BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHÙNG THANH LONG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA CÂY ĐẠM TRÚC DIỆP Lophatherum gracile Brongn., Poaceae LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHÙNG THANH LONG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA CÂY ĐẠM TRÚC DIỆP Lophatherum gracile Brongn., Poaceae LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 60 72 04 06 Người hướng dẫn khoa học: TS Hà Vân Oanh TS Đỗ Thị Hà HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Trong trình nghiên cứu hồn thành luận văn này, tơi nhận nhiều giúp đỡ quý báu từ Thầy Cô giáo, nhà khoa học Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Dược liệu, đồng nghiệp, gia đình bạn bè Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Hà Vân Oanh TS Đỗ Thị Hà, người thầy trực tiếp hướng dẫn, hết lòng bảo tận tình động viên tơi suốt q trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Dược liệu, Thực vật, Dược học cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội cán khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu giúp đỡ đóng góp ý kiến cho tơi q trình thực nghiên cứu Nhân dịp này, xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, thư viện Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Lời sau cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới gia đình bạn bè khích lệ, động viên chia sẻ giúp tơi đạt kết ngày hôm Hà Nội, tháng năm 2015 Phùng Thanh Long i MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG .viii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ix ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Vị trí phân loại đạm trúc diệp Lophatherum gracile Brongn 1.2 Đặc điểm họ Lúa (Poaceae) 1.3 Tổng quan loài Lophatherum gracile Brongn 1.3.1 Đặc điểm thực vật 1.3.2 Thành phần hóa học 1.3.3 Tác dụng sinh học 16 1.3.4 Công dụng 19 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 20 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 20 2.1.2 Hóa chất 20 2.1.3 Dụng cụ thiết bị 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 21 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 22 2.2.3 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro 28 2.2.4 Xử lý số liệu 30 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31 3.1 Thực vật 31 ii 3.1.1 Mơ tả đặc điểm hình thái thực vật giám định tên khoa học loài đạm trúc diệp 31 3.1.2 Đặc điểm vi học đạm trúc diệp 32 3.1.3 Đặc điểm bột dược liệu 34 3.2 Hóa học 36 3.2.1 Định tính nhóm chất hữu phần mặt đất đạm trúc diệp 36 3.2.2 Chiết xuất phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ phần mặt đất đạm trúc diệp 37 3.2.3 Định lượng polyphenol toàn phần phần mặt đất đạm trúc diệp 46 3.3 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro 48 Chương BÀN LUẬN 50 4.1 Về thực vật 50 4.2 Về thành phần hóa học 51 4.2.1 Định tính 51 4.2.2 Phân lập hợp chất 52 4.2.3 Về kết định lượng hàm lượng polyphenol tổng số 53 4.3 Về tác dụng chống oxy hóa in vitro 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ CÁC BÀI BÁO CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton nuclear magnetic resonance) 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C (Carbon (13) nuclear magnetic resonance) Ac Aceton Abs Độ hấp thụ (Absorbance) ABTS 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) C Nồng độ dung dịch CC50 Nồng độ gây độc 50% (Half maximal cytotoxicity concentration) CTHH Cơng thức hóa học CTPT Cơng thức phân tử DCM Dichloromethan DĐVN Dược điển Việt Nam DEPT Detortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO Dimethyl sulfosid DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol FRAP Lực chống oxi hóa phương pháp khử sắt(Ferric-reducing antioxidant power) GAE Đương lượng acid gallic Hx n-hexan IC50 Nồng độ ức chế 50% (Half maximal inhibitory concentration) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) MeOH Methanol iv MS Phổ khối (Mass spectrometry) NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resource) SI Hệ số chọn lọc (Selective index) SKC Sắc ký cột SKC – RP Sắc ký cột pha đảo SKLM Sắc ký lớp mỏng STT Số thứ tự TEAC Khả chống oxy hóa tương đương trolox (Trolox equivalent antioxidant capacity) TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử UV Ánh sáng tử ngoại (Ultra violet) v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các flavonoid đạm trúc diệp Bảng 1.2 Một số hợp chất khác đạm trúc diệp 13 Bảng 1.3 Tác dụng chống RSV số flavonoid đạm trúc diệp 17 Bảng 3.1 Kết định tính nhóm chất hữu phần mặt đất đạm trúc diệp phản ứng hóa học 36 Bảng 3.2 Kết xây dựng đường chuẩn theo chất đối chiếu acid gallic 46 Bảng 3.3 Hàm lượng polyphenol toàn phần đạm trúc diệp 47 Bảng 3.4 Hoạt tính quét gốc tự DPPH 48 Bảng 3.5 Hoạt tính quét gốc tự ABTS 49 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 3.1 Một số đặc điểm hình thái đạm trúc diệp 31 Hình 3.2 Cấu tạo giải phẫu rễ đạm trúc diệp 32 Hình 3.3 Cấu tạo giải phẫu thân đạm trúc diệp 33 Hình 3.4 Cấu tạo giải phẫu đạm trúc diệp 34 Hình 3.5 Đặc điểm bột dược liệu rễ đạm trúc diệp 34 Hình 3.6 Đặc điểm bột dược liệu thân đạm trúc diệp 35 Hình 3.7 Đặc điểm bột dược liệu đạm trúc diệp 36 Hình 3.8 Sơ đồ phân lập hợp chất từ đạm trúc diệp 39 Hình 3.9 Sắc ký đồ hợp chất daucosterol 41 Hình 3.10 Sắc ký đồ hợp chất β-sitosterol 42 Hình 3.11 Cơng thức hóa học hợp chất từ đạm trúc diệp 46 Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn xác định nồng độ acid gallic 47 vii viii PHỤ LỤC PHỔ CỦA HỢP CHẤT LGE2 (HYDROXYMETHYLFURFURAL) - MS - DEPT - 1H-NMR - 13C-NMR HO O xxi O Phổ MS Phổ DEPT xxii Phổ 1H-NMR xxiii Phổ 13C-NMR xxiv PHỤ LỤC KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG POLYPHENOL TOÀN PHẦN TRONG PHẦN DƯỚI MẶT ĐẤT ĐẠM TRÚC DIỆP xxv Bảng Kết định lượng polyphenol toàn phần phần mặt đất đạm trúc diệp Mẫu Cao chiết ethanol 70% Phân đoạn n-hexan Phân đoạn DCM Phân đoạn ethyl acetat Cặn nước Độ ẩm cao (%) 4,3 4,5 5,2 4,6 Lần thí nghiệm Khối lượng cân (mg) Abs Hàm lượng cắn (mg GAE /g) 103 0,229 18,63 102,8 0,229 18,55 104,1 0,248 20,86 - - - - 102,3 0,524 52,01 102,1 0,532 53,02 101,9 0,546 54,7 51 0,539 108,51 50,5 0,509 102,69 51,9 0,57 113,56 104,2 0,178 12,88 104,6 0,188 13,99 104 0,183 13,43 xxvi M±SD 19,33±1,22 - 53,24 ± 1,36 108,26 ± 5,44 13,43 ± 0,56 PHỤ LỤC KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO PHẦN DƯỚI MẶT ĐẤT CÂY ĐẠM TRÚC DIỆP xxvii Bảng 8.1 Kết đánh giá khả quét gốc tự DPPH phần mặt đất đạm trúc diệp Mẫu Nồng độ (µg /ml) 130 140 Cao chiết ethanol 70% 150 160 170 280 290 Cắn phân đoạn hexan 300 310 320 Cắn phân đoạn DCM 90 100 Lần thí nghiệm 3 3 3 3 3 Abs Hoạt tính (%) 0,392 0,405 0,381 0,374 0,362 0,351 0,315 0,337 0,321 0,288 0,301 0,277 0,275 0,249 0,257 0,407 0,400 0,388 0,394 0,385 0,373 0,371 0,361 0,357 0,359 0,350 0,341 0,339 0,335 0,320 0,425 0,418 0,439 0,416 0,372 45,63 43,83 47,16 48,13 49,79 51,32 56,31 53,26 55,48 60,06 58,25 61,58 61,86 65,46 64,36 43,55 44,52 46,19 45,35 46,60 48,27 48,54 49,93 50,49 50,28 51,46 52,70 52,98 53,54 55,62 41,05 42,02 39,11 42,30 48,40 xxviii IC50 (µg /ml) 140,6 ± 3,28 - 108,89 ± 2,54 110 120 130 30 40 Cắn phân đoạn ethyl acetat 50 60 70 110 120 Cặn nước 130 140 150 3 3 3 3 3 3 3 0,391 0,349 0,341 0,377 0,332 0,307 0,343 0,282 0,311 0,297 0,610 0,598 0,605 0,531 0,537 0,528 0,462 0,443 0,456 0,390 0,358 0,376 0,312 0,323 0,330 0,49 0,484 0,476 0,447 0,450 0,47 0,406 0,432 0,423 0,379 0,387 0,411 0,347 0,338 0,369 xxix 45,77 51,60 52,70 47,71 53,95 57,42 52,43 60,89 56,87 58,81 15,40 17,06 16,09 26,35 25,52 26,77 35,92 38,56 36,75 45,91 50,35 47,85 56,73 55,20 54,23 32,04 32,87 33,98 38,00 37,59 34,81 43,69 40,08 41,33 47,43 46,32 43,00 51,87 53,12 48,82 62,66 ± 1,46 148,70 ± 8,26 1,5 Quercetin (chứng dương) 2,5 3,5 3 3 0,614 0,553 0,591 0,504 0,531 0,471 0,410 0,438 0,406 0,305 0,313 0,337 0,141 0,211 0,278 xxx 18,46 26,56 21,51 33,07 29,48 37,45 45,55 41,83 46,08 59,50 58,43 55,25 81,27 71,98 63,08 2,71 ±0,11 Bảng 8.2 Kết đánh giá khả quét gốc tự ABTS phần mặt đất đạm trúc diệp Mẫu Nồng độ (µg /ml) 20 30 Cao chiết ethanol 70% 40 50 60 20 30 Cắn phân đoạn hexan 40 60 80 15 Cắn phân đoạn DCM 20 25 Lần thí nghiệm 3 3 3 3 3 3 xxxi Abs Hoạt tính (%) 0,562 0,567 0,558 0,449 0,462 0,451 0,372 0,357 0,362 0,262 0,242 0,25 0,19 0,184 0,172 0,608 0,623 0,595 0,517 0,514 0,52 0,456 0,472 0,46 0,314 0,305 0,318 0,182 0,194 0,2 0,541 0,564 0,572 0,431 0,422 0,446 0,333 0,345 24,16 23,48 24,70 39,41 37,65 39,14 49,80 51,82 51,15 64,64 67,34 66,26 74,36 75,17 76,79 17,95 15,92 19,70 30,23 30,63 29,82 38,46 36,30 37,92 57,62 58,84 57,09 75,44 73,82 73,01 26,29 23,16 22,07 41,28 42,51 39,24 54,63 53,00 IC50 (µg /ml) 38,37 ± 0,98 - 23,93 ± 0,67 30 35 10 Cắn phân đoạn ethyl acetat 12 14 18 30 35 Cặn nước 40 50 60 3 3 3 3 3 3 0,33 0,230 0,238 0,245 0,065 0,050 0,081 0,529 0,538 0,545 0,420 0,412 0,431 0,377 0,368 0,364 0,283 0,277 0,278 0,165 0,154 0,171 0,452 0,459 0,446 0,37 0,362 0,376 0,294 0,288 0,314 0,167 0,154 0,184 0,051 0,039 0,063 xxxii 55,04 68,66 67,57 66,62 91,14 93,19 88,96 27,93 26,70 25,75 42,78 43,87 41,28 48,64 49,86 50,41 61,44 62,26 62,13 77,52 79,02 76,70 38,42 37,50 39,30 49,59 50,68 48,71 59,95 60,82 57,22 77,25 79,02 74,93 93,05 94,72 91,42 11,75 ± 0,24 35,40 ± 0,66 0,1 0,2 Trolox (chứng dương) 0,3 0,4 0,5 3 3 0,515 0,541 0,484 0,432 0,448 0,416 0,305 0,326 0,347 0,178 0,232 0,257 0,139 0,146 0,175 xxxiii 31,61 28,15 35,72 42,63 40,50 44,75 59,50 56,71 53,92 76,36 69,19 65,87 81,54 80,61 76,76 0,253 ±0,004 PHỤ LỤC PHIẾU XÁC NHẬN BẢN THẢO xxxiv xxxv ... khoa học đại Vì tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro đạm trúc diệp Lophatherum gracile Brongn. , Poaceae? ? ?, với mục tiêu: - Nghiên cứu thành phần. .. MHz, CDCl3) δ: 0,6 8 (3H, s, H-18); 0,8 3 (3H, d, J = 7,5 Hz, H-27); 0,8 1 (3H, d, J = 7,5 Hz, H-26); 0,8 4 (3H, t, J = 7,5 Hz, H29); 0,9 2 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21); 1,0 1 (3H, s, H-19); 3,5 4 (tt; 5,1 ;...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHÙNG THANH LONG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA CÂY ĐẠM TRÚC DIỆP Lophatherum gracile Brongn. ,