VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÙI THỊ HUYỀNPHƯƠNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA OMEGA-CONOTOXIN Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 01 16 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2015 Công trình hoàn thành Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: GS TS Phan Văn Chi Viện Công nghệ sinh học PGS TS Nguyễn Bích Nhi Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1:…………………… Phản biện 2: …………………… Phản biện 3: ……………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sỹ cấp nhà nước tại: Viện Công nghệ sinh học Vào hồi …… ngày …… tháng ……năm 2015 Có thể tìm hiểu luận án tại: § Thư viện Quốc gia Việt Nam § Viện Công nghệ sinh học § Trang web Bộ GDĐT       MỞ ĐẦU Đau thần kinh rối loạn đặc trưng tổn thương hệ thần kinh từ bệnh mạn tính ung thư, đái tháo đường, HIV phẫu thuật, chấn thương Theo thống kê Viện Hàn lâm Y học Đau Mỹ (AAPM -American Academy of Pain Medicine), năm 2015 giới có khoảng 1,5 tỷ người bị đau mạn tính, 4,5% bệnh nhân đau thần kinh tỷ lệ mắc bệnh tăng theo tuổi, tính riêng Châu Âu số người phải chịu đựng đau thần kinh chiếm khoảng 5% dân số Trên thực tế, bệnh đau thần kinh trị dứt điểm mà cải thiện chất lượng sống cho bệnh nhân cách sử dụng loại thuốc giảm đau Cho đến nay, việc điều trị giảm đau truyền thống với thuốc chống viêm không steroid sử dụng nhóm opioid có tác dụng mạnh Morphine chưa thực hiệu Việc tìm kiếm phân tử đích phát triển thuốc giảm đau nỗ lực nhà khoa học nhiều năm qua Một hệ chất giảm đau có nguồn gốc từ nọc loài ốc cối biển (Conus) đầu tư nghiên cứu phát triển mạnh thời gian gần Đó conotoxin (có chất peptide) tách chiết từ bầu độc ốc cối, có tác động khóa chọn lọc lên kênh ion hay thụ thể tế bào thần kinh nên ứng dụng việc tạo thuốc giảm đau, bảo vệ tế bào thần kinh Trong đó, omega conotoxin MVIIA độc tố tách chiết từ loài ốc cối Conus magus, có tác dụng khóa chọn lọc kênh Ca2+ type N tế bào thần kinh, gây ức chế trình truyền tín hiệu thần kinh qua khe synapse, có hiệu lực giảm đau tốt Morphine không gây nghiện Đặc biệt omega conotoxin MVIIA với tên thương mại Prialt hay Ziconotide Cơ quan Dược phẩm Thực phẩm Hoa Kỳ (United States Food and Drug Administration - FDA) cấp phép sử dụng từ tháng năm 2004 Cơ quan Dược phẩm Châu Âu (Europe Medicines Agency - EMA) cấp phép sử dụng từ tháng năm 2005 loại thuốc giảm đau Bên cạnh đó, nhiều đặc tính khác MVIIA nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng pha khác tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh vùng đồi thị mô hình gây đột quị não Việc tách chiết trực tiếp conotoxin có hoạt tính dược lý từ bầu độc ốc cối thường có hiệu suất thấp, độ tinh không cao đa dạng thành phần protein nọc (khoảng 1000 loại) hàm lượng loại lại       thấp Cho đến nay, conotoxin thường tổng hợp đường hoá Tuy nhiên, phương pháp tổng hợp hóa học bị hạn chế cách thức tổng hợp thường qua nhiều khâu, giá thành sản xuất cao đồng thời việc tạo thành cầu nối disulfide gặp khó khăn Vì conotoxin trọng nghiên cứu, tạo công nghệ ADN tái tổ hợp Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu conotoxin tự nhiên tái tổ hợp hạn chế bắt đầu triển khai Phòng Hóa sinh Protein, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Chính vậy, thực đề tài “Nghiên cứu biểu xác định đặc tính omega conotoxin” với mục tiêu nội dung sau: Mục tiêu Tạo omega conotoxin tái tổ hợp (ω-CTX, viết tắt CTX) có khả ứng dụng y dược học dạng hoạt chất giảm đau Nội dung nghiên cứu Tạo phân tử CTX tái tổ hợp gồm: (i) Thiết kế tạo dòng gen mã hóa cho CTX; (ii) Nghiên cứu biểu CTX dạng dung hợp với thioredoxin (TrxCTX) E coli; (iii) Tinh Trx-CTX CTX tái tổ hợp; (iv) Xác định CTX tái tổ hợp tạo phương pháp khối phổ; (v) Xây dựng quy trình lên men lít/mẻ thu nhận, tinh bảo quản CTX tái tổ hợp Thử nghiệm hoạt tính giảm đau CTX chuột nhắt trắng mô hình hóa chất sử dụng Formalin Những đóng góp luận án Đã tạo dòng xác định trình tự gen mã hoá cho CTX với kích thước 75 bp tương đồng 100% với trình tự nucleotide vùng peptide trưởng thành conotoxin từ ốc cối biển Conus magus (ConcoSever, N01765) Đã thiết kế biểu CTX dạng dung hợp với Trx E coli; tinh CTX tái tổ hợp dạng Trx-CTX với hiệu suất 60 mg/L, hiệu suất thu hồi từ dịch chiết tế bào đạt 12% độ 96,6%; tinh peptide CTX từ Trx-CTX với hiệu suất thu hồi đạt 9% độ 97,5%; xác định peptide CTX có khối lượng phân tử 2,769 kDa phương pháp khối phổ       Trên mô hình gây đau thực nghiệm Formalin chuột nhắt trắng, CTX tái tổ hợp khẳng định có hoạt tính giảm đau tương đương với Lidocain với liều lượng nhỏ 142 lần Cấu trúc luận án Luận án gồm 102 trang chia thành phần: Mở đầu trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu 22 trang; Chương 2: Vật liệu phương pháp 18 trang; Chương 3: Kết 30 trang; Chương 4: Thảo luận trang; Kết luận kiến nghị: trang; Các công trình công bố tác giả trang; Tài liệu tham khảo 17 trang; Tóm tắt luận án tiếng anh trang; Phụ lục trang Luận án có 20 bảng số liệu, 35 hình 150 tài liệu tham khảo tiếng Việt tiếng Anh NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Độc tố thần kinh (neurotoxin) Độc tố thần kinh (hay gọi neurotoxin) chất độc có khả làm tổn thương phá huỷ mô tế bào thần kinh Độc tố thần kinh ức chế kiểm soát nồng độ ion tế bào thần kinh qua màng tế bào ức chế trao đổi thông tin tế bào thần kinh qua synapse 1.2 Conotoxin 1.2.1 Cấu trúc phân loại Conotoxin độc tố thần kinh nằm phần bầu độc loài ốc cối biển (Conus), có chất peptide/protein gồm 8-35 amino acid giàu cầu nối disulfide để cố định hình dạng phân tử làm tăng khả bám conotoxin với đích đặc hiệu Conotoxin chia thành loại gồm α-, δ-, κ-, µ- ωconotoxin dựa vào xếp gốc cysteine phân tử với đích tác dụng chủ yếu kênh ion Ca2+, Na+, K+ hay thụ thể acetylcholine, NMDA… 1.2.2 Tác dụng dược lý conotoxin Conotoxin coi thuốc dẫn đầu điều trị giảm đau thần kinh bệnh lý thần kinh, có tác dụng đặc hiệu tổn thương thần kinh bệnh Alzheimer, Parkinson chứng đa xơ cứng (multiple sclerosis) Bên       cạnh conotoxin có triển vọng nghiên cứu hội chứng rối loạn co giật, đột quị, nhồi máu tim, bảo vệ hệ tim mạch Trong phần tổng quan tài liệu chủ yếu đề cập đến tác dụng giảm đau bảo vệ thần kinh conotoxin liên quan đến nội dung nghiên cứu 1.3 Omega conotoxin MVIIA (CTX) 1.3.1 Cấu trúc CTX CTX tách chiết từ bầu độc ốc cối biển Conus magus, phân tử gồm 25 amino acid, có gốc cysteine tạo thành ba cầu nối disulfide vị trí 1-16, 8-20 15-25 1.3.2 Tác dụng dược lý CTX CTX khóa chọn lọc kênh Ca2+ type N, phân bố chủ yếu tế bào thần kinh tiền synapse Khi CTX truyền trực tiếp vào tuỷ sống, liên kết với quai P tiểu phần đơn vị α1 ức chế mở kênh Ca2+, ngăn cản dòng Ca2+ nhập bào vào tế bào thần kinh tiền synapse kéo theo ức chế giải phóng chất dẫn truyền thần kinh (neurotransmitters) cúc synape Từ tín hiệu thần kinh không truyền qua khe synape, dẫn truyền thần kinh liên tục neuron thần kinh kế cận bị gián đoạn Dựa sở mà CTX có ứng dụng làm chất giảm đau bảo vệ tế bào thần kinh mô hình gây đột quị CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu hóa chất Các chủng vi sinh: Chủng E coli DH5α (Invitrogen, Mỹ), chủng E coli BL21 (DE3) (Novagen, Mỹ) Plasmid: Vector tác dòng pBT cải biến từ vector pUC18 (do phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp) vector biểu pET32c(+) (Novagen, Mỹ) Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng dòng Swiss Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Học viện Quân Y, Bộ Quốc phòng cung cấp Các hóa chất thiết bị máy móc: Invitrogen, Novagen, Merck, New England Biolab Qiagen, Sigma…       2.2 Phương pháp nghiên cứu Luận án sử dụng ba nhóm phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nhóm phương pháp tạo dòng, biểu hiện, tinh xác định CTX tái tổ hợp • Nhân gen mã hoá cho CTX kỹ thuật PCR • Tách dòng gen mã hoá cho CTX vào vector tách dòng vector biểu • Xác định trình tự gen mã hoá cho CTX • Biểu tối ưu hoá điều kiện biểu CTX E coli • Tinh Trx-CTX tái tổ hợp sắc ký lực Ni-NTA sắc ký lọc gel Sephacryl S100 • Tinh peptide CTX enterokinase cột siêu lọc VIVASPIN 500 • Xác định khối lượng phân tử CTX khối phổ 2.2.2 Nhóm phương pháp xác định đặc tính CTX tái tổ hợp • Thử nghiệm hoạt tính giảm đau peptide CTX mô hình chuột thực nghiệm phương pháp Formalin 2.2.3 Nhóm phương pháp xử lý số liệu tin sinh học • Blast, DNAclub, BioEdit, ConcoSever, ImageJ, Alalyst QS, thống kê sinh học… CHƯƠNG KẾT QUẢ 3.1 THIẾT KẾ TẠO GEN MÃ HOÁ CHO CTX Từ kết khảo sát hệ protein nọc loài ốc cối thu thập vùng biển Nha Trang, Việt Nam, 40 loại conotoxin nhận dạng hệ thống khối phổ LC-MS/MS Một số conotoxin có tiềm ứng dụng y dược omega conotoxin MVIIA tìm thấy từ nguồn ốc cối Việt Nam (Lê Thị Bích Thảo et al., 2011) Kết hợp với thông tin trình tự peptide nucleotide omega conotoxin MVIIA tìm kiếm ConoServer (Hình 3.2) Chúng tiến hành nghiên cứu thiết kế, biểu thử nghiệm hoạt tính giảm đau omega conotoxin MVIIA tái tổ hợp (CTX tái tổ       hợp) Sơ đồ nghiên cứu Hình 3.1 Do kích thước gen mã hóa cho CTX nhỏ, gồm 75 nucleotide mã hóa cho 25 amino acid nên gen ctx tổng hợp trực tiếp mồi bổ sung với ctx1 với ctx ctx3 với ctx4 theo nguyên tắc bổ sung A-T, G-C Trong mồi dài khoảng từ 45 - 55 bp, ctx1 chứa điểm cắt enzyme giới hạn NcoI ctx4 chứa điểm cắt EcoRI để thuận lợi cho mục đích biểu hệ vector pET32c+ Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu Hình 3.2 Kết tìm kiếm trình tự gen mã hoá cho CTX ConoServer (Nguồn: www.conoserver.org)       Quá trình tạo dòng gen mã hóa peptide CTX thực sau: Trước thực phản ứng PCR, đoạn mồi phosphoryl hóa T4 PNK Hỗn hợp (ctx1, ctx2) hỗn hợp (ctx3, ctx4) trộn với nhau, sau biến tính 95oC phút trước giảm dần xuống 45oC nhiệt độ phòng, tạo điều kiện thuận lợi cho đoạn mồi bắt cặp bổ sung với Phản ứng nối hai đoạn DNA sợi đôi hình thành thực enzyme T4 ligase 14oC để tạo phân tử ctx (Hình 3.3) Hình 3.3 Sơ đồ mô tả chuỗi phản ứng tạo gen mã hóa cho peptide CTX trình tự cặp mồi thiết kế 3.2 TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA CHO CTX 3.2.1 Kết nhân gen mã hóa cho CTX kỹ thuật PCR Sản phẩm phản ứng nối ghép pha loãng 200 lần sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi ctx1 ctx4 Gen mã hóa cho protein CTX nhân lên kỹ thuật PCR có kích thước 75 bp Cặp mồi để nhân đoạn gen thiết kế tổng hợp gồm: Mồi xuôi với trình tự nhận biết enzyme giới hạn NcoI mang mã khởi đầu dịch mã E coli nối với đoạn trình tự nucleotide nửa gen ctx Mồi ngược trình tự nucleotide nửa gen ctx lại nối tiếp với trình tự nhận biết enzyme giới hạn EcoRI mang mã kết thúc       Hình 3.4 Kết nhân gen mã hóa cho CTX M: Thang DNA chuẩn 100 bp Đường chạy (ĐC) số 1: Sản phẩm gen mã hóa cho CTX Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose 1,7% thể Hình 3.4 cho thấy, đường chạy số cho băng DNA có kích thước khoảng 100 bp phù hợp với tính toán lý thuyết (gồm đoạn gen mồi) Sản phẩm PCR sau sử dụng trực tiếp để đưa vào vector tách dòng pBT mở vòng Tổ hợp gen (plasmid tái tổ hợp) tạo thành biến nạp vào tế bào tách dòng DH5α để chọn dòng plasmid có khả mang gen mã hoá cho CTX (CTXpBT) 3.2.2 Tách dòng gen mã hóa cho CTX DNA plamid tách chiết từ khuẩn lạc chọn tiếp tục kiểm tra song song hai phương pháp gồm cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp enzyme giới hạn BamHI PCR trực tiếp từ khuẩn lạc cặp mồi ctx1 ctx4 để chọn dòng mang gen ctx Sản phẩm thu từ phương pháp kiểm tra điện di gel agarose 1,7% (Hình 3.5 3.6) Kết Hình 3.5 cho thấy đường chạy 4, 5, 8, mẫu DNA plasmid sau xử lý enzyme giới hạn BamHI xuất băng: băng thứ có kích thước khoảng 2700 bp vector pBT nguyên gốc mở vòng thành dạng mạch thẳng; băng thứ hai có kích thước tương đương với kích thước sản phẩm PCR so với thang DNA chuẩn, khoảng 100 bp Trong đường chạy số 2, có băng tương ứng với vector pBT đường chạy số Như dòng 4, 5, plasmid tái tổ hợp có khả mang gen mã hóa cho CTX     11   Kết Hình 3.9 A sản phẩm sau xử lý enzyme giới hạn NcoI EcoRI cho thấy, đường chạy (ĐC) số có băng DNA có kích thước 5,9 Kb, vector pET32c+ mở vòng ĐC số xuất băng: băng có kích thước 2,7 Kb vector pBT bị cắt văng băng thấp có kích thước khoảng 100 bp tương đương với sản phẩm PCR đường chạy số gen mã hóa cho CTX Sử dụng kít QIAGEN để tách vector pET32c+ gen đích mô tả phần phương pháp Kết điện di kiểm tra sản phẩm gel (Hình 3.9 B) cho thấy, băng DNA đạt độ tinh cần thiết để thực thí nghiệm Gen mã hóa cho CTX vector pET32c+ nối ghép với nhờ enzyme T4 DNA ligase Sản phẩm gắn kết biến nạp vào chủng E coli DH5α để chọn dòng vector pET32c (+) có chứa gen ctx Vector tái tổ hợp ký hiệu CTXpET32c sau biến nạp vào chủng E coli BL21(DE3) để biểu 3.3.2 Biểu CTX tái tổ hợp Tế bào E coli BL21(DE3) chứa tổ hợp gen CTXpET32c nuôi cấy môi trường LB đặc sau chuyển sang môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh ampicillin đến nồng độ cuối 100 µg/ml Dịch tế bào sau cấy chuyển với tỷ lệ 1%, nuôi lắc 37oC đến OD600 đạt từ 0,6 - 0,8 cảm ứng IPTG đến nồng độ cuối 0,5 mM Sinh khối tế bào thu thời điểm 0h (trước cảm ứng) 3h (sau cảm ứng) để tiến hành điện di kiểm tra biểu protein dung hợp Hình 3.10 Biểu protein dung hợp Trx-CTX gel polyacrylamide 12,6% M: thang protein chuẩn SM0431; ĐC 0h: protein tổng số thời điểm (trước cảm ứng); ĐC 3h: protein tổng số thời điểm (sau cảm ứng)     12   Protein tổng số biểu từ dòng tế bào cảm ứng đối chứng không cảm ứng dòng tế bào kiểm tra điện di SDSPAGE 12,6% (Hình 3.10) Kết Hình 3.10 cho thấy, đường chạy 3h protein tổng số thời điểm sau cảm ứng IPTG, xuất băng protein so với đường chạy 0h protein tổng số thời điểm (trước cảm ứng), có kích thước khoảng 20,5 kDa so với thang protein chuẩn Thực chất CTX có kích thước khoảng kDa, biểu vector pET32c+ tạo protein dung hợp với thioredoxin (Trx) nhóm gốc Histidine vector pET32c+, băng protein xuất có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết (bao gồm 109 amino acid Trx đuôi His.Tag) 3.3.3 Khảo sát điều kiện biểu CTX tái tổ hợp E coli Sau protein tái tổ hợp biểu hiện, việc tối ưu hoá điều kiện biểu khả tan protein tái tổ hợp đóng vai trò then chốt định cho trình tinh kiểm tra hoạt tính protein Các điều kiện biểu thiết lập theo thời gian, nồng độ IPTG, độ pH môi trường thời gian thu mẫu thông số quan trọng phục vụ trình lên men 3.3.3.1 Khảo sát mức độ biểu độ tan CTX tái tổ hợp theo nhiệt độ Dòng bào E coli BL31(DE3) chứa plasmid CTXpET32c nghiên cứu biểu nhiệt độ khác 22, 28, 30 37oC để so sánh độ tan mức độ biểu CTX tái tổ hợp Sau cảm ứng IPTG, sinh khối tế bào thu lại Siêu âm phá màng tế bào đệm thích hợp (50 mM Tris HCl pH 7; 0,01% Triton X100 0,0001% Lysozyme) sau ly tâm chia thành pha: pha cặn pha tan Các mẫu pha điện di kiểm tra gel SDS-PAGE 12,6% (Hình 3.11) Kết nhận cho thấy, điều kiện nhiệt độ khảo sát, protein tái tổ hợp hầu hết xuất pha tan (đường chạy T) với băng đậm, rõ nét có kích thước khoảng 20,5 kDa so với thang protein chuẩn mà không thấy xuất với hàm lượng nhỏ so với pha cặn (Đường chạy C) dòng tế bào không cảm ứng IPTG (ĐC 1).Kết định lượng biểu protein dung hợp nhiệt độ khảo sát phần mềm ImageJ cho thấy mức độ biểu     13   protein dung hợp 22oC thấp nhất, 28oC tăng 1,8 lần, 30oC tăng 2,3 lần 37oC tăng 4,5 lần so với mức độ biểu protein 22oC (Bảng 1, phụ lục) Tại 37oC, protein dung hợp Trx-CTX biểu nhiều nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn hoạt động Do lên men sản xuất lượng lớn tạo hiệu suất biểu cao nhờ điều kiện sinh trưởng tối ưu chủng tái tổ hợp 370C Hình 3.11 Mức độ biểu độ tan protein dung hợp Trx-CTX nhiệt độ khác M: Thang protein chuẩn SM0431 (Fermentas); ĐC 1: Protein tổng số biểu không cảm ứng IPTG; ĐC C: Protein pha; ĐC T: Protein pha tan Như nhận thấy phần lớn protein tái tổ hợp (Trx-CTX) biểu pha tan không phụ thuộc vào nhiệt độ nghiên cứu 3.3.3.2 Khảo sát mức độ biểu CTX tái tổ hợp theo nồng độ chất cảm ứng IPTG Kết khảo sát (Hình 3.12) cho thấy, mức độ biểu Trx-CTX thay đổi theo nồng độ chất cảm ứng IPTG Bắt đầu cảm ứng với nồng độ 0,2 mM IPTG xuất băng protein so với chế độ nuôi không cảm ứng (ĐC số 9) Kết định lượng biểu protein dung hợp cho thấy nồng độ 0,5mM IPTG, Trx-CTX biểu nhiều gấp khoảng lần so với mức độ biểu protein cảm ứng 0,2 mM IPTG Mức độ biểu Trx-CTX nồng độ IPTG 0,7 mM gấp lần so với mức độ biểu protein 0,2mM Mức độ biểu Trx-CTX thay đổi không đáng kể nồng độ cảm ứng 0,9 mM IPTG 1,2 mM IPTG sau giảm dần theo nồng độ chất cảm ứng (Bảng 2, Phụ lục) Điều giải thích IPTG dư thừa ức chế sinh tổng hợp protein dung hợp Như chủng E coli BL21(DE3) mang plasmid CTXpET32c biểu tối ưu 0,5 mM IPTG     14   Hình 3.12 Mức độ biểu Trx-CTX theo nồng độ chất cảm ứng IPTG M: Thang protein chuẩn SM0431 (Fermentas); ĐC 18: Protein tổng số vi khuẩn sau 2h cảm ứng biểu IPTG nồng độ khác nhau; ĐC 9: Protein tổng số vi khuẩn không cảm ứng IPTG 3.3.3.3 Khảo sát mức độ biểu Trx-CTX theo pH môi trường nuôi cấy Mức độ biểu Trx-CTX khác điều kiện pH (từ – 8) nghiên cứu (Hình 3.13) Tại pH 7,0, mức độ biểu Trx-CTX cao so với pH môi trường 6; 6,5; 7,5 Nhìn chung, chủng E coli tái tổ hợp sinh trưởng sinh tổng hợp Trx-CTX tốt dải pH từ 6-8 song tốt pH 7,0 (Bảng 3, phụ lục) Hình 3.13 Mức độ biểu Trx-CTX theo pH môi trường nuôi cấy M: Thang protein chuẩn SM0431 (Fermentas); ĐC 1: Protein tổng số vi khuẩn không cảm ứng IPTG ĐC 2-8: Protein tổng số vi khuẩn sau 3h cảm ứng biểu 0,5 mM IPTG môi trường pH khác 3.3.3.4 Khảo sát thời gian thu mẫu Tiến hành khảo sát thời gian thu mẫu chủng E coli mang plasmid CTXpET32c biểu 37oC quy mô nuôi bình tam giác 500 ml Sau cấy chuyển mật độ tế bào OD600nm đạt 0,7 thời điểm thích hợp     15   tiến hành cảm ứng với IPTG Sau 11 cảm ứng, mật độ tế bào cao sau giảm dần (Hình 3.14) Hình 3.14 Mối tương quan thời gian nuôi cấy giá trị OD600nm dịch lên men chủng vi khuẩn E coli BL21 (DE3) biểu Trx-CTX bình tam giác 500 ml Mức độ biểu protein dung hợp thời điểm thu mẫu kiểm tra điện di SDS-PAGE (Hình 3.15) Hình 3.15 Mức độ biểu Trx-CTX theo thời gian thu mẫu SDSPAGE M: Thang protein chuẩn SM0431 (Fermentas); ĐC 1h-13h: Protein tổng số vi khuẩn thời điểm -13 sau cảm ứng Kết thể Hình 3.15 cho thấy, mức độ biểu protein dung hợp Trx-CTX tăng dần theo thời gian thu mẫu đến từ đến 11giờ sau cảm ứng, đến thời điểm 13 (hay 16 tính từ nuôi cấy), mức độ biểu prtoein tái tổ hợp giảm hẳn Như vậy, thời điểm thu mẫu tốt sau 11 cảm ứng hay sau 14 nuôi cấy bình tam giác     16   Từ kết khảo sát cho thấy, CTX tái tổ hợp biểu tốt 37oC, pH 7,0, nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,5 mM sinh khối tế bào đạt giá trị cực đại sau 14 nuôi cấy bình tam giác, đồng thời độ tan protein tái tổ hợp không phụ thuộc vào nhiệt độ khảo sát 3.4 TINH SẠCH CTX TÁI TỔ HỢP 3.4.1 Tinh chế protein dung hợp Trx-CTX sắc ký lực Ni-NTA sắc ký lọc gel Sephacryl S100 Gen ctx biểu hệ vector pET32c dung hợp đoạn DNA mã hóa cho 109 amino acid Trx, tăng tính tan protein biểu trình tự mã hóa cho His.Tag tạo điều kiện thuận lợi cho bước tinh Hình 3.16 SDS-PAGE phân đoạn protein thu sau sắc ký lực Ni-NTA M: Thang protein chuẩn (SM 0431Fermentas); ĐC T: Pha tan đưa lên cột sắc ký lực; ĐC F1-F6: Các phân đoạn sắc ký lực thu Các phân đoạn thu sau sắc ký lực gom lại thẩm tích loại muối sau cho qua cột sắc ký lọc gel Sephacryl S-100 Nồng độ protein phân đoạn định lượng phương pháp Bradford (Bảng 10, Phụ lục) Phân đoạn protein tinh từ sắc ký lực sắc ký lọc gel điện di gel SDS-PAGE 12,6 % để kiểm tra độ protein tái tổ hợp thu phần mềm định lượng ImageJ (Hình 3.17)     17   Hình 3.17 Điện di protein kiểm tra phân đoạn tinh chế TrxCTX sắc ký lực Ni-NTA sắc ký lọc gel S-100 gel polyacrylamide 12,6% M: thang protein chuẩn Kết thể Hình 3.17 cho thấy pha tan (ký hiệu Tan) chứa phần lớn protein tái tổ hợp so vớ pha cặn (ký hiệu Cặn) sau ly tâm Kết phù hợp với kết khảo sát mức độ tan protein tái tổ hợp Trx-CTX Mục 3.3.3.1 Phân đoạn sau tinh sắc ký lực Ni-NTA số băng phụ, phân đoạn protein sau qua cột Sephacryl S-100 có băng protein chứng tỏ qua lần sắc ký protein tái tổ hợp đạt độ tinh cần thiết để thực nghiên cứu Nồng độ protein phân đoạn thu qua cột sắc ký lọc gel xác định phương pháp Bradford mg/ml (Bảng 10, Phụ lục) Kết hợp với kết định lượng phần mềm ImageJ, xác định độ Trx-CTX qua lần sắc ký 96,6 % (Bảng 3.3) Như vậy, hiệu suất trình lên men biểu tinh Trx-CTX bình tam giác đạt mg/200 ml dịch tế bào nuôi cấy, tương đương với 45 mg/L dịch tế bào nuôi cấy 3.4.2 Lên men thu sinh khối E coli BL21 (DE3) mang plasmid CTXpET32c qui mô lít/ mẻ Các thử nghiệm xác định đặc tính Trx-CTX đòi hỏi lượng protein tái tổ hợp lớn, tiến hành nghiên cứu lên men thu protein quy mô 4lít/mẻ sử dụng hệ thống lên men BioFlo 110 Fermentor (Mỹ) (Hình 3.18)     18   Hình 3.18 Mối tương quan thời gian nuôi cấy giá trị OD600nm dịch lên men chủng vi khuẩn E coli BL21(DE3) biểu Trx-CTX Đường màu xanh: Đường cong sinh trưởng tế bào lên men bình tam giác 500 ml; Đường màu đỏ: Đường cong sinh trưởng tế bào lên men qui mô lít/mẻ Kết Hình 3.18 cho thấy, đường màu đỏ đường cong sinh trưởng chủng tế bào E coli BL21 (DE3) biểu bình lên men lít Tại thời điểm 2,7 sau cấy chuyển mật độ tế bào OD600nm đạt 0,795 tiến hành cảm ứng với IPTG đến nồng độ cuối 0,5 mM Sau 10 nuôi cấy mật độ tế bào đạt lớn 5,0 sau giảm dần Đây thời gian thích hợp để dừng trình lên men Trong mật độ tế bào nuôi bình tam giác đạt giá trị cực đại sau 14 nuôi cấy 4,7 Điều lý giải nuôi cấy hệ thống lên men với ưu việt pH môi trường nồng độ oxy hòa tan điều chỉnh ổn định nên tốc độ sinh trưởng vi khuẩn bình lên men nhanh bình tam giác Sinh khối tế bào thu lại theo đơn vị 200 ml dịch nuôi cấy tiến hành siêu âm phá tế bào tinh chế Trx-CTX sắc ký lực sắc ký lọc gel Hiệu suất trình lên men, biểu tinh đạt 12 mg/200 ml dịch sinh khối tế bào lên men hay tương đương 60 mg/L dịch sinh khối tế bào Như lên men hệ thống BioFlo, hiệu suất sinh tổng hợp Trx-CTX tăng lên 60 mg/L dịch sinh khối tế bào 3.4.3 Tinh peptide CTX   Gen mã hóa cho CTX thiết kế vector pET32c+ dạng sơ đồ hóa Hình 3.19 Enterokinase cắt sau gốc Lys trình tự amino acid Asp     19   – Asp – Asp - Asp - Lys đảm bảo phần peptide thu không chứa thêm amino acid đoạn dung hợp Hình 3.19 Sơ đồ thiết kế gen mã hóa CTX vector pET32c+ Phản ứng cắt protein dung hợp Trx-CTX Enterokinase thực 25oC khoảng 16 để loại bỏ phần dung hợp kèm Hỗn hợp peptide thu được kiểm tra điện di SDS-PAGE (Hình 3.20) Hình 3.20 SDS-PAGE hỗn hợp peptide sau cắt Enterokinase M: thang protein chuẩn; ĐC 1: Hỗn hợp peptide thu sau xử lý với Enterokinase Kết thể Hình 3.20 cho thấy, hỗn hợp peptide thu sau thuỷ phân Enterokinse cho băng protein với kích thước khác Băng thấp có kích thước nhỏ 14,4 kDa so với thang protein chuẩn, có khả peptide CTX loại bỏ Trx Băng thứ nằm có kích thước nằm khoảng 14,4 18,4 kDa, đoạn protein dung hợp Trx vector pET32c băng có kích thước khoảng 20,5 kDa protein dung hợp Trx-CTX không bị cắt hoàn toàn Hỗn hợp peptide thu tiếp tục tinh cột siêu lọc VIVASPIN 500 (VIVASCIENCE - cho     20   phân tử có kích thước nhỏ kDa qua) để thu lại peptide CTX Dịch qua cột xác định nồng độ phương pháp Bradford, từ 10 mg Trx-CTX thu lại 0,9 mg peptide CTX (theo lý thuyết hiệu suất phản ứng cắt đạt 100% phải thu 1,315 mg khối lượng CTX chiếm khoảng 1/7,6 phân tử TrxCTX) Như hiệu suất phản ứng đạt 76% phản ứng cắt Enterokinase thực không hoàn toàn Peptide CTX thu được kiểm tra điện di SDS-PAGE 12,6 % (Hình 3.21) xác định nồng độ phương pháp Bradford (Bảng 11, Phụ lục) Hình 3.21 Điện di peptide CTX tinh chế sau loại bỏ đuôi Trx His.Tag cột siêu lọc VIVASPIN 500 (VIVASCIENCE) M: thang protein chuẩn; ĐC 1: Peptide CTX sau loại bỏ đuôi His.Tag Trx cột siêu lọc VIVASPIN 500 (VIVASCIENCE) Kết cho thấy thu băng protein nhất, có kích thước < 14 kDa Sử dụng phần mềm định lượng ImageJ để xác định hàm lượng băng peptide CTX Kết hợp phương pháp cho thấy CTX tái tổ hợp tinh chế có độ 97,5% (Bảng 3.3) Như vậy, trình tinh cột Vivaspin đạt độ cao, đảm bảo chất lượng cho thí nghiệm Hàm lượng protein pha tan sau siêu âm tế phá bào từ lít dịch lên men xác định phương pháp Bradford 500 mg Như trình tinh CTX tái tổ hợp trình bày Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.1 Hiệu suất thu hồi sau tinh Trx-CTX tái tổ hợp từ lít dịch sinh khối tế bào lên men chủng E coli BL21 DE3 chứa plasmid CTXpET32c Nồng độ protein (mg/ml) Thể tích (ml) Tổng protein (mg) Hiệu suất thu hồi (%) Dịch phá tế bào siêu âm 5,0 100 500 100 Sắc ký lực Ni-NTA 3,75 20 75 15 Sắc ký lọc gel Sephacryl S-100 5,0 12 60 12 Bước tinh     21   Bảng 3.2 Hiệu suất thu hồi sau tinh CTX từ Trx-CTX Bước tinh   Nồng độ protein (mg/ml)   Thể tích (ml) Tổng peptide (mg)   Hiệu suất thu hồi (%)   Dịch chứa Trx-CTX thuỷ phân với enterolkinase   1,00   10 10   100   Tinh qua cột Vivaspin 500   0,09   10 0,9     Từ lít dịch sinh khối tế bào lên men, 60 mg Trx-CTX tinh với hiệu suất thu hồi 12% độ 96,6% (Bảng 3.3) Protein dung hợp thu tiếp tục xử lý với enterokinase để loại bỏ trình tự Trx tinh CTX cột siêu lọc Vivaspin Từ 10 mg Trx-CTX thu 0,9 mg peptide CTX với hiệu suất thu hồi 9% (Bảng 3.2) độ 97,5% (Bảng 3.3) Nồng độ(µg/ml) Nồng độ(µg/ml) (Xác định Bradford) (Xác định ImageJ) Sắc ký lực tinh Trx-CTX 3750 Sắc ký lọc gel S100 tinh TrxCTX Tinh CTX cột Vivaspin Các bước tinh Độ (%) Các bước tinh 3370,0 90,0 Sắc ký lực tinh Trx-CTX 5000 4832,0 96,6 Sắc ký lọc gel S100 tinh Trx-CTX 90 87,5 97,5 Tinh CTX cột Vivaspin 3.5 XÁC ĐỊNH KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ CTX BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHỐI PHỔ MALDI -TOF Sau tinh sạch, băng peptide thu lại xử lí theo phương pháp mô tả Mục 2.2.1.16 để tiến hành phân tích phổ khối Nhờ lượng tia laser, phân tử matrix phân ly thành proton (H+), làm ion hoá phân tử CTX Dưới tác dụng điện trường, ion CTX-H+ xác định thời gian bay (Time of flight, TOF) kết thu cách sử dụng phần mềm Analyst QS V1.1 (Hình 3.22) Kết xác định phổ khối MALDI-TOF (Hình 3.24) cho thấy xuất đỉnh có cường độ mạnh với giá trị m/z 2769 amu, tương ứng với ion phân tử CTX-H+, đỉnh lại phổ phân tử dung môi Như khối lượng phân tử CTX 2769 Da Kết phù hợp với tính toán lý thuyết khối lượng peptide tái tổ hợp thiết kế đồng thời phù hợp với khối lượng peptide sở liệu Expasy (http://web.expasy.org/cgi-     22   bin/peptide_mass/peptide-mass.pl) Conotoxin tái tổ hợp biểu ổn định dạng dung hợp với Trx E coli, peptide CTX sau tinh chế phương pháp sắc ký, kiểm tra độ sạch, khối lượng phân tử cách tương đối SDS-PAGE ImageJ nhận dạng xác phương pháp khối phổ 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 m/z Hình 3.22 Phổ MALDI -TOF peptide CTX tái tổ hợp tinh 3.6 HOẠT TÍNH GIẢM ĐAU CỦA CTX TÁI TỔ HỢP TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT THỰC NGHIỆM BẰNG TÁC NHÂN GÂY ĐAU FORMALIN CTX dạng tự nhiên tách chiết từ bầu độc ốc cối Conus magus chứng minh có hoạt tính giảm đau tốt (Endean et al., 1974) Hoạt tính giảm đau CTX tái tổ hợp tiến hành thử nghiệm chuột thực nghiệm mô hình Formalin theo Zhang cs (Zhang et al., 2007) với đối chứng dương Lidocain (chất giảm đau bán thị trường) Sau khảo sát liều cận liều cận CTX, liều thử nghiệm lựa chọn 3,5 µg/g thể trọng chuột Liều tiêm Lidocain lựa chọn 600 µg/g thể trọng chuột theo khuyến cáo nhà sản xuất có tác dụng giảm đau Kết thử nghiệm thể Hình 3.25 Hình 3.25 cho thấy, khoảng thời gian sau phút 20-25 phút sau tiêm, chuột nhắt tiêm CTX tái tổ hợp có thời gian liếm chân cao chút so với chuột tiêm Lidocain suốt thời gian lại thời gian liếm chân chuột tiêm CTX tái tổ hợp hẳn so với chuột tiêm nước muối sinh lý Lidocain     23   Hình 3.25 Hoạt tính giảm đau CTX tái tổ hợp mô hình Formalin Cả hai lô chuột tiêm CTX tái tổ hợp tiêm Lidocain có thời gian chuột liếm chân chuột lô tiêm nước muối sinh lý với p[...]... định lượng sự biểu hiện của protein dung hợp cho thấy tại nồng độ 0,5mM IPTG, Trx-CTX được biểu hiện nhiều nhất và gấp khoảng 4 lần so với mức độ biểu hiện của protein này khi cảm ứng bởi 0,2 mM IPTG Mức độ biểu hiện của Trx-CTX ở nồng độ IPTG là 0,7 mM gấp 3 lần so với mức độ biểu hiện của protein này ở 0,2mM Mức độ biểu hiện của Trx-CTX thay đổi không đáng kể ở nồng độ cảm ứng 0,9 mM IPTG và 1,2 mM IPTG... thước phù hợp với tính toán lý thuyết (bao gồm 109 amino acid của Trx và đuôi His.Tag) 3.3.3 Khảo sát các điều kiện biểu hiện CTX tái tổ hợp ở E coli Sau khi protein tái tổ hợp được biểu hiện, việc tối ưu hoá điều kiện biểu hiện và khả năng tan của protein tái tổ hợp đóng vai trò then chốt và quyết định cho quá trình tinh sạch cũng như kiểm tra hoạt tính của protein này Các điều kiện biểu hiện được thiết... ω-conotoxin MVIIA và so sánh trình tự amino acid của CTX với trình N01765 trên ConoSever 3.3 BIỂU HIỆN CTX TÁI TỔ HỢP 3.3.1 Thiết kế vector biểu hiện CTXpET32c Gen mã hóa cho CTX sau khi đã được tách dòng vào vector pBT và xác định đúng trình tự thiết kế được chuyển vào vector pET32c (+) để biểu hiện Vector tách dòng CTXpBT và vector pET32c cùng đồng thời được xử lý với hai enzyme giới hạn là NcoI và EcoRI... (Trx-CTX) được biểu hiện ở pha tan và không phụ thuộc vào các nhiệt độ đã nghiên cứu 3.3.3.2 Khảo sát mức độ biểu hiện của CTX tái tổ hợp theo nồng độ chất cảm ứng IPTG Kết quả khảo sát (Hình 3.12) cho thấy, mức độ biểu hiện của Trx-CTX thay đổi theo các nồng độ chất cảm ứng IPTG Bắt đầu cảm ứng với nồng độ 0,2 mM IPTG thì xuất hiện băng protein mới so với chế độ nuôi không cảm ứng (ĐC số 9) Kết quả định lượng... theo thời gian, nồng độ IPTG, độ pH của môi trường và thời gian thu mẫu là các thông số quan trọng phục vụ quá trình lên men 3.3.3.1 Khảo sát mức độ biểu hiện và độ tan của CTX tái tổ hợp theo nhiệt độ Dòng thế bào E coli BL31(DE3) chứa plasmid CTXpET32c đã được nghiên cứu biểu hiện ở 4 nhiệt độ khác nhau là 22, 28, 30 và 37oC để so sánh độ tan cũng như mức độ biểu hiện của CTX tái tổ hợp Sau 1 giờ cảm... tinh sạch cần thiết để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo Nồng độ protein của phân đoạn thu được qua cột sắc ký lọc gel được xác định bằng phương pháp Bradford là 5 mg/ml (Bảng 10, Phụ lục) Kết hợp với kết quả định lượng bằng phần mềm ImageJ, chúng tôi xác định được độ sạch của Trx-CTX qua 2 lần sắc ký là 96,6 % (Bảng 3.3) Như vậy, hiệu suất của quá trình lên men biểu hiện và tinh sạch Trx-CTX trong... CTXpET32c biểu hiện tối ưu tại 0,5 mM IPTG     14   Hình 3.12 Mức độ biểu hiện của Trx-CTX theo nồng độ chất cảm ứng IPTG M: Thang protein chuẩn SM0431 (Fermentas); ĐC 18: Protein tổng số của vi khuẩn sau 2h cảm ứng biểu hiện bằng IPTG ở các nồng độ khác nhau; ĐC 9: Protein tổng số của vi khuẩn không được cảm ứng bởi IPTG 3.3.3.3 Khảo sát mức độ biểu hiện của Trx-CTX theo pH môi trường nuôi cấy Mức độ biểu. .. C) và dòng tế bào không được cảm ứng bởi IPTG (ĐC 1).Kết quả định lượng sự biểu hiện của protein dung hợp ở 4 nhiệt độ đã khảo sát bằng phần mềm ImageJ cho thấy mức độ biểu hiện của     13   protein dung hợp ở 22oC là thấp nhất, ở 28oC tăng 1,8 lần, ở 30oC tăng 2,3 lần và ở 37oC tăng 4,5 lần so với mức độ biểu hiện của protein này ở 22oC (Bảng 1, phụ lục) Tại 37oC, protein dung hợp Trx-CTX được biểu. .. trường nuôi cấy Mức độ biểu hiện của Trx-CTX khác nhau ở các điều kiện pH (từ 6 – 8) đã nghiên cứu (Hình 3.13) Tại pH bằng 7,0, mức độ biểu hiện của Trx-CTX là cao nhất so với các pH môi trường là 6; 6,5; 7,5 và 8 Nhìn chung, chủng E coli tái tổ hợp sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp Trx-CTX tốt trong dải pH từ 6-8 song tốt nhất ở pH 7,0 (Bảng 3, phụ lục) Hình 3.13 Mức độ biểu hiện của Trx-CTX theo pH môi... nghiệm xác định đặc tính của Trx-CTX đòi hỏi một lượng protein tái tổ hợp lớn, do đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu lên men thu protein này ở quy mô 4lít/mẻ sử dụng hệ thống lên men BioFlo 110 Fermentor (Mỹ) (Hình 3.18)     18   Hình 3.18 Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy và giá trị OD600nm dịch lên men chủng vi khuẩn E coli BL21(DE3) biểu hiện Trx-CTX Đường màu xanh: Đường cong sinh trưởng của ... Biolab Qiagen, Sigma…       2.2 Phương pháp nghiên cứu Luận án sử dụng ba nhóm phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nhóm phương pháp tạo dòng, biểu hiện, tinh xác định CTX tái tổ hợp • Nhân gen mã hoá cho... ConoSever 3.3 BIỂU HIỆN CTX TÁI TỔ HỢP 3.3.1 Thiết kế vector biểu CTXpET32c Gen mã hóa cho CTX sau tách dòng vào vector pBT xác định trình tự thiết kế chuyển vào vector pET32c (+) để biểu Vector... enterokinase cột siêu lọc VIVASPIN 500 • Xác định khối lượng phân tử CTX khối phổ 2.2.2 Nhóm phương pháp xác định đặc tính CTX tái tổ hợp • Thử nghiệm hoạt tính giảm đau peptide CTX mô hình chuột