BỘYTÈ LỜI CẢM ƠN HỌCthành DƯỢC Tôi xin bày tỏTRƯỜNG tòng biết ĐẠI ơn chân vàHÀ sâuNỘI sắc tới thầy giáo Ts Nguyễn Văn Rư cô giáo DS Nguyễn Thi Mứt Hương, Bộ môn Sinh Hóa, trường Đại học Dưực Hà Nôi, người trưc tiếp hướng dẫn, tân tình giúp đỡ tạo đỉều kiện thuận lợi để giúp hoàn thành khóa luận Tôi xin chân trọng cám ơn thầy cô Bộ môn Hóa sinh, trường Đại học Dược Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành khóa ỉuận Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, cấc phòng ban , thầy cô giảo trường Đại học Dược Hả Nội tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập thời gỉan làm khóa luận, Cuối xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tói gia đình tơi, người nuôi dưỡng, day dẫ chăm lỡ chõ song CAO THỊ MINH HÒA vả học tập Bước DẦU NGHIÊN cứu TẠO CHÊ Hà Nội, ngày 10 tháng năm 20Ữ9 Cao Thi Minh Hòa Người hướng dân : TS Nguyễn Văn Rư Nơi thụrc : Bộ môn sinh hóa, Trường ĐH Dược Hà Nội MUC Lưc »• ĐẬT VẮN ĐỀ PHẦN I: TỎNG QƯAN .2 1.1 L EPTIN VÀ HORMON POLYPEPTID 1.1.1 Nguồn gốc, cầu tạo đặc điểm leptin 1.1.2 Tác dụng sinh lý leptin 1.2.3 Hormon polypeptid chất leptin 1.2 B ỆNH BÉO PHỈ 11 1.2.1 Định nghĩa héo phì , 11 1.3.2 Nguyên nhân béo phì 13 1.3.3 Điều trị béo phì,,,., 15 PHÀN II; THỤC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .21 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯONG PHÁP THỤC NGHIỆM 21 2.1.1 Nguyên vật liệu 21 ĐẶT VÁN ĐÈ Hiện nay, tình hỉnh bệnh rối loạn !ipid máu, đái tháo đường, ung thư, tăng huyết áp, xơ vữa động mạch phổ biến trẽn giới Có nhiều nguyên nhân dẫn đến bệnh đỏ, đọ béo phì nguyên nhân đáng quan tâm Béo phì bệnh phổ biến với phát triền xã hội chất lượng sống nâng cao, Ở Mỹ có 50% số người dân thừa cân 30% mắc bệnh béo phì, Châu Au có 50% số dân thừa cân tỷ lệ lên đến 70% vòng 30 năm tới Mỗi năm có khoảng 300.000 người chết mà nguyên nhân đo bệnh béo phì, Tại việt Nam tỷ lệ thừa cân béo phì trẻ em khoảng 4% (Hà Nội, 1995) 10,7% Tp Hồ Chí Minh (2000) Béo phi tình trạng tăng trọng tăng khối lượng mỡ Mô mỡ biết đến quan nội tiết chuyến hóa chủ động cao chức nội tiết, mô mỡ gia tăng béo phì lẳng đọng mỡ nội tạng liền với đề kháng insulin, tảng glucose, rối loạn lipid, tăng huyết áp, tình trạng tiền viêm, tiền tẳc mạch Te bào mơ tiết hormon leptin, adiponectin, tiết nhiều chất protein khác Leptin lần phát vào năm 1994 lả homion peptid tiết mô mỡ, có vai trò quan trọng điều hòa thể trọng, đỉều hòa chức sinh sản, tác dụng trẽn tim mạch, bệnh sinh đái tháo đường nhiều tác dụng khác Năm 1998 Ieptin dược thử nghiệm trẽn người tác dụng giảm cân Tại Vỉệt Nam leptin nghiên cứu đê ứng dụng chăn nuôi PHẢN I: TỎNG QUAN Li LEPTIN VÀ HORMON POLYPEPTID 1.1.1 Nguồn gốc, cấu tạo đặc điểm leptin Leptỉn phát năm 1994 từ chuột, Từ ỉeptin có nguôn gôc Hy Lạp: leptos có nghĩa gầy, hormon với cấu tạo protein cỏ vai trò quan trọng điều hòa trọng lượng co thể, chuyển hóa chức sinh sản [6], [13] Leptin lả polypeptid gồm 167 acid amin, có khối hrợng I6-kDa có cấu trúc tương đồng với- cytokin [6] Leptin tiết chủ yếu từ mô mỡ, nồng độ leptin tiết tỷ lệ với khối lượng mô mỡ tình trạng dinh dưỡng, lượng nhỏ leptin tiết từ biểu mô dày thai [8] Có nhiều yếu tổ ảnh hưởng đến tiết ỉeptin: > Các yếu tố làm tăng tiết leptin như: insulin, gỉucocorticoid, estrogen giảm ăn cách trầm trọng sau vài ngày làm thể trọng giảm đến 50% sau tháng Sự giảm thể trọng giải thích kết hợp tác dụng [11], [16], [12] > Giảm đói tiêu thụ thức ăn, qua trung gian phàn ức chể hoạt động neuropeptid Y (NPY) agouti — relate peptid (AgRP) đồng thời tãng cưởng hoạt động alpha — melanocortin stimulating hormon (AMSH) NPY AgRP chất kích thích mạnh ăn uống > Gỉa tăng tiêu hao lượng, đánh giá thông qua tiêu thụ oxy tăng, thân nhiệt cao hon giảm khối lượng mỏ mỡ ĩChác với giảm cân ăn kỉêng làm giảm khối mỡ khối nạc (cơ), giảm cân chích leptin làm giảm khối mỡ mà tác dụng làm giảm khổi nạc Nhung chế tác dụng leptin lên chuyên hóa phức tạp người ta chưa hiếu rõ đầy đủ Ngoài vai trò vùng đồi vùng ngoại biên gồm tế bào beta tụy tạng có vai trò [11, [16], [24] Nồng độ leptin thấp người súc vật có lượng mỡ thể thấp, chửng tỏ leptin có vai trò điều hòa chức sinh sản Tác dụng phần leptin có khả tăng tiết hormon giải phong hormon hướng sinh dục (Gonadotropin-releasing hormon: GnRH) từ làm tăng tiết hormon kích sinh nang noãn (Follicle-stimulating hormon: FSH) hormon kích sinh hoảng thể (Luteinizing hormon; LH) từ thừy trước tuyến yên [20] Vai trò leptin Hên quan đến chức nảng sinh sản trước hết thể qua hỉện tượng dậy thỉ Thí nghiệm chuột giai đoạn tiền dậy điều trị với leptin nhàm mục đích tăng cân, người ta ghí nhận đuợc khả sinh sản dậy xuất sớm so với lô chứng Ngoài ra, người bị đột biến bất hoạt gen thụ thể leptin bị béo phì mà bị không dậy [15], [19], [20] ỉ 1.2.3 Chức nội tiết - thần kinh khác Ngoài hiệu điều chỉnh lượng, chức sinh sản, leptin điều hòa chức thần kinh nội tiết hệ nội tiết Thiếu leptin lầm tăng hoạt động trục đồi - yên - thượng thận ức chế trục đồi - yên - giáp trục sinh dục Leptin làm giảm cortison, ức chế tiết CRH đồi stress Cơ chê tác dụng tăng hoạt trục thượng thận chưa rỗ Leptin bình thường hóa nồng độ hormon giáp bị thấp thiếu leptin trước đó, phần kích thích tiết tăng tác dụng TRH từ vùng đồi Ngoài tác dụng kích thích dậy nêu trên, dùng leptin thay thê lúc đói ngăn chặn thay đôi trục sinh dục trục giáp trạng đói làm tãng thêm huyết áp Ở bệnh nhân béo phì leptin máu tăng bị đề kháng tác dụng phương điện làm giảm cân* Sự đề kháng có tính chất chọn lọc bệnh nhân béo phì kèm với tình trạng tăng leptin máu gây thêm tác dụng bất lợi tim mạch bệnh nhần béó phì [20], [16] bệnh nhân béo phì, thường có đề kháng insulin dỏ hỏrmon khác tiết từ mô mơ gây hiên tượng tăng insulin máu, thân insulin máu tăng kích thích hệ giao cảm tăng giữ Natri làm tăng huyết áp Nhỉều protein hệ RAS đuợc sản xuất từ IĨ1Ô mỡ trực tiếp làm tăng huyết áp [16], [10] Từ biểu trén xuất lúc bệnh nhân béo phì gây nên hậu xấu tim mạch Tỷ lệ tăng huyết áp cao trẽn đối tượng béo phì L 1.2.5 Leptiti đái íháơ đường Leptin điều hòa đường máu thông qua đường khác nhau: > Kiếm soát ngon miệng tích trữ lượng tế bào tạo máu , thay đổi sản xuất cytokin tế bảo miễn dịch, kích thích phát triển tế bào nội mạc mạch máu, tân sinh mạch máu, đẩy nhanh ỉành vết thương [22] > Thiếu leptin làm tăng khối xưcrng đối tượng tảng cortison máu suy sinh dục, tác động thông qua vùng bụng đôi Vùng bụng đồi có đáp ứng với leptin lại ảnh hưởng lên hoạt động hệ thần kinh thực vật Nhiều nghiên cứu cho thấy leptin làm giảm khối lượng xương cách gián tiếp thông qua hoạt hóa hệ thần kinh thực vật Rổ ràng leptin có nhiều chức nội tiết khác vai trò điều chỉnh lượng [16], [23] 1.2.3 1.2,3 Hormon poỉypeptid ctìất leptin ỉ Định nghĩa Hơrnton đặc điếm hệ thống nội tiết Định nghĩa hormon: Hormon nhũng chất dẫn truyền thông tin hỏa học có chất peptid hay steroid số tổ chức (gọi tuyến) tiết đổ thẳng vào máu, có chức điều hòa hoạt động tồ chức khác [ ỉ ] Tuy nhiên có thê mở rộng định nghĩa cho chât có tác dụng tê bào cạnh (được gọi ỉả chức paracrin) hay chât có tảc dụng tế bào sản sinh nò (chức autocrin) sản xuất estrogen tể bào tiết có nguồn gốc thần kinh Nhiều loại tế bào nội tiết có nguồn gốc phôi đỉnh thằn kinh Tuy nhiên nơi sản xuất hormon tuyến nội tiết mà lả tế bào chức nội tiết như: s Te bào vùng đồi sản xuất yếu tố giải phóng hay yếu tố ức chế s Te bào ống niêm mạc ống tiêu hòa sản xuất hormon tiêu hóa s Te bào nhiều tổ chức sản xuất honnon tổ chức có tác dụng chỗ có chất tương tự hormon có dẫn xuất từ aci-d béo Cơ quan đích: ỉà nơi hormon đến phát huy tác dụng Một hormon tác động lên hay nhiều to chức đích Cơ chế điều hòa feed-back (FB): Sự tiết hormon điều hòa hệ thống kiểm soát tinh vi phức tạp dựa nguyên lỷ “tự điều chỉnh” để đảm bảo định nội môi thể Đó ca chế điều hòa ngược (feed Bảng Ll; Phân loại hornton cấuvàtạo 1.2.3.4 Hornton có chất theo protein pơtypeptỉd Thuộc nhóm hormon tuyến yên, vùng đồi, rau tụy,nhận cận hormon giáp hormon tiêuhay hóa.steroid có vùng chức Cácthai, Rtiếp polypeptid Bảng 2: Môt Sớ hớrmởĩỉ proteỉn pỡỉypeptid năng: > Vùng nhận dạng hormon > Vùng phát tín hiệu lảm nhiệm vụ truyền tin song song vớỉ vỉệc nhận dạng hormon L2J.2 cấu tạơ hóa học vơ phân loại hortnơn mặt hóa học chỉa hormon thành nhóm (bảng 1) peptid, arnin steroid Nhóm thử mang tín hiệu tế bào eicosanoid, chất có tác dụng tương tự hormon (hormonelike) hoạt động chỗ Tên viết tắt TRH: Thyrotropín releasing hormon hormon ARF (GRF): Somatotropine releasing factor (hormon) 98 hảng 1.2 'p Dụng cụ thủy tinh khô vả > Máy đông khỏ 2.1.3 Phương pháp thực nghiệm 2.1.3.1 Phương pháp chiết tách protein —leptin từ tai lợn: Nguyên tắc: tai lạn nghiền nhuyễn* khuấy dung dịch đệm thích hợp, sau tiến hành lọc kết tủa bàng muối amonisulphat có nàng độ thích hợp Kết tủa đông khô tạo thầnh chế phẩm đông khô Tiến hành sắc kí lọc gel để thu phần đoạn có chứa leptin 2.L3.2+ Phương pháp chiết tách protein - ỉeptin lọc gel sephadex G 75 Mục đích cửa phương pháp: Trong phương pháp lọc gel, logarit MW (logarit khối lượng phân tử) tỉ lệ thuận với Ve (thể tích rửa giảỉ) Do biết MW chất dự đoán thể tích rửa giải để thu lấy chất cần thiết loại tạp chất (nếu có) Nguyên tắc: Sephadex G75 ngâm trương nở, sau nhồi lên cột Lọc qua cột geỉ dung dịch protein albumin, casein, insulin vitamin B12 biết khối lượng tương ứng 67.000, 23.600, 5.700 1.350 Da, để xây dựng đường chuẩn phụ thuộc khối lượng phân tử (MW) thể tích rửa giải (Ve) Sau nạp dung dịch protein — leptin để thu phân đoạn tương ứng với MW tử 15000 — 16000 Da 22 biến nồng độ protein vả mật độ quang, làm $ở cho định lượng nồng độ protein dung dịch thử Nguyên tấc: Khi cho tác dụng với thuốc thử Gomal, protein (có liên kết peptid) tạo thành phức màu tím hồng Đo quang phổ hấp thụ, so với biểu đồ mẫu để định lượng protein Tỉnh kết quả: • Các hệ sổ protein Kĩ tỷ lệ nồng độ protein (mg/ml) độ hấp thu quang: Nồng độ protein Ki = -— - Mật độ quang 23 2.2 KẾT ỌUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 2.2.1tỉnh Xây chuẩn protein thểdung nướcđirỏng đá hình đinh thànhlirong tách khỏi dung dịch Phần dung dịch chưa đông lạnh có nồng độ dược chất, tá dược tăng dần, băng điểm giảm xuống vàDùng tiến đến eutecti (hay1% nhiệt độ chuyển đổithành thủy Tiến hành: dungnhiệt dịch độ chuẩn aỉbumin để pha xác tinh) Cuốidịch thành phầnđộkhác tinh chuyền dung protein có nong từ 1,0 đếnhệ10kết mg/ml thực sang phản dạng ứng vô đinh hình Ket thúc trỉnh, hệ tồn nhiều dạng khác nhau: tinh thể, vố định hình tinh thể vô định hình Nồng 10 Giai đoạn sấy sư cắp: sản phẩm sau đông lạnh thích hợp chuyển sang buồng đ-ông khỏ điều kiện áp suất nhỏ áp suất nước đá (thường từ 0,05 — 0,20 mmHg hay 0,0665 — 0,226 mbar), nhiệt độ condensor (nhiệt độ buồng ngimg) khoảng -50°c, nhiệt độ giá từ -30 đến 10° c Trong điều kiện này, nước thăng hoa trực tiếp từ trạng thái rắn sang trạng thái không qua giai đoạn ỉỏng trung gian Quá trình nhận biết Lắc nhiệt độ phòng 30 phút Đo quang 550nm, cuvet lem Từ kết bề dày băng giảm bề dảy sản phẩm đông khô tăng ỉên Ờ đo quang phổ hấp thụ cửa dung dịch dựng biểu đồ nồng độ protein quang thuphải đượcthap kết bảngvỡ2.1: giai đoạn Két này,quá: nhiệtsau độkhi củađosản phấin nhiệttrong độ phá cấu trúc Bảng 2.1: Giá trị độ hấp thụ quang dung dịch pmteỉn biết nồng độ khoảng - 5°c 24 Hình 2,1 : Mối tương quang nồng độ protein độ hấp thụ quang Nhận xét: Đồ thị mối tương quan giừa nồng độ protein độ hấp thụ quang QÓ dạng dường thang tuyến tính bậc theo phượng trình y= ax + b cụ thẹ là; y= 0,049x + 0.004 (với X nồng độ protein y độ hấp thụ quang ) có hệ số tương quan R = 0.998 lớn han R2 = 0,99 Vậy kết luận nồng độ protein mật độ quang 550nm có quan hệ tuyến tính đồng biến Đẻ xác đinh nồng độ protein vào đường chuẩn, phương trinh lioăc vào hệ số protein Ktb 2.2.2 Xây dựng đưòng chuẩn để xác định khối luọng phân tử > Chuẩn bị cột sắc ký: Ktb=Ngâm 19,97 sephadex 075 dung dịch NaN}0,02% 24 đế gel trương 26 25 Vitamỉn Bàng 12: Kết qua rửa gỉrìi protein p lĩ ương pháp [ọc gel Để cột thật thẳng, đổ dung môi vào tới 1/3 chiều cao cột, tránh bọt Gel trượng đổ vào cột đũa thủy tinh Khi lớp gel lắng xuống khoảng vào cm, mở khóa đáy cột cho dung môi từ từ chảy Tiếp tục đổ gel vào, ý cho trình đổ có lớp: lớp geỉ lắng, lớp ngày cao dần; lóp gel lẳng; phía lớp dung dịch suốt Nếu trình lắng nhanh lưu lượng chảy hút bỏ lóp dung môi phía đế tiếp tục đố gel vào Làm cột gel đồng chỗ thưa chỗ đặc Đặt lên gel miếng giấy lọc Cho dung môi chảy vài đế ổn định cột y Nạp mẫu: Pha dung dịch mẫu đến nồng độ khoảng Omg protein/ml 27 thể tích rửa giải tương ứng ỉà 16,6 ml Do tinh chế lựa chọn thể tích thu mẫu từ 15 - 18 ml 10 20 30 Thề tích ửiì gỉủi (ml) Hình 12: Mối tương quan gỉữa khối lượng phân tử theo hàm số logarit thể tích rửa giải Nhận xét: Đồ thị mối tương quan logarỉt khối lượng phân tử protein thể tích rửa giải có dạng đựỏng thẳng tuyến tính bậc y = ax 4- b cụ thể y = - 0.115x + 3,116 (y: logarit khối lượng phân tử protein vả x: thể tích rửa giải) Đường thẳng có hệ số tương quan R2 = 0.998 lớn R2 = 0.99 Do kết luận điều kiện thí nghiệm logMW Ve tuyến tính nghịch biến Leptin có MW = 16000Da có 28 29 Mô tả quy trình tủơ ỉèptỉn amonisulphat 40% Bảng *l* 2.5; Mở Kết tả trình đông khô: »# • Giai đoạn 1: Giai đoạn tách toại tạp chất proteintông sô (mg) Thăm dò nồng độ muối kết tuachất protein leptin: vòng/ phút Ở amonisulphat c để tạp cơđếhọc béo-lắng xuống Tiến hành Pha chếquang hỗn dịch theo tỉđộlệ protein lg kết tủa protein - leptỉn với 5ml đệm Sau đỏtóm hút vả xay nồng hỗntheo hợp quảtrong ? kết Tai lợn sauđokhi nhuyễn đượccủapha tỷthulệđược lg taỉ lợn 3ml Bảng 23: Lượng protein toàn phần tai lợn chỉết theo pH xác l mỉ hỗn dịch pha loằng cho vào lọ thủy tinh dùng để đông khô, dung dịch đệm thích hợp Khuấy phút để leptin tan hoàn toàn r~|n A A đặt lọ vào khay Chúng nước Ly thực tâm hỗn kết hợp tủa với ỉeptin tốc độ bắng dungvòng/phút dịch muối amonisuỉphat 30 phủt ởở0°c Báng 2A: Tổng số protein theo nồng độ10000 amonisulphat sửtrong dụng để chất béo đông đặc lại Lấy phần dịch lỏng ■ protein tổng số (mg) (l Đưa khay vào tủ lạnh, đông lạnh nhiệt dộ - 40()c, tốc độ làm lạnh khoảng Qua bước két tủa tí lệ thu hồi đạt 85,27 % thời gianchế khoảng lh •• Sơ Giai Giai đoạnl°c, tủa tạo proteìn - teptìn đồ đoạn đông 2: khố proteitt -kết leptin phẩm thô (chế phấm đông Chếphẩm khô) dungdịch Chế phẩm đông khỏ Hút lấy dung dịch thu vào ống ly tâm Vừa khuấy vừa thêm Sau khỉ chế phẩm đôngđộránthích hoàn toàn,Đe đưa chế phẩm vào buồng đông khô, amonisuíĩate đểnheợng nồng phútphẩm để kểttủa đạt đến Hình 2.6: Sovảo sảnh protein hợp tỗng số 15-20 chế protein - íeptin hútLychân không áp suất khoảng mbar, nhiệtthu độkết condensor khoảng ổndung đình 0000đến vòng/phút 300,1 phủt 0°c, tủa dịchtâm vói chếphấm đông khô -45°c, thời gian 24h Nhận xét: Tổng lượng protein chế phẩm dung dịch chế phẩm đông Tủa đem đông khô tạo thành chế phẩm thô (CF hay chế phẩm đông khô) khôTiếp khác Nhưng giá khác độ không đáng nhân J tồng tục tãng nhiệt độProtem lênnhau tới nhiệt (-40)(-50'kế C),Nguyên trì áp suấtcó thê trình đỏng khỏ* việc để vỉ thuốc bình ngưng thời gian dàí nhiệt độ buồng ngưng, thời gian sấy 48h làm protein - leptin trào bọt mả tổng lượng protein - leptin • Giai đoạn 3: Giai đoạn lọc gel tinh chế Leptin [3J,[25/,f27j Hìnhđông 23: So lượngprotein tách theo lg taỉ lợn chế phấm khôsánh bị giảm so vớichiết chế phẩm dungpH dịch Hình 2.4: xét: Tống sốquả prơtein theo nồng amonisuíphat sử dụng Nhận Kết cho thấy sử độ dụng dung dịch đệm pH protein tổng số Thực sắc lọc gel với dungcộtdịch có chứa cáckích protein khối Nạp lượng Tiếnkýhành lọc gel sephadex G75 thướcđã18biết X lem lml phân đê xây dựng đườngtừ chuẩn phụml thuộc độ khối lượngKết phân (MW) dung tách leptin CF tử vàmôi thuchiết phân đoạn 15 — 18 Đokết nồng protein quảtửđược ghi Từ kết chúng thấy tủa leptin bầng amonisulphat thể tích rửa giải (Ve) Sau nạp dung dịch leptin thô đế thu nồng độ 40% lượng protein thu lả lớn Điều chứng tỏ nồng độ phân đoạn tương ứng với MW từ 15000 - lóOOODa 393,4 Img proteinleptin 50% leptin chưa kết tủa hết nồng độ 20% 30% không kết tủa thêm 1233 Kết tủa proteỉn - leptỉn đông khô tạo chế phẩm leptin leptin lẫn thêm tạp chất khác • Gỉai đoạn kết tủa proteỉn- leptin: 32 31 30 34 33 Kết cho thấy qua giai đoạn tỉnh chế phương pháp lọc gel, tử 111,83 ml protein ban đầu thu 13,97 ml 2.3BÀN LUẬN 2.3.1 Tại lựa chọn tai lọn để chiết xuất leptin? Các công trình nghiên cửu khảm phá leptin mở nhiều hứa hẹn phương pháp điều trị béo phì Tác dụng leptin như: chức điều hoà thể trọng, chức sinh sản, chức nội tiết thần kinh khác; bên cạnh có chức khác điều hòa chức miễn dịch, tạo huyết, tân tạo máu phát triển xương Trên thể giới có nhiều công trình nghiên cứu hormon Tuy nhiên Việt Nam số lượng công trình hạn ché, công trình chủ yểu lĩnh vực nông nghiệp nghiên cứu đa hình kiểu gen leptin liên quan đến tính trạng kinh tế số giống lợn nuôi Việt Nam Như biết hiệu ngành chăn nuôi nhìn chung phụ thuộc nhiều vảo tốc độ tăng trọng, sản luợng thịt, sữa khả nãng sinh sản loài vật nuôi, Các tính trạng liên quan tớỉ chất lượng thịt: tỷ lệ nạc, độ dày mỡ lung, độ mềm, màu sắc độ thịt khả nàng tăng trọng quan tâm nghiên cửu Trong loài vật nuôi Việt Nam, lợn í oài quan trọng Thịt lợn chiếm khoảng 76% tống số loại thịt tiêu thụ Việt nam Các biện pháp kỹ thuật truyền thống thụ tinh nhân tạo, cấy truyền phôi, thay đổi điều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng, cải tiến chất lượng thức ăn, lai tạo, thủ y nâng cao đóng góp lcm vào việc cải tạo nâng cao tầm vóc, suất giống lạn nuôi Việt Nam phần đáp ứng nhu cầu thi trường 35 36 thể mức độ phân tử Kỷ thuật giữ vai trỏ cho việc chọn giống vật nuõi mức độ phân từ tương laỉ Phương pháp phân tích trực tiếp gen khẳc phục nhược điểm cách chọn lọc truyền thống phân tích dựa vào hệ phả, hay moỉ quan hệ hệ phả, tức cần phải theo dõi dải hom qua nhiều hệ nhiều trường hợp đặc đỉểm ngoại hình không tưomg ứng vớỉ kiểu gen nên kết chọn lọc không xác, Nhờ thành tựu chương trình giải mã gen lợn phát triển mạnh mẽ kỹ thuật di truyền phân tử, có nhiều thị di truyền phân tử liên quan tới tính trạng có ý nghĩa kinh tế lợn tốc độ sinh trưởng, tỷ lệ nạc mỡ, khả sinh sản, chống chịu bệnh xác định Một gen quan trọng nghiên círu lợn lả gen Leptim Như vậy, có the nói gen leptin gen liên quan tới tính trạng chất lượng thịt lợn khả tăng trọng lợn Lý chủ yếu khiến chủng quyêt định lụa chọn tai lợn đề nghiên cửu ìằ do: - Trong điều kiện hạn chế phòng thí nghiệm nguyên liệu tai lợn dễ kiểm, mặt khác mẫu mô tai lợn tương đối dễ bảo quản có công trình trước nghiên cứu Đe tài nảy mang tính chất bước đẩu nghiên cứu đề từ tạo sở cho nghiên cửu sâu 37 chiết tách tinh chế ỉeptin từ tai lợn Ket thu chế phẩm leptin thô CF íeptin tinh chế RF Nhưng nghiên cứu giai đoạn bước đầu nghiên cứu nên chủng xác định tổng luợng proteỉn mà chưa tiến hành thử nghiệm hiệu giảm béo hormon động vật thí nghiệm Neu có điều kiện thời gỉan ta sử dụng phương pháp chiết tách khác đề so sánh thấy đuợc kết phương pháp như; > Phương pháp tách chiết ADN > Phương pháp nhân gen (PCR) > Phương pháp điện di 2.3*3 vấn đề dạng chế phẩm ỉeptin dung dịch chế phẩm leptin đỏng khô Đông khô trình í oại bỏ nước chế phẩm sau đông lạnh cách đặt chế phẩm vào buồng chân không Điều kiện cho phép nước chuyển trạng thái từ rắn sang thể mà qua lỏng trung gian Chúng tiến hành chiết tách protein - leptin từ tai lợn 38 Tuy nhiên nhừng ưu điếm trẻn kỳ thuật đồng khỏ có nhược điểm 39 PHẦN III: KÉT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT KẾT LUẬN - Leptin hormon có chất protein, có khối lượng phân tử 16000 Da, sinh chủ yếu tế bào béo, có vai trò quan trọng điều hòa thể trọng béo gầy thể tham gia điều hòa số chức khác thể Đã sử dụng hai phương pháp chiết tách ieptin là: hòa tan - kết tủa tạo chế phẩm leptin thô có hàm lượng protein 131,14 mg/ml phương pháp ĐÈ XUẢT Tiếp tục nghiên cứu để tạo chế phẩm ỉeptin dùng cho ngành dược, tiêu chưấn hóa thử nghiệm khác tạo loại thuốc có khả làm 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: L Bộ môn Hóa Sinh - Trường ĐH Dược Hà Nội (2004), Hoả Sinh học, Trung tâm thông tin thư viện Đại học Dược Hà Nội, tập Viện chăn nuôi (1998), Kêt nghiên cửu khoa học kỹ thuật chan nuôi 1996-1997, Nhả xuất nông nghiệp, Hà nội Vũ Đình Vinh, Đặng Hanh Phức, Đỗ Đình Hồ, (1997), Kỹ thuật y sinh hóa, Trường ĐH quản y Lê Viết Ly (1999), Chuyên khảo bảo tần nguồn gen vật nuôi Ở4Ỉ Việt nam y Nhả xuất Nỏng nghiệp, Hà nội Nguyễn Văn Rư (2002), Nghiền cứu tạo chê phẩm prơtease nguồn gốc động vật, thực vật ứng dụng phòng chống suy dinh dưỡng , Trưởng ĐH Dược Hà Nội Tài liệu tiếng Anh: Brennan A.M., Mantzoros c.s (Jưne 2006), Drug ỉmìght: the role ỡflêptin in human physỉoiogy and pathophỵsioỉogy - emergìng cỉinìcal appỉicatỉons , Nat Clin Pract Endocrinol Metab, p.318-27 Bjorbaek c., Kahn B.B ( 2004), Leptin signalỉng in the Central nervous 11.Frieđman J,M., Halaas J (1998), “Leptin and the regulatỉon of body weight in mairLmals”, Nature, 395, p,763“770 12.Fruhbeck G ( 2001), The adỉpocyte: a model for ìntergraịìon of endocrỉne and metabolìc sỉgnaling in energy metaboỉism reguỉation!, Am,J Physiol Endocrinol Metab, p,827-847 13.Gregreen E.D.> Maffei M, Braden V.V., Proenca R., DeSilva u., Zhang Y., Chua S.C., Leibel R.L., Weissenbach J., Priedman J.M (August 1995) The human obese (OB) gene: RNA expression patíern and mapping on the physìcaỊ cytogenetic, and genetic maps of chromosome , Genome Res,p.5 14.Gray D.S., Fujioka K (1991), Use ỡf reỉative xveight and Body Mass Index for the determìnatỉon ỡf adiposity, J Clín Epidemiol, p.45-50 15.Hardge T., Kopke K., Wimmer K (1998), “Asociation between 21.Kuryl Ị, Kapela—Ski w., Fierzchala M., Bocian M., Grạjewska S.s ( 2003 ), Ả reỉationship beỉween genotypes at the GH and LEP locỉ and carcass meaĩ and fat deposition inpỉgs} Anỉmal Science , 21, p ỉ5-26 22.Neuenschwander s., Rettenberger, G., Mejjerink E., Jeejrb H., Stranzinger G (1996), “Partial characterization of porcine obesity gene (OBS) and its localization to chromosome 18 by somatic cell hybrids”, Animaĩ GeneticSỹ 27, p.275-278 23.Ruan H., Lodish H.F 62003/ Insuỉin resistence in adipose tissue: direct and indirect effects ofTNFa Cytokine, Growth Factor Rev, p.447-455 24.spurlock M.E., Frank G.R., Comelius, S.G., G.M., Bidwell C.A (1998/ “Obese gene expression in porcine adĩpose tissue is reduced by food deprivation but not by maintenance or submaintenance intake’"1, The dournaỉ o/Nutrừion, 128, p.677-682 [...]... và khả năng tăng trọng của lợn Lý do chủ y u khiến chủng tôi quyêt định lụa chọn tai lợn đề nghiên cửu ìằ do: - Trong điều kiện hạn chế của phòng thí nghiệm thì nguyên liệu tai lợn khá dễ kiểm, mặt khác mẫu mô tai lợn tương đối dễ bảo quản và đã có những công trình trước đó nghiên cứu về nó Đe tài n y mang tính chất bước đẩu nghiên cứu đề từ đó tạo cơ sở cho nghiên cửu sâu hơn 37 chiết tách và tinh... thuật y sinh hóa, Trường ĐH quản y 4 Lê Viết Ly (1999), Chuyên khảo bảo tần nguồn gen vật nuôi Ở4Ỉ Việt nam y Nhả xuất bản Nỏng nghiệp, Hà nội 5 Nguyễn Văn Rư (2002), Nghiền cứu tạo chê phẩm prơtease nguồn gốc động vật, thực vật ứng dụng trong phòng chống suy dinh dưỡng , Trưởng ĐH Dược Hà Nội Tài liệu tiếng Anh: 6 Brennan A.M., Mantzoros c.s (Jưne 2006), Drug ỉmìght: the role ỡflêptin in human physỉoiogy... xuất leptin? Các công trình nghiên cửu khảm phá về leptin đã mở ra nhiều hứa hẹn về phương pháp điều trị béo phì Tác dụng của leptin như: chức năng điều hoà thể trọng, chức năng sinh sản, chức năng nội tiết thần kinh khác; bên cạnh đó còn có những chức năng khác như điều hòa chức năng miễn dịch, tạo huyết, tân tạo máu và phát triển xương Trên thể giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về hormon n y Tuy... tổng số (mg) (l Đưa khay vào tủ lạnh, đông lạnh ở nhiệt dộ - 40()c, tốc độ làm lạnh khoảng Qua bước két tủa tí lệ thu hồi đạt 85,27 % thời gianchế khoảng lh •• Sơ Giai Giai đoạnl°c, tủa tạo proteìn - teptìn đồ đoạn đông 2: khố proteitt -kết leptin phẩm thô (chế phấm đông Ch phẩm khô) dungdịch Chế phẩm đông khỏ Hút l y dung dịch thu được vào ống ly tâm Vừa khu y vừa thêm Sau khỉ chế phẩm đôngđộránthích... đông khô tạo thành chế phẩm thô (CF hay chế phẩm đông khô) khôTiếp là khác nhau Nhưng sự giá khác n y độ không đáng nhân J tồng tục tãng nhiệt độProtem của lênnhau tới nhiệt (-40)(-50'kế C),Nguyên duy trì áp suấtcó thê do quá trình đỏng khỏ* việc để vỉ thuốc bình ngưng thời gian dàí nhiệt độ buồng ngưng, thời trong gian s y 48h làm protein - leptin trào bọt ra ngoài vì v y mả tổng lượng protein - leptin. .. nạp glucose và đái tháo đường type 2, hội chứng 19 cứu hoàn thiện để có thể trở thành thuốc điều trị béo phì và một sổ thuốc khác 20 PHÀN II: THựC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THƯC NGHIỆM 2 LI Nguyên vất liêu 2.1 1 1 Nguyên liệu Tai lợn sau khi l y về được rửa sạch sau đó thái lát mỏng, băm nhỏ rồi được cho vào m y xay Mau tai lợn sau khi xay nhuyễn được dùng đế tiến hành thực... cụ th y tinh khô vả sạch > M y đông khỏ 2.1.3 Phương pháp thực nghiệm 2.1.3.1 Phương pháp chiết tách protein leptin từ tai lợn: Nguyên tắc: tai lạn được nghiền nhuyễn* khu y trong dung dịch đệm thích hợp, sau đó tiến hành lọc rồi được kết tủa bàng muối amonisulphat có nàng độ thích hợp Kết tủa được đông khô tạo thầnh chế phẩm đông khô Tiến hành sắc kí lọc gel để thu được các phần đoạn có chứa leptin. .. đang rất được quan tâm nghiên cửu Trong các loài vật nuôi tại Việt Nam, lợn là í oài quan trọng nhất Thịt lợn chiếm khoảng 76% tống số các loại thịt được tiêu thụ tại Việt nam Các biện pháp và kỹ thuật truyền thống như thụ tinh nhân tạo, c y truyền phôi, thay đổi điều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng, cải tiến chất lượng thức ăn, lai tạo, thủ y đã nâng cao đóng góp rất lcm vào việc cải tạo nâng cao tầm vóc,... eo lưng tạo nên dáng người ,1quả táo tàu" thường được gọi là béo kiểu "trung tâm", kiểu phần trên hay béo kiểu dáng đàn ỏng và mỡ tập trưng ở phần háng tạo nên vóc người "hình quả lê" hay còn gọi là béo phần thấp hay kiếu dáng đàn bà Vì v y bên cạnh theo dõi chỉ sô BMI nên theo dõi thêm tỷ số vỏng bụng/vòng mông, khi tỉ số n y vượt quá 0,9 ở nam giới và 0,8 ở nữ giới thì các nguy cơ tăng huyết áp,... lợn Ket quả đã thu được 2 chế phẩm leptin thô CF và íeptin tinh chế RF Nhưng nghiên cứu của chúng tôi chỉ ở giai đoạn bước đầu nghiên cứu nên chủng tôi chỉ xác định được tổng luợng proteỉn mà chưa tiến hành thử nghiệm về hiệu quả giảm béo của hormon n y trên động vật thí nghiệm Neu có điều kiện và thời gỉan ta có thể sử dụng các phương pháp chiết tách khác đề so sánh th y đuợc kết quả giữa các phương ... Kỹ thuật y sinh hóa, Trường ĐH quản y Lê Viết Ly (1999), Chuyên khảo bảo tần nguồn gen vật nuôi Ở4Ỉ Việt nam y Nhả xuất Nỏng nghiệp, Hà nội Nguyễn Văn Rư (2002), Nghiền cứu tạo chê phẩm prơtease... thí nghiệm nguyên liệu tai lợn dễ kiểm, mặt khác mẫu mô tai lợn tương đối dễ bảo quản có công trình trước nghiên cứu Đe tài n y mang tính chất bước đẩu nghiên cứu đề từ tạo sở cho nghiên cửu sâu... kỹ thuật truyền thống thụ tinh nhân tạo, c y truyền phôi, thay đổi điều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng, cải tiến chất lượng thức ăn, lai tạo, thủ y nâng cao đóng góp lcm vào việc cải tạo nâng cao