TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BỘ MÔN HÓA - - TRẦN VĂN PHI LONG ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXINS TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP KHỐI PHỔ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƯỢC Cần Thơ, 2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BỘ MÔN HÓA - - TRẦN VĂN PHI LONG ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXINS TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP KHỐI PHỔ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƯỢC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS NGUYỄN TRỌNG TUÂN Cần Thơ, 2015 Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long LỜI CẢM ƠN  Trong suốt thời gian học tập rèn luyện trường Đại học Cần Thơ, học hỏi nhiều kiến thức bổ ích với kỹ quý báu mà quý thầy cô truyền dạy tận tình Đặc biệt, trình thực luận văn gặp không trở ngại nhờ giúp đỡ hướng dẫn nhiệt tình quý thầy cô, động viên từ phía bạn bè, người thân giúp hoàn thành luận văn Với nhiều tri ân sâu sắc, xin chân thành gửi lời cám ơn đến: Quý thầy, cô trường Đại học Cần Thơ nói chung Bộ môn Hóa học, khoa Khoa học Tự nhiên nói riêng truyền thụ nhiều kiến thức quý báu chuyên môn Thầy Nguyễn Trọng Tuân – Trưởng môn Hóa học – Cố vấn học tập hướng dẫn tận tình cho suốt trình thực luận văn tốt nghiệp Cô Nguyễn Thị Diệp Chi tận tình hướng dẫn, cung cấp kiến thức cần thiết bổ ích liên quan đến đề tài Công ty cổ phần chứng nhận giám định Vinacert, chi nhánh Cần Thơ tạo điều kiện tốt cho thực luận văn Anh La Văn Thái - Trưởng phòng Hóa chị Võ Thị Thúy An - Kỹ thuật viên sắc ký với anh chị chung phòng thí nghiệm bảo kiến thức quý báu làm việc hướng dẫn kỹ thao tác thực hành thí nghiệm Tập thể lớp Hóa dược khóa 37 quan tâm, chia sẻ nhiều kinh nghiệm học tập sống cho suốt năm qua Cần Thơ, ngày tháng năm 2015 Sinh viên thực Trần Văn Phi Long i Luận văn tốt nghiệp đại học Trường Đại Học Cần Thơ Trần Văn Phi Long Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Bộ Môn Hóa Học Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc  NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Cán hướng dẫn: TS Nguyễn Trọng Tuân Đề tài: Định lượng aflatoxins thức ăn chăn nuôi phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép khối phổ Sinh viên thực hiện: Trần Văn Phi Long MSSV: 2112044 Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37 Nội dung nhận xét: a) Nhận xét hình thức LVTN: b) Nhận xét nội dung LVTN (đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):  Đánh giá nội dung thực đề tài:  Những vấn đề hạn chế: c) Nhận xét sinh viên tham gia thực đề tài (ghi rõ nội dung sinh viên chịu trách nhiệm thực có): d) Kết luận, đề nghị điểm: Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015 Cán hướng dẫn TS Nguyễn Trọng Tuân ii Luận văn tốt nghiệp đại học Trường Đại Học Cần Thơ Khoa Khoa Học Tự Nhiên Bộ Môn Hóa Học Trần Văn Phi Long Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc  NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN Cán phản biện: …………………………………………………………… Đề tài: Định lượng aflatoxins thức ăn chăn nuôi phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép khối phổ Sinh viên thực hiện: Trần Văn Phi Long MSSV: 2112044 Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37 Nội dung nhận xét: a) Nhận xét hình thức LVTN: b) Nhận xét nội dung LVTN (đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):  Đánh giá nội dung thực đề tài:  Những vấn đề hạn chế: c) Nhận xét sinh viên tham gia thực đề tài (ghi rõ nội dung sinh viên chịu trách nhiệm thực có): d) Kết luận, đề nghị điểm: Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015 Cán phản biện iii Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long TÓM TẮT Một phương pháp đơn giản hiệu phát triển để xác định đồng thời aflatoxins thức ăn chăn nuôi phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép khối phổ (HPLC-MS/MS) Chất phân tích chiết với dung dịch MeOH:H2O (4:1) từ mẫu rắn xay mịn, làm cột chiết pha rắn Quy trình định lượng sử dụng hệ thống HPLC-MS/MS, cột pha đảo C18 (50 mm x 2mm, 3,5 μm), pha động H2O:ACN Dãy chuẩn với nồng độ 0,75-6 ppb, giá trị R2 lớn 0,99 Các giá trị RSD < 4% Độ khoảng 87,8%-105,7% Giới hạn phát (LOD) ppb giới hạn định lượng (LOQ) ppb Kết cho thấy phương pháp có độ độ nhạy cao, dùng để xác định mức hàm lượng vết aflatoxins Kết phân tích 30 mẫu thức ăn chăn nuôi có mẫu (chiếm 23,33%) nhiễm aflatoxins có mẫu (chiếm 3,33%) có hàm lượng aflatoxin B1 vượt mức quy định cho gà mẫu vượt mức quy định cho gà trưởng thành iv Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long ABSTRACT A simple and effective method was developed for the simultaneous determination of aflatoxins in feed by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) Analytes were extracted in MeOH:H2O (4:1) from pureed solid samples, purified using Oasis cartridges Determination by using HPLC-MS/MS system, RP-column C18 (50 mm x mm, 3.5μm), mobile phase was H2O:ACN The concentration of standard solutions is from 0.75 to ppb, R2 values are greater than 0.99 RSD values are less than 4% respectively The recovery is from 87.8% to 105.7% The limit of detection (LOD) was ppb and the limit of qualifycation was ppb The results showed that the developed method is sensitive, accurate and can be used to determine the levels of aflatoxins The result analysis of 30 feed samples showed that there were only samples (23.33%) infected aflatoxins, sample (3.33%) exceeded the allowed limit with aflatoxin B1 for chicks and no sample was out of regulation for mature chickens v Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Năm học 2014 – 2015 Tôi xin cam kết luận văn hoàn thành dựa kết nghiên cứu khuôn khổ đề tài “Định lượng aflatoxins thức ăn chăn nuôi phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép khối phổ” Ký tên Tên sinh viên/học viên Ngày Luận văn tốt nghiệp ngành Hóa học Mã số: ……… Đã bảo vệ duyệt Hiệu trưởng:…………………………………… Trưởng khoa:…………………………………… Trưởng chuyên ngành Cán hướng dẫn Nguyễn Trọng Tuân vi Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT iv ABSTRACT v DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xii CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan aflatoxins 2.1.1 Lịch sử phát Aflatoxins [1], [3], [4] 2.1.2 Nguồn gốc lây nhiễm aflatoxins [1] 2.1.3 Đặc điểm Aspergillus flavus 2.1.4 Cấu trúc hóa học tính chất lý hóa aflatoxins 2.1.5 Độc tính aflatoxins [1], [5] 2.1.6 Một số tác dụng aflatoxins 2.1.7 Con đường sinh tổng hợp aflatoxin B1 [3], [5] 14 2.1.8 Những giải pháp phòng chống độc tố nấm mốc 17 2.1.9 Quy định hàm lượng cho phép Aflatoxin thức ăn hỗn hợp chăn nuôi 18 2.2 Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) [6] 19 2.2.1 Giới thiệu 19 2.2.2 Phân loại 20 2.2.3 Quy trình chiết SPE 24 2.3 Đại cương HPLC hệ thống HPLC-MS/MS [7] 27 2.3.1 Đại cương HPLC 27 vii Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long 2.3.2 Hệ thống HPLC-MS/MS 29 2.4 Một số phương pháp nghiên cứu định lượng aflatoxins 30 2.4.1 Các phương pháp xác định HPLC [8], [9], [10] 30 2.4.2 Phương pháp ELISA (Enzyme linked immuno sorbent assay) [11] 32 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 3.1 Thời gian, địa điểm 33 3.2 Phương tiện nghiên cứu 33 3.2.1 Thiết bị 33 3.2.2 Dụng cụ 33 3.2.3 Hóa chất thuốc thử 34 3.2.4 Cách pha dung dịch, thuốc thử 34 3.3 Phương pháp nghiên cứu 35 3.3.1 Phương pháp lấy mẫu 35 3.3.2 Phương pháp phân tích 35 3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 35 3.4 Hoạch định thí nghiệm 35 3.5 Tiến hành thí nghiệm 36 3.5.1 Tối ưu hóa hệ thống HPLC-MS/MS [12], [13] 36 3.5.2 Tối ưu hóa quy trình chiết 38 3.5.3 Thẩm định quy trình phân tích 39 3.5.4 Tiến hành phân tích số mẫu thật công ty Vinacert 44 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 4.1 Tối ưu hóa hệ thống HPLC-MS/MS 46 4.1.1 Tối ưu hóa điều kiện chạy máy HPLC 46 4.1.2 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ 50 4.2 Tối ưu hóa quy trình chiết 51 4.3 Kết thẩm định 53 4.3.1 Độ tuyến tính 53 viii Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long 78 Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long 79 Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long 80 Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long 81 Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long 82 Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long 83 Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long 84 Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long 85 Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long 86 Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long 87 Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long 88 Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long 89 Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long D.2 SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU KHÔNG PHÁT HIỆN AFLATOXINS 90 Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long 91 Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long 92 [...]... nâng cao hiệu quả phân tích Trong đó, kỹ thuật sắc ký lỏng 1 Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long hiệu năng cao (HPLC) ghép khối phổ (MS) làm tăng tính chính xác, độ nhạy cũng như rút ngắn thời gian phân tích Việc phát triển một quy trình phân tích bằng hệ thống HPLC – MS/MS là cần thiết để có thể đáp ứng các yêu cầu định lượng aflatoxins Vì vậy đề tài Định lượng aflatoxins trong thức ăn chăn. .. vào cơ thể vật nuôi và tích trữ một thời gian, nếu đang giai đoạn cho ăn thúc để bán thì lượng độc tố cao đó sẽ chưa kịp đào thải hết và đi sang con người Do đó cần phải có một phương pháp định lượng đơn giản, chính xác để xác định hàm lượng độc tố aflatoxins trong thức ăn chăn nuôi, giúp kiểm soát lượng độc tố trong thức ăn cho vật nuôi tránh thiệt hại về kinh tế và ảnh hưởng đến sức khỏe con người... Những quy định về hàm lượng aflatoxin B1 trong thức ăn gia súc, gia cầm ở các nước EU Các loại nguyên liệu, thức ăn động vật Các loại thức ăn đơn chất Thức ăn hỗn hợp cho bò (ngoại trừ bò sữa, bê và cừu con) Thức ăn hỗn hợp cho heo và gia cầm trưởng thành Các loại thức ăn hỗn hợp khác còn lại Thức ăn vỗ béo cho bò, dê, cừu trưởng thành Thức ăn bổ sung cho heo, gia cầm trưởng thành Những thức ăn bổ sung... trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ được thực hiện 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Thử nghiệm, lựa chọn quy trình chiết pha rắn phù hợp để làm sạch và làm giàu mẫu trước khi đem tiến hành phân tích bằng HPLC Tiến hành thẩm định quy trình phân tích định lượng bốn loại aflatoxins (B1, B2, G1, G2) bằng HPLC - MS/MS Áp dụng quy trình phân tích, định lượng 30 mẫu thức ăn hỗn hợp hoàn... minh aflatoxins gây tổn thương gan, thận; gây ung thư, hoại tử; làm giảm khả năng miễn dịch của cơ thể Trong rất nhiều loại aflatoxins trong tự nhiên thì aflatoxin B1 được coi là chất độc nguy hiểm nhất Chất độc aflatoxins còn được bài tiết qua sữa bò dưới dạng đã chuyển hóa nhưng vẫn còn khả năng gây ung thư Khi con người ăn thịt hay uống sữa của vật nuôi đã ăn thức ăn bị nhiễm aflatoxins thì khả năng. .. Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số tính chất lý hóa quan trọng của aflatoxins 7 Bảng 2.2 Quy định hàm lượng tối đa độc tố nấm mốc aflatoxin B1 và hàm lượng tổng số các aflatoxin trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gà 18 Bảng 2.3 Những quy định mức cho phép aflatoxin trong thức ăn ở Mỹ (FAO năm 1995) 18 Bảng 2.4 Những quy định về hàm lượng. .. trên đậu phộng và phương pháp này đã được ứng dụng ở Mỹ năm 1969 như là một phương pháp xử lý bánh dầu, bông vải Ở Pháp, phương pháp này được thử trên bánh dầu phộng từ năm 1972 bởi Prevol Tuy nhiên phương pháp xử lý này làm tổn hại đến acid amin chứa lưu huỳnh trong thức ăn - Làm mất hiệu lực aflatoxin bởi chất hấp phụ bề mặt: 17 Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long Giải pháp khác ít tốn kém... tác nhân hóa học để trích ly hoặc làm thay đổi cấu tạo phân tử mycotoxin Tuy nhiên những phương pháp này có những hạn chế vì đòi hỏi chi phí lớn, kém hiệu quả kinh tế 2.1.9 Quy định về hàm lượng cho phép của Aflatoxin trong thức ăn hỗn hợp chăn nuôi - Quy định của Việt Nam: QCVN 01 - 10: 2009/BNNPTNT do Cục Chăn nuôi biên soạn, Vụ Khoa học, Công nghệ và Môi trường trình duyệt và được ban hành theo Thông... có thể Các cơ sở chế biến thức ăn chăn nuôi cũng lấy nguyên liệu từ hạt ngô, đậu phộng, khoai mì, các loại đậu đỗ không thể dùng cho người đem sản xuất thức ăn cho vật nuôi Nếu hàm lượng độc tố nấm mốc trong thức ăn cho vật nuôi quá cao, một mặt sẽ gây độc trực tiếp đến con vật, có thể gây ra vụ chết hàng loạt gây tổn thất về kinh tế; mặt khác, chất độc đi vào cơ thể vật nuôi và tích trữ một thời gian,... khi ăn mì bị nhiễm hàm lượng cao aflatoxin và acid boric Mức độ aflatoxin cao được tìm thấy trong khắp các bộ phận của cơ thể khi khám nghiệm tử thi như: gan, phổi, thận, tim, não và lá lách 2.1.6 Một số tác dụng của aflatoxins 2.1.6.1 Khả năng gây ung thư [1] Khả năng gây ung thư của aflatoxin được đề cập đầu tiên vào năm 1961 khi Lancaster và cộng sự chỉ ra sự ung thư gan trên chuột khi ăn những thức ... TỰ NHIÊN BỘ MÔN HÓA - - TRẦN VĂN PHI LONG ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXINS TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP KHỐI PHỔ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH:... Luận văn tốt nghiệp đại học Trần Văn Phi Long TÓM TẮT Một phương pháp đơn giản hiệu phát triển để xác định đồng thời aflatoxins thức ăn chăn nuôi phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép khối phổ. .. tài Định lượng aflatoxins thức ăn chăn nuôi phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép khối phổ Ký tên Tên sinh viên/học viên Ngày Luận văn tốt nghiệp ngành Hóa học Mã số: ……… Đã bảo vệ duyệt Hiệu