BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN BÍCH NGỌC NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP, TÁC DỤNG TĂNG LỰC CỦA CÂY SÂM CAU (Curculigo orchioides Gaertn., Hypoxidaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN BÍCH NGỌC NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP, TÁC DỤNG TĂNG LỰC CỦA CÂY SÂM CAU (Curculigo orchioides Gaertn., Hypoxidaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: Ngƣời hƣớng dẫn: 60720406 TS Phƣơng Thiện Thƣơng PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển HÀ NỘI 2015 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Phương Thiện Thương (Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu) PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển (Bộ môn Dƣợc cổ truyền - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội), ngƣời thầy hƣớng dẫn, bảo em, góp ý giúp đỡ em, đƣa ý kiến quý báu để hoàn thiện đề tài Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Văn Khiêm (Trung tâm Nghiên cứu trồng chế biến thuốc) nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn thời hạn Em xin chân thành cảm ơn cán bộ, nhân viên khoa Hóa Phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dƣợc liệu đặc biệt ThS Vũ Văn Tuấn - ngƣời theo sát, hƣớng dẫn cho em trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn chị khoa Dƣợc lý – Sinh hóa, Viện Dƣợc liệu tận tình, tạo điều kiện thuận lợi hết lòng giúp đỡ em suốt trình thực luận văn Sau cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, anh trai bạn bè bên cạnh ủng hộ, động viên em suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu này! Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2015 Học viên DS Nguyễn Bích Ngọc MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI CURCULIGO GAERTN 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Curculigo Gaertn 1.1.3 Phân bố chi Curculigo Gaertn 1.1.4 Đặc điểm số loài thuộc chi Curculigo Gaertn Việt Nam 1.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY SÂM CAU 1.2.1 Đặc điểm thực vật phân bố 1.2.2 Thành phần hóa học 1.2.3 Độc tính tác dụng sinh học Curculigo orchioides Gaertn 14 1.2.4 Công dụng sâm cau 19 1.2.5 Các vấn đề cần nghiên cứu 20 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VẦ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 21 2.2 PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Thuốc thử, dung môi, hoá chất 21 2.2.2 Trang thiết bị máy móc 21 2.2.3 Động vật thí nghiệm 22 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 22 2.3.2 Nghiên cứu độc tính cấp tác dụng tăng lực 23 2.4 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 25 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26 3.1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 26 3.1.1 Định tính phản ứng ống nghiệm 26 3.1.2 Định tính phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng 28 3.2 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ THÂN RỄ SÂM CAU 29 3.2.1 Chiết xuất 29 3.2.2 Phân lập 29 3.2.3 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập đƣợc 32 3.2.4 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc 34 3.3 ĐỘC TÍNH CẤP 38 3.4 TÁC DỤNG TĂNG LỰC CỦA CAO ETHANOL SÂM CAU TRÊN MÔ HÌNH TRỤ QUAY ROTA-ROD 39 CHƢƠNG BÀN LUẬN 42 4.1 VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 42 4.1.1 Kết định tính 42 4.1.2 Kết phân lập chất từ thân rễ sâm cau 43 4.2 VỀ ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG TĂNG LỰC 46 4.2.1 Độc tính cấp 46 4.2.2 Tác dụng tăng lực 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AchE : Acetylcholin esterase ALP : Alkalin phosphatase ALT : Alanin aminotransferase AMPA : α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionic acid AST : Aspartat aminotransferase BDNF : Yếu tố dinh dƣỡng thần kinh xuất phát từ não CDCl3 : CHCl3 (với 2H đƣợc ký hiệu D) DEPT :Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EGCG : Epigallocatechin gallat FSH : Hormon kích thích nang trứng GGT : γ-glutamyl transferase GLC : Sắc ký khí lỏng HPA : Hạ đồi - Tuyến yên - Tuyến thƣợng thận HPLC : Sắc ký lỏng hiệu cao IC50 : Nồng độ ức chế 50% đối tƣợng thử (Inhibitor concentration) IR : Phổ hồng ngoại LD50 : Liều gây chết 50% đối tƣợng thử LH : Hormon kích thích thể vàng MC3T3-E1 : Tế bào tạo hình xƣơng MMP-1 : Matrix metalloproteinase-1 MS : Phổ khối (Mass Spectroscopy) NMDA : N-methyl-D-aspartat HMG-CoA : Hydroxy-3-methylglutaryl coenzym A H-NMR 13 C-NMR : Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton : Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C m-RNA : ARN thông tin r-RNA : ARN ribosom ROS : Gốc tự (Reactive Oxygen Spieces) UV : Phổ tử ngoại (Ultra Violet Spectroscopy) VEGF : Yếu tố tăng trƣởng nội mô mạch máu YHCT : Y học cổ truyền βAP : β-amyloid peptid δ : Độ dịch chuyển hóa học (đơn vị tính ppm) DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU STT Bảng Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Tên bảng Kết định tính dƣợc liệu thân rễ sâm cau phản ứng hóa học Kết định tính cắn phân đoạn thân rễ sâm cau phản ứng hóa học Số liệu phổ 1H (500 MHz) 13 C-NMR (125 MHz) SC1 SC2 Kết thử độc tính cấp cao đặc sâm cau Thời gian bám trung bình trụ quay chuột thời điểm trƣớc sau uống cao đặc sâm cau 60 phút Thời gian bám trung bình trụ quay chuột thời điểm trƣớc sau uống cao đặc sâm cau ngày Thời gian bám trung bình trụ quay chuột thời điểm trƣớc sau uống cao đặc sâm cau 14 ngày Trọng lƣợng trung bình chuột thời điểm ngày 0, ngày 7, ngày 14 Trang 26 27 35 38 39 39 40 40 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Hình Tên hình Hình 1.1 Curculigo orchioides Gaertn Hình 2.1 Cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) 21 Hình 3.1 Sắc ký đồ định tính nhóm phenolic thân rễ sâm cau 28 Hình 3.2 Sắc ký đồ định tính nhóm saponin thân rễ sâm cau 29 Hình 3.3 Sơ đồ chiết xuất, phân đoạn chất từ thân rễ sâm cau 31 Hình 3.4 Hình 3.5 Kiểm tra chất phân lập đƣợc hệ dung môi số 33 Hình 3.6 Kiểm tra chất phân lập đƣợc hệ dung môi số 33 Hình 3.7 Quy trình phân lập chất từ cắn ethyl acetat thân rễ sâm cau Công thức cấu tạo hợp chất SC1, SC2, SC3 tƣơng tác HMBC hợp chất SC2 Trang 32 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây sâm cau gọi ngải cau, cồ nốc lan, có tên khoa học Curculigo orchioides Gaertn thuộc họ Tỏi voi lùn (Hypoxidaceae) thân cỏ, mọc hoang tỉnh vùng núi phía Bắc nƣớc ta Ở Trung Quốc, thân rễ sâm cau đƣợc tán thành bột, sắc nƣớc làm thuốc bổ, trị suy nhƣợc thể, đau lƣng, viêm khớp viêm thận mạn tính Ở Ấn Độ, Nepal Philippines thân rễ sâm cau dùng làm thuốc lợi tiểu, tăng cƣờng chức tình dục, chữa bệnh da, loét dày tá tràng, trĩ, lậu…; sâm cau thành phần thuốc cổ truyền điều trị sỏi tiết niệu Ấn Độ [16] Ở Papua New Guinea, thân rễ sâm cau đƣợc hơ nóng cho mềm chà xát thể để tránh thụ thai [42] Theo Y học cổ truyền Việt Nam, sâm cau có vị cay, tính ấm, có tác dụng trợ dƣơng, trừ hàn, cƣờng dƣơng, mạnh gân xƣơng [16] Đồng bào dân tộc thƣờng sử dụng thân rễ sâm cau (thƣờng gọi tiên mao) nhƣ loại thuốc bổ - dùng riêng kết hợp với vị thuốc khác - để điều trị bệnh nhƣ: liệt dƣơng, đau lƣng, viêm khớp, viêm thận, vàng da, vô sinh [15] Mặc dù đƣợc ngƣời dân sử dụng từ lâu dân gian, nhƣng Việt Nam chƣa có nhiều nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng dƣợc lý dƣợc liệu Năm 2001, tác giả Nguyễn Thị Phƣơng Lan công bố kết định tính sơ thành phần hóa học, tác dụng chống oxy hóa tác dụng tăng lực dƣợc liệu sâm cau thu hái Tuyên Quang [12] Để có thêm sở khoa học cho việc sử dụng sâm cau làm thuốc, đồng thời phát huy giá trị, vai trò sâm cau y dƣợc học, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học thử độc tính cấp, tác dụng tăng lực sâm cau – Curculigo orchioides Gaertn., họ Hypoxidaceae” với mục tiêu: - Nghiên cứu thành phần hóa học thân rễ sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn., Hypoxidaceae) - Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc 3-4 chất tinh khiết thân rễ sâm cau - Đánh giá độc tính cấp, tác dụng tăng lực cắn chiết ethanol từ thân rễ sâm cau PHỤ LỤC 5: KHỐI LƢỢNG CHUỘT Khối lƣợng Lô Lô Lô (nƣớc cất) (sâm cau 0,2 g/kg) (sâm cau 0,5 g/kg) STT m0 m7 m14 m0 m7 m14 m0 m7 m14 20,0 21,0 22,0 22,0 23,0 24,0 22,1 24,3 26,3 21,4 22,7 24,0 22,0 22,5 25,0 21,6 22,3 23,5 22,1 22,8 24,0 18,4 19,4 23,0 21,8 24,6 26,4 21,1 21,5 24,0 21,0 23,4 26,0 21,0 22,8 23,5 18,4 22,4 24,0 19,7 23,0 24,0 19,3 20,2 22,3 18,8 21,4 25,0 19,8 22,6 23,0 19,6 20,9 21,4 20,3 21,5 23,7 18,0 18,5 20,0 19,1 22,7 23,8 20,5 18,8 19,0 18,7 19,9 21,0 19,8 21,6 24,5 18,2 19,0 20,1 19,2 19,8 21,0 18,2 19,1 20,1 10 19,7 24,2 26,5 10 19,5 20,4 22,0 10 18,2 21,9 23,6 11 18,3 20,2 24,0 11 18,2 18,9 20,0 11 18,5 20,2 16,8 12 18,6 21,0 22,8 12 20,1 22,3 23,0 12 20,6 22,7 24,6 13 18,6 20,7 23,6 13 19,8 22,2 23,0 13 22,0 23,5 24,7 14 18,6 19,4 20,5 14 20,8 20,5 23,0 14 21,4 23,4 25,9 15 19,0 21,5 23,0 15 18,0 19,8 22,0 15 20,2 24,4 27,2 16 18,6 18,9 20,6 16 20,0 22,0 24,0 16 20,0 22,1 25,3 17 18,5 19,7 21,1 17 21,9 23,6 25,0 17 17,8 20,5 23,9 18 18,0 20,6 24,0 18 19,1 20,3 21,6 (m0, m7, m14: khối lượng chuột ngày 0, ngày 7, ngày 14) PHỤ LỤC 6: THỜI GIAN BÁM CỦA CHUỘT TRÊN TRỤ QUAY Lô (nƣớc cất) n 10 11 12 13 14 15 16 17 18 T0 (giây) 66 234 77 62 56 1342 255 251 1670 80 200 46 45 516 314 512 97 T1 (giây) 12 3256 72 272 88 984 3600 3278 1713 689 266 197 183 165 104 65 18 T7 (giây) 13 2654 23 1549 2575 2267 1886 2560 1116 19 280 18 16 2622 126 3478 43 Lô (sâm cau 0,2 g/kg) T14 (giây) 3256 60 56 60 4685 5432 3468 560 262 1600 61 68 172 131 1800 79 T0 (giây) 1678 65 180 156 72 120 255 1504 169 180 367 92 101 62 255 86 64 54 T1 (giây) 3678 1200 2465 2546 416 2356 3567 3980 1896 543 325 129 112 107 87 61 31 24 T7 (giây) 4879 803 1507 68 4656 4087 4136 1942 3988 3678 1086 233 214 44 2530 74 88 45 T14 (giây) 5043 166 3030 520 2029 133 4530 4786 4657 135 2047 180 2056 372 2176 903 226 78 Lô (sâm cau liều 0,5 g/kg) T0 (giây) 208 586 1347 143 64 256 1200 301 157 1246 434 51 107 150 76 44 131 78 T1 (giây) 146 4600 2403 2654 96 3600 1566 3789 2558 1715 1703 1031 843 158 58 50 48 24 T7 (giây) 3789 1380 3780 4564 140 4876 4214 4656 3890 1418 1158 1863 477 967 99 266 256 250 T14 (giây) 4600 2733 4568 478 240 3240 6640 6840 4680 3686 5400 79 100 3800 204 1100 225 465 [...]... (2001) đã đƣợc công 6 bố Nghiên cứu đã xác định đƣợc tên khoa học của cây sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn. ) mọc hoang ở Sơn Dƣơng, Hà Giang, xác định sơ bộ thành phần hóa học, tác dụng chống oxy hóa và tăng lực của thân rễ sâm cau Theo đ , kết quả định tính cho thấy thân rễ sâm cau Việt Nam có chứa phytosterol, đƣờng kh , saponin, chất béo, caroten Ngoài ra nghiên cứu cũng phân lập đƣợc một hợp chất... hoạt tính hormon sinh dục nam và kích thích miễn dịch [16 ], [42] Một số nghiên cứu khác cho thấy, sâm cau có tác dụng làm giảm ngƣỡng nghe, cải thiện chức năng trung tâm thính giác, tổ chức ốc tai của chuột, vì vậy mà sâm cau có thể đƣợc sử dụng nhƣ một sản phẩm tự nhiên điều trị chứng giảm thính lực do tiếng ồn ở chuột [30] 1.2.4 Công dụng của sâm cau Tính v , công năng: sâm cau vị cay tính ấm, độc vào... đƣợc thành phần hóa học chính (nhóm curculigoside) và tác dụng theo y học cổ truyền của dƣợc liệu sâm cau Bên cạnh đ , loài Curculigo orchioides ở Trung Quốc đã đƣợc xác định là có độc tính và đã xác định đƣợc LD50 Tuy nhiên, ở Việt Nam chƣa có nghiên cứu về độc tính của dƣợc liệu sâm cau Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài này với đối tƣợng nghiên cứu là dƣợc liệu sâm cau (Curculigo orchioides. .. Trung Quốc, Campuchia, Nepal, Thái Lan, Việt Nam [8 ], [25] Ở Việt Nam: gặp ở Lào Cai, Hà Tây, Ninh Bình vào đến Quảng Trị [8 ], [11] 1.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY SÂM CAU 1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố Tên Việt Nam: sâm cau, ngải cau, cồ nốc lan [8] Cây thảo, lâu năm, cao khoảng 20 - 40 cm Thân rễ mập, hình trụ dài, mọc thẳng, thót lại hai đầu, mang nhiều rễ phụ [8] Lá 3 - 6 hình , mọc tụ họp thành túm, xếp... các nghiên cứu của Rao và cộng sự (1996) đã cho thấy tác dụng chống nhiễm trùng và bảo vệ gan của C orchioides Nhóm tác giả đã chỉ ra tác dụng bảo v , chống độc cho gan là do sâm cau có tác dụng đối kháng với một số chất có khả năng gây độc cho gan nhƣ rifampicin [47 ], [48] Các curculigenin A và curculigol đã đƣợc nghiên cứu và sàng lọc thấy có tác dụng chống độc cho gan do chúng đối kháng với tác dụng. .. orchioides Gaertn. , họ Hypoxidaceae) đƣợc thu hái tại Việt Nam với mục tiêu là làm rõ hơn về thành phần hóa học chính của thân rễ sâm cau; thử độc tính cấp và thử tác dụng tăng lực nhằm xác định độ an toàn của dƣợc liệu, tạo thêm cơ sở khoa học cho việc giải thích công dụng của sâm cau trong y học cổ truyền và định hƣớng cho việc phát triển thuốc từ dƣợc liệu này trong y học hiện đại 20 CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ... PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu là thân rễ của cây sâm cau thu hái tại Kon Tum, Tây Nguyên vào tháng 8 năm 2013 Tên khoa học của mẫu nghiên cứu đƣợc Tiến sĩ Phạm Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên Dƣợc liệu, Viện Dƣợc liệu giám định là Curculigo orhioides Gaertn (phụ lục 1) Hình 2.1: Cây sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn. ) 2.2 PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 2.2.1 Thuốc th , dung... flavon; alcaloid [24 ], [42] Bên cạnh đó cây còn chứa một số thành phần khác nhƣ: steroid; đƣờng tự do nhƣ glucose, manose, xylose; chất nhầy; hemicellulose; polysaccharid và acid glucuronic [24 ], [64] Ở Việt Nam, nghiên cứu về cây sâm cau (Curculigo orchioides) nói chung và thành phần hóa học của loài này nói riêng là một vấn đề mới Cho đến nay, chỉ có một nghiên cứu về cây sâm cau của tác giả Nguyễn Thị... liệu thu đƣợc từ thực nghiệm với các tài liệu đã công bố 2.3.2 Nghiên cứu độc tính cấp và tác dụng tăng lực 2.3.2.1 Đánh giá độc tính cấp Đánh giá độc tính cấp của CĐ sâm cau qua đƣờng uống theo Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ Dược thảo của Viện Dược liệu (2006) [17 ], và Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc theo tác giả Đỗ Trung Đàm (1996) [10] Chuột nhắt trắng thực nghiệm... học và Công nghệ Việt Nam - Thử độc tính cấp và nghiên cứu tác dụng tăng lực tại Khoa Dƣợc lý – Sinh hóa, Viện Dƣợc liệu 25 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 3.1.1 Định tính bằng các phản ứng ống nghiệm Tiến hành định tính, xác định sơ bộ thành phần hóa học của dƣợc liệu thân rễ sâm cau bằng các phản ứng hoá học đặc trƣng cho từng nhóm hoạt chất Kết quả định tính đƣợc thể hiện trong bảng ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN BÍCH NGỌC NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP, TÁC DỤNG TĂNG LỰC CỦA CÂY SÂM CAU (Curculigo orchioides Gaertn., Hypoxidaceae). .. dƣợc học, tiến hành đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học thử độc tính cấp, tác dụng tăng lực sâm cau – Curculigo orchioides Gaertn., họ Hypoxidaceae” với mục tiêu: - Nghiên cứu thành phần hóa học. .. PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 22 2.3.2 Nghiên cứu độc tính cấp tác dụng tăng lực 23 2.4 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 25 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN