 15,18 5,58 A niger UV06-12-21 64,06 60,21 54,38 52,22 50,37 A niger UV06-12-22 57,43 47,12 35,92 25,18 14,25 A niger UV06-12-23 60,82 59,22 59,85 58,02 58,15 3.1.3 Thu nhận đ c tính EPG từ A niger UV06-12-23 3.1.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp EPG Từ kết khảo sát (hình 3.3 – 3.7) cho thấy khoảng hoạt động tương ứng thông số khảo sát để thu hoạt độ endopolygalacturonase cao nuôi cấy môi trường rắn bao gồm: 10 – 14% pectin, độ ẩm 50 – 70% nhiệt độ 25 – 35oC Hoạt độ EPG thu cao độ dày môi trường 17 mm sau 72 lên men 3.1.3.2 Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp EPG từ A niger UV06-12-23 Dựa sở khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến trình sinh tổng hợp EPG, tiến hành xác định ảnh hưởng đồng thời độ ẩm (X1), hàm lượng pectin (X2) nhiệt độ (X3) Kết thể bảng 3.10 Phương trình hồi quy biểu hoạt độ EPG mô tả ảnh hưởng yếu tố độc lập mối tương tác chúng biểu diễn sau: Hoạt độ EPG = +72,02 + 4,53X1 + 1,55X2 + 2,61X3 + 3,40X1X2 – 2,00X1X3 + 3,13X2X3 – 6,91X12 – 7,04 X22 – 2,53X32 -9- Từ kết dựa vào phương pháp tối ưu hóa tìm điều kiện lên men tối ưu là: độ ẩm 64%, hàm lượng pectin 12,5% nhiệt độ 31oC Khi đó, hoạt độ EPG đạt 73,4 U/g 3.3 3.6 3.4 3.5 3.7 Hình 3.3 – 3.7 Ảnh hưởng hàm lượng pectin (3.3), độ dày môi trường (3.4), độ ẩm (3.5), nhiệt độ (3.6) thời gian (3.7) đến sinh tổng hợp EPG A niger UV06-12-23 Bảng 3.10 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố hoạt độ EPG thu điều kiện nuôi cấy khác Độ Hàm Nhiệt Hoạt độ Độ Hàm Nhiệt Hoạt độ TN ẩm lượng độ EPG TN ẩm lượng độ EPG o o (%) pectin (%) ( C) (U/g) (%) pectin (%) ( C) (U/g) 50 10 30 14 25 54,42 10 60 58,64 70 10 30 58,28 11 60 10 35 60,02 14 35 69,03 50 14 30 51,05 12 60 70 14 30 68,53 13 60 12 30 70,05 50 12 30 53,71 14 60 12 30 72,21 70 12 25 12 30 65,17 15 60 73,17 50 12 35 12 30 64,00 16 60 71,38 70 12 35 67,45 17 60 12 30 73,29 60 10 25 62,13 - 10 - 3.1.3.3 Tách tinh EPG từ chủng xử lý UV Tinh EPG từ A niger UV06-12-23 (NH4)2SO4 85% độ bão hòa, ethanol 70% (0oC) lọc dòng ngang màng 10 kDa cho thấy hiệu suất thu hồi enzyme kĩ thuật lọc cao hẳn so với kết tủa amonium sulfate bão hòa ethanol (hiệu suất 83,9%; 67,7% 73,2%) EPG sau lọc tinh tiếp sắc ký trao đổi ion kết thu chế phẩm EPG qua cột QFF có đỉnh băng đậm (hình 3.10-11) với hoạt độ riêng 794,4 U/mgPr với độ tinh 6,38 lần so với EPG dịch thô hiệu suất thu hồi đạt 38,8% (bảng 3.13) Bảng 3.13 Các bước tinh EPG từ A niger UV06-23 TT Các bước tinh Thể Lượng Hoạt Hoạt độ Mức Hiệu tích protein độ riêng độ tinh suất thu (ml) tổng số tổng (U/mgPr) hồi (%) (mg) (U) (lần) Enzyme thô 1000 87,9 10950 124,6 1,00 100 Sau lọc cut-off 100 37,75 9187 243,4 1,95 83,9 Qua cột QFF 5,35 4250 794,4 6,38 38,8 3.10 3.11 M Hình 3.10 – 3.11 Sắc ký đồ tinh EPG cột QFF hệ thống FPLC (3.10) điện di SDS-PAGE protein EPG (3.11) M: marker protein (Fermentas), 1: dịch enzyme thô, 2: dịch enzyme sau lọc cut-off 10 kDa, 3: dịch enzyme sau cột QFF 3.1.3.4 Đặc tính endopolygalacturonase từ chủng xử lý UV Nghiên cứu đặc tính cho thấy EPG bền vùng pH – 5, nhiệt độ 30 - 50ºC pHopt 4,5, topt 50oC Ở nồng độ 10mM, enzyme hoạt động mạnh 114,2% Ca2+, không bị ảnh hưởng Na+, K+, bị ức chế - 11 - Cu2+, Fe2+, Mn2+, Mg2+ Xác định thông số động học cho kết Km = 4,94 (mg/ml), Vmax = 1,46 (µmol/phút) 3.2 Sản xu t pectic oligosaccharide (POS) từ pectin vỏ chanh leo 3.2.1 Thu nhận chuyển hóa pectin Qua trình khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến thu hồi pectin acid citric thử nghiệm quy mô 100kg vỏ chanh leo, luận án xây dựng quy trình thu nhận pectin từ vỏ chanh leo cho sản xuất POS hình 3.18 Xử lí nguyên li u Chiết pectin (cắt, chần acid citric 3%, nghiền) (pH 2, 100oC, 10 phút) S y Kết tủa Thu d c , C đ c (nhiệt độ 50oC) (ethanol lạnh 0oC, tỷ lệ 3:1) (50oC, cô chân không tới 20oBx) Vỏ chanh leo Đó ó , bảo quản PECTIN Hình 3.18 Sơ đồ quy trình thu nhận pectin từ vỏ chanh leo Pectin thu nhận theo quy trình đánh giá thành phần chất lượng Kết biểu diễn bảng 3.15 Bảng 3.15 Thành phần pectin tách chiết từ chanh leo Thành phần hóa h c Hàm ợng Pectin (%) 95 DE pectin (%) 70 (Chanh tím) - HMP 38 (Chanh vàng) - LMP Độ ẩm (%) 5,47 Hàm lượng tinh bột (%) 0,5 Hàm lượng protein (%) Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g) 6×10 Coliform (MPN/g) 10 S aureus (CFU/g) Hiệu suất thu nhận pectin (%) 2,8 - 12 - Pectin từ vỏ chanh leo tím thuộc dạng HM pectin (pectin có mức độ methyl hóa cao) Trong endopolygalacturonase hoạt động phân cắt hiệu LM pectin để tạo POS Cùng với nguồn vỏ chanh leo từ sở sản xuất Việt Nam chủ yếu chanh leo tím Do vậy, để ứng dụng pectin từ vỏ chanh leo tím vào sản xuất POS cần nghiên cứu chuyển hóa HM pectin thành LM pectin Kết nghiên cứu cho thấy trình chuyển hóa thực nồng độ pectin 2% (w/v) HCl 1% (v/v) với tốc độ khuấy 50 vòng/phút, 70oC - Pectin thu có hàm lượng 86 - 89% với DE 34 – 47 3.2.2 Đi u ki n thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo tạo POS Để chủ động nguồn enzyme nghiên cứu endopolygalacturonase thương mại (Pectinex Ultra SP-L) sử dụng để nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận POS từ pectin vỏ chanh leo sau ứng dụng quy trình enzyme nghiên cứu (endopolygalacturonase từ A niger UV06-12-23) để sản xuất POS 3.2.2.1 Lựa chọn nồng độ pectin Thủy phân pectin nồng độ - 5% (w/v) Kết thu biểu diễn hình 3.20 cho thấy nồng độ pectin 3% (w/v) tốc độ phản ứng trì ổn định khoảng giờ, hàm lượng POS ngày tăng lên Do vậy, nồng độ chất 3% lựa chọn A A B G1 G2 G3 M Hình 3.20 Ảnh hưởng nồng độ pectin đến hàm lượng (A) thành phần POS (B) dịch thủy phân pectin chanh leo M: oligosaccharide chuẩn; B: giếng 1-5 với nồng độ chất 1, 2, 3, 4, 5% 3.2.2.2 Tỷ lệ enzyme/cơ chất thích hợp Thủy phân pectin vỏ chanh leo 3% tỷ lệ enzyme chất 20 60 U/g pectin Kết cho thấy tỷ lệ 40 U/g phổ sản phẩm chứa chủ yếu - 13 - đường đôi, đường ba hàm lượng POS lớn (hình 3.21) Do lựa chọn nồng độ cho nghiên cứu A B G1 G2 G3 M Hình 3.21 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/cơ chất đến hàm lượng (A) thành phần POS (B) dịch thủy phân pectin vỏ chanh leo M: oligosaccharide chuẩn; giếng 1-5 với tỷ lệ 20, 30, 40, 50, 60 U/g 3.2.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ Với nồng độ pectin 3% (w/v) khoảng nhiệt độ thủy phân nghiên cứu 40 - 60C Xác định hàm lượng, thành phần POS biểu diễn kết hình 3.22 cho thấy, phản ứng 50C, dịch thủy phân xuất lượng G2 G3 mong muốn tổng lượng POS tạo cao A B G1 G2 G3 M Hình 3.22 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng (A) thành phần POS (B) dịch thủy phân pectin vỏ chanh leo M: oligosaccharide chuẩn; giếng 1-3 tương ứng với nhiệt độ 40, 50, 60oC 3.2.2.4 Ảnh hưởng pH Tiến hành thủy phân pectin 3% (w/v) pH – 5, kết hình 3.23 cho thấy mức pH pectin thủy phân hoàn, xuất vệt G2 G3 rõ Đồng thời, lượng G1 tạo - 14 A B G1 G2 G3 M Hình 3.23 Ảnh hưởng pH đến hàm lượng (A) thành phần POS (B) dịch thủy phân pectin chanh leo M: oligosaccharide chuẩn; giếng 1-3 với pH 3, pH 4, pH 3.2.2.5 Ảnh hưởng tốc độ khuấy Tiến hành thủy phân pectin 3% (w/v) tốc độ khuấy 200 – 350 vòng/phút Kết hình 3.24 cho thấy dịch pectin có độ nhớt cao nên tốc độ phản ứng thủy phân bị ảnh hưởng mạnh tốc độ khuấy Trong thử nghiệm, tốc độ khuấy 250 vòng phút lựa chọn phổ sản phẩm thu chủ yếu G2 G3 A B G1 G2 G3 M Hình 3.24 Ảnh hưởng tốc độ khuấy đến hàm lượng (A) thành phần POS (B) dịch thủy phân pectin chanh leo M: oligosaccharide chuẩn; 1-4: dịch POS tốc độ khuấy 200, 250, 300, 350 vòng/phút 3.2.2.6 Ảnh hưởng thời gian Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến trình thủy phân giới hạn pectin chanh leo cho thấy hàm lượng POS tăng nhanh đạt cao 18,16 mg/ml thủy phân tiếng (hình 3.25) - 15 A B G1 G2 G3 M Hình 3.25 Ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng (A) thành phần POS (B) dịch thủy phân pectin chanh leo M: oligosaccharide chuẩn; 1-6: thời gian thủy phân 1, 2, 3, 4, 3.2.2.7 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân pectin tạo POS Sử dụng phương pháp hàm kỳ vọng để tối ưu hóa hàm lượng POS thu sau trình thủy phân thu 43 phương án thí nghiệm Với phương án tốt 44 U/g pectin, nhiệt độ 53C tốc độ khuấy 270 vòng/phút, hàm lượng POS tính toán đạt 24,35 mg/ml (hiệu suất thủy phân 81,83%) Tiến hành thủy phân pectin vỏ chanh leo với điều kiện tối ưu endopolygalacturonase thu nhận từ chủng đột biến A niger UV06-12-23, sau tiếng thủy phân thu hàm lượng POS đạt 23,55 mg/ml Kết sắc ký đồ hình 3.28 cho thấy sau tiếng thủy phân (giếng 5) dịch thủy phân từ nguồn enzyme gồm nhiều thành phần dịch thủy phân enzyme thương mại (gồm mono, di, tri tetra galacturonic acid) hiệu suất thủy phân thấp không đáng kể so với enzyme thương mại (78,50% 81,16% tương ứng) Do phổ sản phẩm thủy phân tiếng oligosaccharide nên áp dụng điều kiện tối ưu sử dụng EPG nghiên cứu để sản xuất POS 1: mono, di, tri galacturonic acid – 7: dịch thủy phân sau 30, 60, 120, 180, 240 300 phút 8: pectin chưa thủy phân Hình 3.28 Bản sắc ký lớp mỏng dịch thủy phân pectin vỏ chanh leo EPG từ A niger UV06-12-23 - 16 - 3.2.3 Thu nhận tinh POS Trong sản phẩm dịch thủy phân POS (digalacturonic acid trigalacturonic acid) chứa phần nhỏ sản phẩm phụ pectin thủy phân chưa sâu (pectin khối lượng phân tử thấp), monogalacturonic acid enzyme Do vậy, phần công đoạn trình tinh nghiên cứu nhằm tạo nhiều dòng sản phẩm để đa dạng hóa mục đích sử dụng (ứng dụng công nghiệp thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, y dược phân tích) 3.2.3.1 Tinh kỹ thuật lọc màng Từ 10 lít dịch POS sau thủy phân ly tâm 6.000 vòng/phút 10 phút 4oC, sau lọc qua màng 10kDa màng kDa Kết biểu diễn bảng 3.20 Bảng 3.20 Hiệu suất thu hồi POS sau lọc dòng ngang Thể Tổng lượng Tổng lượng Hiệu suất tích Pectin khối lượng POS (g) thu hồi (%) (lít) phân tử thấp (g) Dịch đầu 10 27,1 ± 0,5 242,7 ± 5,7 100 Dịch qua màng 10 kDa 9,5 3,5 ± 0,1 214,2 ± 4,5 88,2 ± 1,80 Dịch qua màng kDa 9,0 200,4 ± 4,1 82,5 ± 1,75 Kết cho thấy sau lọc qua màng 10 kDa lượng pectin khối lượng phân tử thấp giảm đáng kể so với dịch ban đầu (3,5g 27,1g), lượng POS dịch cao (hiệu suất thu hồi POS 88,2%) Tiếp tục qua màng kDa, dịch qua màng không chứa pectin khối lượng phân tử thấp với hiệu suất thu hồi 82,5% Sắc ký đồ hình 3.10B (giếng 3) cho thấy dịch POS sau lọc gồm mono, di tri galacturonic acid 3.2.3.2 Tinh POS qua cột sắc ký Dịch POS sau lọc qua màng kDa tinh tiếp phương pháp sắc ký lọc gel Kết bảng 3.21 hình 3.29 - 17 A B G2 + G3 G1 G2 G3 G1 Hình 3.29 Các phân đoạn POS lọc gel (A) TLC sản phẩm tinh (B) 1: mono, di, tri galacturonic acid; 2: dịch POS qua màng 10 kDa ; 3: dịch POS qua màng kDa; - 5: dịch chiết phân đoạn 15 40 Dịch POS sau lọc thu đỉnh tương ứng với phân đoạn 13 – 24 phân đoạn 34 – 41 (hình 3.29A) Phân tích thành phần đỉnh sắc ký hình 3.29B cho thấy phân đoạn 15 (đỉnh 1) chứa di tri galacturonic acid (giếng 4), phân đoạn 40 (đỉnh 2) chứa monogalacturonic acid (giếng 5) Với phân đoạn POS từ 13 – 24, tổng hàm lượng POS thu 379,7 mg hiệu suất thu hồi POS sau lọc gel 78,6% (bảng 3.21) Bảng 3.21 Hiệu suất thu hồi POS sau lọc gel Tổng lượng Tổng lượng mono Hiệu suất thu POS (mg) galacturonic acid (mg) hồi (%) Dịch qua màng kDa 398,4 ± 1,7 30,2 ± 0,5 82,5 ± 1,75 Dịch sau lọc gel 379,7 ± 1,5 78,6 ± 1,78 Như vậy, dịch POS sau lọc gel không chứa monogalacturonic acid bao gồm di, tri galacturonic acid 3.2.4 Nghiên cứu hoàn thi n chế phẩm POS 3.2.4.1 Tạo chế phẩm POS dạng bột Dịch thủy phân pectin từ vỏ chanh leo chứa POS sản phẩm phụ Trong pectin chất xơ thực phẩm an toàn với người Do vậy, toàn dịch thủy phân sử dụng làm sản phẩm POS thô ứng dụng bổ sung vào lĩnh vực sản xuất thực phẩm, thức ăn chăn nuôi đồ uống - 18 - Kết nghiên cứu điều kiện sấy thích hợp sản phẩm POS là: nhiệt độ đầu vào 170oC, tốc độ tiếp liệu 2,5 lít/giờ, tốc độ đầu bơm ly tâm 23000 vòng/phút Từ 60 lít dịch POS, sau phối trộn với maltodextrin tới 12oBx sấy phun với điều kiện thu 2,56 kg chế phẩm POS 55% 3.2.4.2 Nghiên cứu bảo quản chế phẩm POS Khi bổ sung natri benzoat 0,01% vào chế phẩm POS dạng lỏng cho thấy hàm lượng POS chế phẩm ổn định, chất lượng gần không thay đổi so với ban đầu sau 12 tháng Với chế phẩm POS dạng bột bảo quản túi thiếc sau 12 tháng không thấy phát triển vi khuẩn tổng số hiếu khí, E coli, Samonella, bào tử nấm men, nấm mốc hàm lượng POS ổn định, chất lượng sản phẩm không thay đổi 3.2.5 Xây dựng quy trình sản xu t POS từ pectin vỏ chanh leo Với điều kiện thủy phân pectin tạo POS, xây dựng quy trình sản xuất POS thô từ pectin vỏ chanh leo hình 3.31 Hình 3.31 Sơ đồ quy trình thu nhận chế phẩm POS từ pectin vỏ chanh leo - 19 - 3.3 Đánh giá hoạ ăm dò ứng dụng POS 3.3.1 Hoạt tính sinh h c Để minh chứng tác dụng có lợi pectic oligosaccharide, nghiên cứu chế phẩm POS đánh giá hoạt tính sinh học điều kiện in vitro thông qua khả làm tăng số lượng vi khuẩn có lợi giảm số lượng vi khuẩn gây hại chủng kiểm định Bên cạnh đó, điểm hoạt tính prebiotic (PAS) POS đánh giá so sánh với số loại prebiotic khác sử dụng phổ biến 3.3.1.1 Ảnh hưởng đến phát triển vi khuẩn có lợi có hại Kết bảng 3.27 cho thấy chủng probiotic Lactobacillus thử nghiệm tăng sinh mạnh môi trường chứa POS so với môi trường có glucose, L acidophilus (L3) có khả tăng sinh mạnh Khi nuôi cấy E coli, S typhi S aureus môi trường chứa POS, số lượng khuẩn lạc sau 24 nuôi cấy giảm nuôi chúng môi trường không chứa POS Bảng 3.27 Ảnh hưởng POS tới phát triển vi khuẩn có lợi hại Số lượng khuẩn lạc tăng sau 24 Chủng thử nghiệm (Tính theo Lgcfu/ml) Môi trường Glucose Môi trường chứa POS L1 9,523 ± 0,089 9,768 ± 0,091 L2 9,520 ± 0,090 9,708 ± 0,090 L3 9,488 ± 0,091 9,788 ± 0,089 L4 9,530 ± 0,091 9,714 ± 0,089 L5 9,529 ± 0,089 9,676 ± 0,090 L6 9,514 ± 0,090 9,775 ± 0,091 L7 9,572 ± 0,092 9,695 ± 0,091 L8 9,529 ± 0,090 9,745 ± 0,090 L9 9,595 ± 0,089 9,733 ± 0,091 E coli 0157:H7 9,563 ± 0,090 8,340 ± 0,076 S enterica Typhi 9,533 ± 0,092 8,403 ± 0,075 S aureus ATCC 25923 9,556 ± 0,090 8,628 ± 0,078 Kết thử nghiệm ảnh hưởng POS tới phát triển hai loại vi khuẩn có lợi có hại chúng nuôi kết hợp môi trường bảng 3.28 cho thấy mật độ hỗn hợp vi khuẩn cải thiện - 20 - môi trường nuôi có mặt POS, nhiên lượng tăng chủ yếu L acidophilus vi khuẩn có hại sinh trưởng chậm Bảng 3.28 Ảnh hưởng POS tới phát triển đồng thời vi khuẩn có lợi có hại Chủng thử nghiệm Số lượng khuẩn lạc tăng sau 24 nuôi (tỉ lệ 1:1) (Lgcfu/ml) L1+ Vi khuẩn Vi khuẩn có L1 có hại hại L1 + S enterica Typhi 9,828 ± 0,079 9,818 ± 0,079 8,161 ± 0,050 L1 + E coli 0157:H7 9,790 ± 0,078 9,782 ± 0,080 8,041 ± 0,053 L1 + S aureus ATCC 9,792 ± 0,078 9,772 ± 0,078 8,455 ± 0,053 25923 Để minh chứng hoạt tính sinh học POS quan có thẩm quyền cách độc lập, chế phẩm POS thô dạng bột gửi đánh giá hoạt tính sinh học Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia Kết thu trình bày bảng 3.29 cho thấy chế phẩm POS thô có khả tăng sinh số lượng vi khuẩn có lợi như: L acidophilus ATCC 4356, L rhamnosus ATCC 7469, B bifidum ATCC 15700 ức chế phát triển E coli ATCC 25922, S aureus ATCC 25923 Bảng 3.29 Kết phân tích hoạt tính sinh học POS thô dạng bột Số lượng khuẩn lạc tăng sau 24 Chủng thử nghiệm (Lgcfu/ml) môi trường Glucose POS Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 7,96 8,26 Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469 6,64 6,77 Bifidobacteria bifidum ATCC 15700 8,18 8,25 Escherichia coli ATCC 25922 8,77 8,56 Staphylococcus aureus ATCC 25923 7,39 4,79 Như vậy, qua nghiên cứu ảnh hưởng POS đến phát triển vi khuẩn có lợi gây hại điều kiện in vitro thấy POS làm tăng cường phát triển vi sinh vật có lợi thuộc Lactobacillus, Bifidobacteria ức chế phát triển vi khuẩn gây hại E coli, S typhi, S aureus Kết sở khoa học để bổ sung POS vào trình chế biến tạo sản phẩm chức - 21 - 3.3.1.2 So sánh khả tăng sinh số chủng vi khuẩn có lợi POS prebiotic khác Để so sánh khả sử dụng POS số vi khuẩn có lợi với loại chế phẩm prebiotic khác lưu hành thị trường Việt Nam, tiến hành xác định tỷ lệ tăng sinh sau 24 so với môi trường MRS thu kết biểu diễn biểu đồ hình 3.33 Hình 3.33 Khả tăng sinh chủng Lactobacillus thử nghiệm môi trường chứa loại prebiotic khác Kết hình 3.11 cho thấy, tất chủng thử nghiệm sinh trưởng, phát triển tốt môi trường chứa POS prebiotic khác Tuy nhiên, L rhamnosus, L acidophilus, L bulgaricus, L fermentum L plantarum phát triển tốt môi trường chứa POS, L amylovorus sử dụng MOS, L casei B lactis dùng FOS L reuteri L johnsonii sử dụng Inulin tốt loại khác Vì vậy, POS sử dụng làm nguồn cacbon tốt cho phát triển vi khuẩn có lợi 3.3.1.3 Xác định điểm hoạt tính prebiotics POS Điểm hoạt tính POS 10 chủng vi khuẩn probiotic thể đồ thị hình 3.34 cho thấy, chế phẩm POS kết hợp với L acidophilus cho điểm prebiotic cao (0,597) thấp L fermentum (0,525) Khi tạo chế phẩm sinh học kết hợp vi khuẩn có lợi POS kết hợp POS với vi khuẩn L acidophilus để tạo chế phẩm có hoạt tính sinh học cao cách kết hợp khác để ứng dụng thực phẩm chức bổ sung vào thức ăn chăn nuôi thức ăn thủy hải sản - 22 - Hình 3.34 Điểm hoạt tính prebiotic chủng vi khuẩn có lợi 3.3.2 Đ ch ợng sản phẩm an toàn v sinh thực phẩm cho chế phẩm POS dạng b t 3.3.2.1 Kiểm tra chất lượng sản phẩm Do Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đến năm 2015 quy định cụ thể tiêu vi sinh, hóa lý cho sản phẩm thực phẩm chức năng, nhiên chế phẩm POS thường bổ sung vào sản phẩm bánh, sữa, đồ uống… nên chọn Quy chuẩn Việt Nam 2011 cho sản phẩm sữa bột trẻ đến 12 tháng tuổi để làm đối chứng Kết đánh giá từ Viện Dinh dưỡng cho thấy sản phẩm POS thô dạng bột đạt tiêu vi sinh, hóa lý thực phẩm theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia ô nhiễm độc tố vi nấm, giới hạn ô nhiễm kim loại nặng vi sinh vật thực phẩm Kết hình 3.36 cho thấy phổ sản phẩm POS gồm di, tri galacturonic (24 mg/ml) lượng monogalacturonic acid (3 mg/ml) 100 [modified by igor] nC 88 100 [modified by igor] nC A G2 + G3 88 75 75 63 63 G1 50 38 25 25 13 13 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 G2 + G3 G1 50 38 -5 0,0 B 40,0 45,0 50,0 55,0 -5 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 Hình 3.36 Sắc ký đồ HPAEC dịch thủy phân pectin chanh leo A: Mono, di, tri galacturonic acid chuẩn, B: dịch thủy phân pectin 55,0 - 23 - 3.3.2.2 Thử nghiệm độc tính cấp sản phẩm chuột Sản phẩm POS thô dạng bột cho chuột uống với mức liều từ 20,0 g – 60,0 g mẫu thử kg chuột không nhận thấy biểu khác thường so với nhóm đối chứng, không nhận thấy có biểu ngộ độc chuột thí nghiệm thời gian theo dõi Tất chuột ăn uống, hoạt động bình thường Không xác định liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50) mẫu thử không gây chết chuột thử nghiệm mức liều tối đa cho uống 3.3.3 Thử nghi m sản xu t bánh quy xốp bổ sung POS Dựa số công trình công bố, nghiên cứu chọn lượng POS để khuyến cáo sử dụng với hàm lượng từ – 10 g người/ngày để làm sở tính toán bổ sung vào bánh bích quy Tiến hành phối trộn nguyên liệu bổ sung POS bột – 3% (w w), đánh nhuyễn sau tạo hình nướng nhiệt độ 160oC 10 phút Bánh đối chứng (không chứa POS) lô bánh bổ sung POS xác định cảm quan Kết cho thấy mẫu bánh bổ sung 2% POS có vị ngon, giữ màu sắc cấu trúc sản phẩm Kết sắc ký lớp mỏng cho thấy trình nướng nhiệt độ cao (160oC) thời gian dài (10 phút) không làm thay đổi thành phần POS (digalacturonic acid trigalacturonic acid) Bên cạnh đó, POS có sản phẩm bánh sau nướng, bánh bổ sung POS 2% có khả tăng sinh vi khuẩn có lợi ức chế vi khuẩn gây hại Như vậy, bánh quy xốp bổ sung POS 2% (w/v) sử dụng làm bánh chức nhằm tăng cường sức khỏe cho người KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau thời gian nghiên cứu, luận án đưa số kết luận sau: Đã phân lập chủng A niger từ 37 chủng tuyển chọn A niger CNTP 5037, tạo chủng đột biến A niger UV06-12-23 UV có khả sinh tổng hợp endopolygalacturonase cao (60,82 U/g) Tìm điều kiện lên men rắn thích hợp để A niger UV06-12-23 sinh tổng hợp endopolygalacturonase (73,15 U/g 31oC, pectin 12,5%, độ ẩm 64,5%, 72 giờ) tách tinh sạch, xác định đặc tính xúc tác - 24 - endopolygalacturonase: bền pH - 5, 30 - 50ºC pH tối ưu 4,5, nhiệt độ tối ưu 50oC; Km = 4,94 (mg/ml), Vmax = 1,46 (µmol/phút) Xây dựng quy trình thu nhận pectin từ vỏ chanh leo: Vỏ chanh leo xử lý (cắt, chần acid citric 3%, nghiền) chiết pectin (pH 2, 100oC, 10 phút) thu dịch vải lọc, cô đặc chân không (ở 50oC, đến 25oBx) sau kết tủa pectin (ethanol 0oC, tỷ lệ 3:1) sấy 50oC, đóng gói tạo pectin thành phẩm Đã xác định điều kiện tối ưu để chuyển hóa pectin từ vỏ chanh leo tạo POS (pectin 3%, tỷ lệ enzyme chất 44 U/g, pH 4, 53oC, khuấy 270 vòng/phút, giờ), hiệu suất thủy phân 80%, phổ sản phẩm POS chứa chủ yếu digalacturonic acid trigalacturonic acid Xây dựng quy trình thu hồi POS từ dịch thủy phân giới hạn pectin hoàn thiện tạo chế phẩm POS thô tinh sạch: + Chế phẩm POS thô (POS 55%): Thủy phân Pectin vỏ chanh leo (3%, endopolygalacturonase 44 U/g, pH 4, 53oC, 270 v/p, giờ) sấy phun (trộn maltodextrin 12oBx, tvào170oC, tra80oC) + Chế phẩm POS tinh sạch: Thủy phân Pectin vỏ chanh leo (3%, endopolygalacturonase 44 U/g, pH 4, 53oC, 270 v/p, giờ), lọc dòng ngang (10 kDa kDa) sau lọc gel (ToyopearGigaCapQ650M) Chế phẩm POS bột đánh giá có khả tăng sinh vi khuẩn có lợi (Lactobacillus 137,41 - 193,37%) giảm vi khuẩn có hại thể chủ (E coli 68,59%, S typhi 87,26%, S aureus 88,08%), đảm bảo tiêu an toàn vệ sinh thực phẩm Bước đầu ứng dụng chế phẩm POS bột sản xuất bánh quy xốp chức năng, bánh giữ tính chất cảm quan đặc trưng mùi vị cấu trúc 4.2 Kiến ngh - Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất POS từ pectin vỏ chanh leo quy mô công nghiệp - Cần nghiên cứu thử nghiệm hiệu sản phẩm POS vào sản xuất sản phẩm thực phẩm chức khác có sử dụng POS làm sở phát triển dự án sản xuất POS quy mô lớn [...]... Vmax = 1,46 (µmol/phút) 3.2 Sản xu t pectic oligosaccharide (POS) từ pectin vỏ chanh leo 3.2.1 Thu nhận và chuyển hóa pectin Qua quá trình khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến thu hồi pectin bằng acid citric và thử nghiệm trên quy mô 100kg vỏ chanh leo, luận án đã xây dựng quy trình thu nhận pectin từ vỏ chanh leo cho sản xuất POS như hình 3.18 Xử lí nguyên li u Chiết pectin (cắt, chần acid citric 3%, nghiền)... thủy phân giới hạn pectin vỏ chanh leo tạo POS Để chủ động nguồn enzyme trong nghiên cứu này endopolygalacturonase thương mại (Pectinex Ultra SP-L) được sử dụng để nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận POS từ pectin vỏ chanh leo và sau đó ứng dụng quy trình này trên enzyme nghiên cứu (endopolygalacturonase từ A niger UV06-12-23) để sản xuất POS 3.2.2.1 Lựa chọn nồng độ pectin Thủy phân pectin nồng độ... trình sản xu t POS từ pectin vỏ chanh leo Với các điều kiện thủy phân pectin tạo POS, chúng tôi xây dựng quy trình sản xuất POS thô từ pectin vỏ chanh leo như hình 3.31 Hình 3.31 Sơ đồ quy trình thu nhận chế phẩm POS từ pectin vỏ chanh leo - 19 - 3.3 Đánh giá hoạ và ăm dò ứng dụng của POS 3.3.1 Hoạt tính sinh h c Để minh chứng tác dụng có lợi của pectic oligosaccharide, trong nghiên cứu này chế phẩm... tạo POS Cùng với đó nguồn vỏ chanh leo từ các cơ sở sản xuất ở Việt Nam chủ yếu là chanh leo tím Do vậy, để ứng dụng pectin từ vỏ chanh leo tím vào sản xuất POS cần nghiên cứu chuyển hóa HM pectin thành LM pectin Kết quả nghiên cứu cho thấy quá trình chuyển hóa được thực hiện ở nồng độ pectin 2% (w/v) bằng HCl 1% (v/v) với tốc độ khuấy 50 vòng/phút, 70oC trong 4 - 6 giờ Pectin thu được có hàm lượng 86... Kết tủa Thu d c , C đ c (nhiệt độ 50oC) (ethanol lạnh 0oC, tỷ lệ 3:1) (50oC, cô chân không tới 20oBx) Vỏ chanh leo Đó ó , bảo quản PECTIN Hình 3.18 Sơ đồ quy trình thu nhận pectin từ vỏ chanh leo Pectin thu nhận theo quy trình trên được đánh giá thành phần và chất lượng Kết quả được biểu diễn trong bảng 3.15 Bảng 3.15 Thành phần của pectin tách chiết từ chanh leo Thành phần hóa h c Hàm ợng Pectin (%)... DE pectin (%) 70 (Chanh tím) - HMP 38 (Chanh vàng) - LMP Độ ẩm (%) 5,47 Hàm lượng tinh bột (%) 0,5 Hàm lượng protein (%) 0 Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g) 6×10 Coliform (MPN/g) 10 S aureus (CFU/g) 0 Hiệu suất thu nhận pectin (%) 2,8 - 12 - Pectin từ vỏ chanh leo tím thu c dạng HM pectin (pectin có mức độ methyl hóa cao) Trong khi endopolygalacturonase hoạt động phân cắt hiệu quả hơn trên LM pectin. .. tác - 24 - của endopolygalacturonase: bền ở pH 3 - 5, 30 - 50ºC và pH tối ưu 4,5, nhiệt độ tối ưu 50oC; Km = 4,94 (mg/ml), Vmax = 1,46 (µmol/phút) 3 Xây dựng được quy trình thu nhận pectin từ vỏ chanh leo: Vỏ chanh leo được xử lý (cắt, chần acid citric 3%, nghiền) rồi chiết pectin (pH 2, 100oC, 10 phút) và thu dịch bằng vải lọc, cô đặc chân không (ở 50oC, đến 25oBx) sau đó kết tủa pectin bằng (ethanol... suất thủy phân 81,83%) Tiến hành thủy phân pectin vỏ chanh leo với điều kiện tối ưu bằng endopolygalacturonase thu nhận từ chủng đột biến A niger UV06-12-23, sau 5 tiếng thủy phân thu được hàm lượng POS đạt 23,55 mg/ml Kết quả sắc ký đồ hình 3.28 cho thấy sau 4 tiếng thủy phân (giếng 5) dịch thủy phân từ nguồn enzyme này gồm nhiều thành phần hơn dịch thủy phân bằng enzyme thương mại (gồm mono, di, tri... khi thủy phân 4 tiếng vẫn là các oligosaccharide nên có thể áp dụng các điều kiện đã tối ưu khi sử dụng EPG nghiên cứu để sản xuất POS 1: mono, di, tri galacturonic acid 2 – 7: dịch thủy phân sau 30, 60, 120, 180, 240 và 300 phút 8: pectin chưa thủy phân Hình 3.28 Bản sắc ký lớp mỏng dịch thủy phân pectin vỏ chanh leo bằng EPG từ A niger UV06-12-23 - 16 - 3.2.3 Thu nhận và tinh sạch POS Trong sản phẩm... phân pectin vỏ chanh leo 3% ở các tỷ lệ enzyme cơ chất là 20 60 U/g pectin Kết quả cho thấy ở tỷ lệ 40 U/g phổ sản phẩm chứa chủ yếu - 13 - là đường đôi, đường ba và hàm lượng POS lớn nhất (hình 3.21) Do đó lựa chọn nồng độ này cho các nghiên cứu tiếp theo A B G1 G2 G3 M 1 2 3 4 5 Hình 3.21 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất đến hàm lượng (A) và thành phần POS (B) trong dịch thủy phân pectin vỏ chanh leo ... tổng hợp EPG + Thu nhận, tinh xác định đặc tính enzyme chủng cải tạo - Xây dựng quy trình thu nhận POS từ pectin vỏ chanh leo + Nghiên cứu thu nhận pectin từ vỏ chanh leo + Nghiên cứu điều kiện... nguồn vỏ chanh leo từ sở sản xuất Việt Nam chủ yếu chanh leo tím Do vậy, để ứng dụng pectin từ vỏ chanh leo tím vào sản xuất POS cần nghiên cứu chuyển hóa HM pectin thành LM pectin Kết nghiên cứu. .. enzyme nghiên cứu endopolygalacturonase thương mại (Pectinex Ultra SP-L) sử dụng để nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận POS từ pectin vỏ chanh leo sau ứng dụng quy trình enzyme nghiên cứu (endopolygalacturonase