BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI CHU THỊ NHƢ QUỲNH BƢỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƢỢNG NGUYÊN LIỆU VÀ SẢN PHẨM BỘT ĐÔNG KHÔ CHỨA TETRODOTOXIN 0,1% TỪ CÁ NÓC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI CHU THỊ NHƢ QUỲNH BƢỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƢỢNG NGUYÊN LIỆU VÀ SẢN PHẨM BỘT ĐÔNG KHÔ CHỨA TETRODOTOXIN 0,1% TỪ CÁ NÓC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60720410 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS.Nguyễn Mạnh Tuyển PGS.TS Trần Việt Hùng HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết sơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn PGS.TS Trần Việt Hùng - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển - Trường đại học Dược Hà Nội, người thầy trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, giúp đỡ với dẫn khoa học quý giá suốt trình triển khai nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến thầy cô Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn hóa phân tích môn khác Trường đại học Dược Hà Nội tận tình bảo, giúp đỡ suốt trình học tập trường thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc cán Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, cán Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam, Viện Pháp y Quốc gia đồng nghiệp giúp đỡ suốt thời gian thực nghiên cứu Cuối cùng, xin cảm ơn người thân gia đình bạn bè động viên, khích lệ suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2015 Học viên DS Chu Thị Nhƣ Quỳnh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 TETRODOTOXIN 1.1.1 Danh pháp, công thức tính chất hóa lý TTX 1.1.2 Độc tính tác dụng TTX 1.1.4 Ứng dụng TTX y học 1.1.5 Nguồn cung cấp TTX 1.2 CÁ NÓC 10 1.2.1 Đặc điểm sinh học phân bố cá 10 1.2.2 Độc tố cá 11 1.2.3 Thành phần độc tố cá 11 1.2 MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG TTX 12 1.2.1 Phƣơng pháp sinh hóa chuột (MBA) 12 1.2.2 Phƣơng pháp ELISA 13 1.2.3 Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector UV, FLD 14 1.2.4 Phƣơng pháp khối phổ 15 1.2.5 Phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ GS-MS 17 1.2.6 Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ 17 1.2.7 Xác định cấu trúc cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) 18 1.3 BỘT ĐÔNG KHÔ TTTX 0,1% 20 CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 23 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 23 2.2.1 Nguyên liệu 23 2.2.2 Dụng cụ, máy móc, thiết bị 24 2.2.3 Hóa chất 26 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Chuẩn bị mẫu 26 26 2.3.2 Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng TTX 27 2.3.3 Xác định số tiêu chất lƣợng nguyên liệu TTX thô sản phẩm bột đông khô TTX 0,1% 31 2.4 PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 33 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34 3.1 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG TTX 34 3.1.1 Định tính TTX TLC 34 3.1.2 Định tính TTX ESI-MS/MS 35 3.1.3 Xây dựng phƣơng pháp định tính định lƣợng TTX LC-MS/MS 37 3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƢỢNG NGUYÊN LIỆU VÀ SẢN PHẨM BỘT ĐÔNG KHÔ TTX 0,1% 3.2.1 Kết xác định số tiêu chất lƣợng nguyên liệu TTX thô 44 44 3.2.2 Kết xác định số tiêu chất lƣợng bột đông khô TTX 0,1% 51 CHƢƠNG BÀN LUẬN 55 4.1 VỀ XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG TTX 55 4.2 VỀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƢỢNG NGUYÊN LIỆU VÀ SẢN PHẨM BỘT ĐÔNG KHÔ TTX 0,1% 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng anh Tên tiếng việt Atmospheric pressure chemical Ion hóa hóa học áp suất khí ionization CI Chemical Ionization Ion hóa hóa học ESI Electron spray ionization Ion hóa phun sƣơng điện FAB Fast atom bombardment Bắn phá nhanh nguyên tử APCI GC-MS HILIC HPLC HR FTICR MS ICP-MS LC-MS Gas chromatography - Mass spectrometry Sắc ký khí khối phổ Hydrophilic interaction liquid Sắc ký lỏng tƣơng tác thân chromatography nƣớc High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao High resolution fourier transform ion cyclotron Phổ khối phân giải cao resonance mass spectrometry Inductively coupled plasma Liquid chromatography–mass spectrometry Phổ khối phân tích nguyên tử Sắc ký lỏng khối phổ Liều gây chết 50% động vật LD50 Lethal dose 50 LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lƣợng Matrix assisted laser Phản hấp thụ ion hóa desorption ionization laser Median lethal dose Liều chết trung bình MALDI MLD thí nghiệm NMR Nuclear magnetic resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân SRM Selected reaction monitoring Chế độ chọn lọc ion TTX Tetrodotoxin TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số thông tin độ độc TTX analog Bảng 3.2 Khảo sát số điều kiện sắc ký 38 Bảng 3.3 Kết khảo sát độ thích hợp hệ thống 41 Bảng 3.4 Kết khảo sát độ tuyến tính phƣơng pháp 41 Bảng 3.5 Kết khảo sát độ lặp lại 42 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ thu hồi 43 Bảng 3.7 Hàm lƣợng TTX TTX thô 44 Bảng 3.8 Dữ liệu phổ chất đƣợc phân lập 45 Bảng 3.9 TTX analog TTX thô 50 Bảng 3.10 Độ ẩm bột đông khô TTX 0,1% 52 Bảng 3.11 Tiêu chuẩn chất lƣợng bột đông khô TTX 0,1% 52 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc phẳng (A) cấu trúc 3-D (B) phân tử TTX Hình 1.2 Cấu trúc số analog TTX Hình 1.3 Một số loài chứa độc tố TTX tự nhiên [47] 10 Hình 1.4 Kỹ thuật ESI-MS 16 Hình 1.5 Sơ đồ khái quát nội dung nghiên cứu dự án 20 Hình 2.6 Hình ảnh mẫu cá 23 Hình 2.7 Máy sắc ký lỏng khối phổ Thermo Finigan LCQ Advantage Max 24 Hình 2.8 Hệ thống LC-MS ba tứ cực nối tiếp Thermo TSQ Quantum Ultra 25 Hình 2.9 Hệ thống phổ khối phân giải cao Varian 900-MS Series FTMS 25 Hình 2.10 Thiết bị cộng hƣởng từ hạt nhân Bruker Avance AM500FT- NMR BioSpin NMR 25 Hình 2.11 Thiết bị đông khô Modulyod (Thermo) 25 Hình 2.12 Quy trình chiết xuất TTX thô 31 Hình 3.13 Bản mỏng triển khai hai hệ pha động 34 Hình 3.14 Khảo sát LOD phƣơng pháp TLC 35 Hình 3.15 Phổ ESI - MS mẫu chuẩn TTX 1μg/ml 36 Hình 3.16 Phổ MS/MS chuẩn TTX μg/ml 36 Hình 3.17 Phổ MS/MS bột đông khô TTX 0,1% 37 Hình 3.18 Sắc ký đồ phân tích TTX theo điều kiện sắc ký A, B, C, D 39 Hình 3.19 Sắc ký đồ dung dịch mẫu placebo (a), mẫu TTX chuẩn 2,5µg/ml (b), mẫu thử bột đông khô (c) 40 Hình 3.20 Đồ thị biểu mối tƣơng quan nồng độ TTX diện tích píc 42 Hình 3.21 Lọ bột đông khô TTX 0,1% 51 ĐẶT VẤN ĐỀ Tetrodotoxin (TTX) chất độc thần kinh mạnh chƣa có thuốc giải độc [12] Là chất độc nhƣng TTX lại có tác dụng có ý nghĩa lớn y học: giảm đau ung thƣ; phòng tan huyết nhồi máu tim; dùng làm thuốc cai nghiện, thuốc gây tê; dùng nghiên cứu sinh lý màng tế bào…[4], [22], [27] TTX cho hiệu điều trị với mức liều thấp thấp cỡ microgam/kg [4], [29] Đặc biệt, TTX có tác dụng giảm đau mạnh morphin nhƣng không gây nghiện [19] Rõ ràng, TTX có nhiều ƣu điểm so với thuốc sử dụng Với nhiều tác dụng ý nghĩa nhƣng chất độc mạnh nên năm gần TTX đƣợc nghiên cứu phát triển thành sản phẩm thuốc Hiện nay, công ty WEX Pharmaceticals Inc Canada phát triển sản phẩm chứa TTX làm thuốc giảm đau điều trị ung thƣ, thuốc gây tê [4], [9] Tại Việt Nam, Bùi Quang Huấn cộng sử dụng chiết xuất từ cá chứa TTX chế phẩm Bahudo dùng làm thuốc điều trị cai nghiện [7] Các sản phẩm đƣợc nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng cho hiệu điều trị tốt với độc tính TTX đƣợc kiểm soát Nhƣ vậy, tiềm sử dụng TTX bào chế sản phẩm làm thuốc lớn Hiện nay, TTX chủ yếu chiết xuất, phân lập từ nguồn tự nhiên, cá nguồn cung cấp [4], [18], [30] Tại Việt Nam, cá đƣợc quan tâm thực phẩm có giá trị thƣơng mại lớn [1] nhƣng chƣa đƣợc quan tâm khai thác phục vụ y học Trong đó, biển Việt Nam cho có tiềm khai thác TTX từ cá lớn với khoảng 21 loài đƣợc xác định có mang độc tố [13] Với nhiều tác dụng có ý nghĩa cho chăm sóc sức khỏe cộng đồng sử dụng nguồn nguyên liệu sẵn có Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng (VKNTTW) thực đề tài “Nghiên cứu phát xây dựng quy trình phân lập tetrodotoxin (TTX) số độc tố thần kinh từ họ cá Phụ lục 6: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR phổ khối phân giải cao CAN4 Phổ khối phân giải cao ESI FTICR MS CAN PL - 18 Phổ 1H-NMR CAN4 PL - 19 Phổ 13C- NMR CAN4 PL - 20 Phổ HMBC CAN4 PL - 21 Phổ HSQC CAN4 PL - 22 Phục lục 7: Các phổ cộng hƣởng từ hạt nhân phổ khối phân giải cao CAN5 Phổ khối phân giải cao ESI FTICR MS CAN5 PL - 23 Phổ 1H- NMR CAN5 PL - 24 Phổ 13C- NMR CAN5 PL - 25 Phổ HMBC CAN5 PL - 26 Phổ HSQC CAN5 PL - 27 Phụ lục 8: Các phổ cộng hƣởng từ hạt nhân phổ khối phân giải cao CAN6 Phổ khối phân giải cao ESI FTICR MS CAN6 PL - 28 Phổ 1H- NMR CAN6 PL - 29 Phổ 13C- NMR CAN6 PL - 30 Phổ HMBC CAN6 PL - 31 Phổ HSQC CAN6 PL - 32 [...]... dụng trong y học” Một trong các nội dung của đề tài này là bào chế sản phẩm bột đông khô chứa TTX 0,1% dùng làm nguyên liệu phục vụ cho sản xuất thuốc Nhằm kiểm soát tốt việc bào chế sản phẩm bột đông khô TTX 0,1%, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài Bước đầu xác định một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu và sản phẩm bột đông khô chứa tetrodotoxin 0,1% từ cá nóc với các mục tiêu chính nhƣ sau:... hoặc dƣới áp lực của khí trơ đƣa vào khi đóng nắp lọ 21 TTX là một chất độc rất mạnh và chƣa có thuốc giải độc Do đó, trong qui trình bào chế bột đông khô TTX 0,1% cần phải đƣợc kiểm soát chất lƣợng từ nguyên liệu đầu vào và sản phẩm đầu ra  Tiêu chuẩn chất lượng bột đông khô TTX 0,1% Bột đông khô TTX 0,1% đƣợc bào chế từ TTX thô chiết xuất từ cá nóc thƣờng bao gồm TTX và các analog đều có độc tính Do... TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Nguyên liệu TTX thô chiết xuất từ cá nóc và sản phẩm bột đông khô TTX 0,1% 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.2.1 Nguyên liệu Sử dụng phủ tạng (gan, trứng) của các loài cá nóc đƣợc đánh bắt tại vùng biển Khánh Hòa và Vũng Tàu, Việt Nam Các loài cá nóc sử dụng trong nghiên cứu đƣợc định danh và lƣu tiêu bản, gồm có: (1) cá nóc chuột... tiến hành xác định hàm lƣợng TTX, xác định sự có mặt của một số analog của TTX trong TTX thô dùng bào chế bột đông khô Bột đông khô TTX 0,1% đƣợc bào chế với quy mô nhỏ, nên nghiên cứu chƣa tiến hành đánh giá độ đồng đều hàm lƣợng của sản phẩm Trong nghiên cứu này chỉ tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu hình thức, độ ẩm, định tính, hàm lƣợng TTX trong bột đông khô TTX0,1% 22 Chƣơng 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG... tính của cá nóc thƣờng tăng cao vào các tháng 2-3 và 7-9 trong năm, đây cũng là mùa sinh sản của cá nóc [10], [13] Một số nghiên cứu và đánh giá hàm lƣợng TTX trong một số loài cá nóc ở Việt Nam thời điểm tích lũy cao nhất có thể trên 100μg/g [6], [14] Cá nóc là nguồn nguyên liệu tiềm tàng để chiết tách TTX, hứa hẹn một tiềm năng mới cho ngành y dƣợc Việt Nam 1.2.3 Thành phần độc tố trong cá nóc Độc... (2) cá nóc chuột chấm sao (Arothron stellatus), (3) cá nóc tro (Lagocephalus lunaris), (4) cá nóc vằn mặt (Torquigener brevipinnis), (5) cá nóc thu (Lagocephalus sceleratus), (6) cá nóc viền đuôi đen (Arothron immaculatus), (7) cá nóc chấm cam (Torquigener gloerfelti), (8) cá nóc vàng (Lagocephalus spadiceus), (9) cá nóc răng mỏ chim (Lagocephalus inermis) và (10) cá nóc vằn (Takifugu oblongus) Cá nóc. .. sản phẩm bột đông khô chứa tetrodotoxin 0,1% từ cá nóc với các mục tiêu chính nhƣ sau: 1 Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng TTX 2 Xác định một số chỉ tiêu chất lƣợng nguyên liệu và sản phẩm bột đông khô TTX 0,1% 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1 TETRODOTOXIN 1.1.1 Danh pháp, công thức và tính chất hóa lý của TTX 1.1.1.1 Danh pháp, công thức của TTX Tên IUPAC: (4 R, 4a R, 5 R, 6 S, 7 S, 8 S, 8a R, 10... Phủ tạng cá nóc TTX thô ≥ 80% TTX nguyên liệu hàm lƣợng ≥ 99% Phân lập, phân tích TTX và các analog Bào chế thành dạng bột đông khô TTX 0,1% Nghiên cứu dƣợc lý Đánh giá độc tính Thiết lập chất chuẩn Hình 1.5 Sơ đồ khái quát các nội dung nghiên cứu dự án Một trong các mục đích của nghiên cứu hƣớng tới là sử dụng chiết xuất TTX từ cá nóc để bào chế các sản phẩm điều trị cai nghiện, giảm đau có chứa TTX... tự nhiên [46] 1.2 CÁ NÓC 1.2.1 Đặc điểm sinh học và phân bố của cá nóc Cá nóc là thuộc bộ Tetrodontiformes Bộ này chứa 10 họ còn sinh tồn với khoảng 430 loài và khoảng 9 họ đã tuyệt chủng [28] Đặc điểm quan trọng để nhận biết và phân biệt với các loài cá khác là cá nóc không có vây bụng và các vây đều không có gai cứng Tùy loài mà cá nóc có hình dạng và cách phòng vệ khác nhau: làm phồng tròn bụng lên... trong cá nóc Cá nóc đƣợc coi là loài độc thứ hai trong thế giới động vật có xƣơng sống, chỉ đứng sau cóc độc vàng [4], [43] Tuy nhiên, không phải loài cá nóc nào cũng độc Độc tố trong cá nóc khác nhau theo loài Hàm lƣợng độc tố cũng có thể thay đổi theo mùa, vùng địa lý, giai đoạn phát triển của cá thể và thay đổi giữa các bộ phận trong cá nóc [10] Mức độ độc các bộ phận của đa số các loài cá nóc có thể ... TIÊU CHẤT LƢỢNG NGUYÊN LIỆU VÀ SẢN PHẨM BỘT ĐÔNG KHÔ TTX 0,1% 3.2.1 Kết xác định số tiêu chất lƣợng nguyên liệu TTX thô 44 44 3.2.2 Kết xác định số tiêu chất lƣợng bột đông khô TTX 0,1% 51 CHƢƠNG... bào chế bột đông khô TTX 0,1% cần phải đƣợc kiểm soát chất lƣợng từ nguyên liệu đầu vào sản phẩm đầu  Tiêu chuẩn chất lượng bột đông khô TTX 0,1% Bột đông khô TTX 0,1% đƣợc bào chế từ TTX thô... cho sản xuất thuốc Nhằm kiểm soát tốt việc bào chế sản phẩm bột đông khô TTX 0,1%, tiến hành nghiên cứu đề tài Bước đầu xác định số tiêu chất lượng nguyên liệu sản phẩm bột đông khô chứa tetrodotoxin