Viện khoa học công nghệ quốc gia Viện công nghệ sinh học đề tài nckh cấp nhà nớc nghiên cứu công nghệ tế bào kỹ thuật thị phân tử phục vụ chọn tạo giống trồng (thuộc Chơng trình KC 04, mã số KC 04.08) đề tài nhánh Sử dụng công nghệ tế bào thực vật để phục tráng, nhân nhanh xây dựng hệ thống sản xuất giống ba kích ngu tất có chất lợng cao bắt nguồn từ in vitro CNĐT: TS Phạm Văn Hiển Hà Nội - 2005 y tế viện dợc liệu báo cáo kết nghiên cứu đề tài nhánh cấp nhà nớc Tên đề tài nhánh: Sử dụng công nghệ tế bào thực vật để phục tráng, nhân nhanh xây dựng hệ thống sản xuất giống ba kích (Morinda officinalis How-Rubiaceae) ngu tất (Achyranthes bidentata Blume- Amaranthaceae) có chất lợng cao bắt nguồn từ in vitro Thuộc đề tài: Nghiên cứu sử dụng công nghệ tế bào kỹ thuật thi phân tử phục vụ chọn tạo giống trồng Mã số: KC 04-08 Thuộc chơng trình: Nghiên cứu KHCN phát triển công nghệ sinh học (2001-2005) Chủ trì đề tài: PGS TSKH Lê Thị Muội Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghệ sinh học Viện KH &CN quốc gia Chủ trì đề tài nhánh: TS Phạm Văn Hiển Cơ quan chủ trì đề tài nhánh: Viện Dợc liệu- 3B Quang Trung, Hà Nội Điện thoại: 252 644 - 247 057 - 257 904 Fax: 84-4- 254 357 E-mail: imm@fpt.vn Thời gian thực hiện: 1/2001- 9/2004 Tổng kinh phí đợc cấp: 120 triệu VND Những ngời thực chính: CN Vũ Hoài Sâm ThS Nguyễn Trần Hy CN Tạ Nh Thục Anh KS Trần Thị Liên A tóm tắt kết bật đề tài Kết + Đã xây dựng đợc quy trình nhân nhanh in vitro ba kích từ lát cắt đốt thân chồi với hệ số nhân 204/năm, tỷ lệ rễ in vitro đạt >90%, tỷ lệ rễ ex vitro đạt 100%, tỷ lệ sống sau bầu đạt 70-80% + Đã xây dựng đợc quy trình nhân nhanh in vitro ngu tất từ đốt thân chồi, với hệ số nhân 69/năm, tỷ lệ rễ in vitro đạt 90%, tỷ lệ sống sau bầu đạt 70-90% tuỳ thời vụ + Đã tạo đợc mô sẹo ngu tất từ gốc thân trục dới mầm + Đào tạo: kỹ s tốt nghiệp (Trơng Thị Duyên, Tăng Bá Dơng, ĐHNNI) cao học viết (Vũ Hoài Sâm, ĐHKHTN HN) + Đã có báo đợc đăng {1 Vũ Hoài Sâm et al Nghiên cứu nhân nhanh in vitro ba kích Báo cáo khoa học, Hội nghị CNSH toàn quốc 2003, NXB KH&KT, tr, 795-798 Vu Hoai Sam et al In vitro propagation of Morinda officinalis How (Rubiaceae) The Fifth Princess Chulabhorn International Science Congress: Evolving Genetics and Its Global Impact, Aug 16-20, 2004, Bangkok Amarin Printing and Publishing Public Company Limited, Bangkok, Thailand Vol II, p 141} Đánh giá thực đề tài đối chiếu với đề cơng nghiên cứu đợc duyệt a Tiến độ thực Đã triển khai thực tất nội dung nghiên cứu tiến độ 36 tháng b Thực mục tiêu đề +Đối với ba kích: hoàn thành mục tiêu xây dựng đợc quy trình nhân nhanh in vitro +Đối với ngu tất: hoàn thành khoảng 40% mục tiêu Cụ thể, xây dựng đợc quy trình nhân nhanh bảo toàn (true-to-type) tạo đợc mô sẹo từ phận khác (gốc thân, hypocotyl); cha chọn đợc dòng tế bào tái sinh thành Lý do: mô sẹo ngu tất tạo từ nguyên liệu có tuổi sinh lý khác bị browning; xử lý nhiều cách nhng cha khắc phục đợc c Đánh giá sử dụng kinh phí Tổng kinh phí đợc cấp: 120 triệu VND Đã toán: 110 triệu (còn 10 triệu kinh phí 2004 toán) Việc chi tiêu toán tuân thủ quy định hành Tuy nhiên, kinh phí đợc cấp so với khối lợng công việc nhỏ, mục ngân sách đợc phân bổ lại không cân đối, gây nhiều trở ngại việc chi tiêu d Đề xuất liên quan đến đề tài +Quy trình nhân nhanh in vitro ba kích công trình lần đợc xây dựng Việt Nam (chúng cha tìm đợc tài liệu công bố giới vấn đề này) ứng dụng vào sản xuất Đề nghị đợc thử nghiệm khuôn khổ dự án P thời gian tới để hoàn thiện khẳng định +Đối với ngu tất, vấn đề già hoá giống tợng đặc thù Việt Nam (do di thực từ vùng ôn đới) cha đợc nghiên cứu nớc Đề nghị cần có nghiên cứu sâu công nghệ tế bào ứng dụng công nghệ gien nhằm tạo giống ngu tất phù hợp với điều kiện khí hậu nớc ta B Nội dung báo cáo kết Đặt vấn đề Cây ba kích Theo y học cổ truyền, ba kích vị thuốc có tác dụng bổ trí não, trợ dơng, ích tinh, mạnh gân cốt, chữa bệnh tình dục, ngời già mệt mỏi, ăn, ngủ nhng biểu bệnh lý Đặc biệt, giúp bình thờng hoá cải thiện tình dục nhng ba kích không kích dục, tác dụng kiểu androgen không độc [9] Gần đây, thành phần hoá học [11] nhiều tác dụng dợc lý ba kích đợc phát nh chống stress [4], chống trầm cảm [5,12] chống oxy hoá [8] Với phơng châm phòng bệnh chữa bệnh ngành y tế, việc nghiên cứu sản xuất loại thuốc bổ để tăng cờng sức khoẻ thờng xuyên cộng đồng, góp phần ngăn ngừa bệnh tật ngày tăng đợc đẩy mạnh Trong bối cảnh đó, ba kích trở thành thuốc địa độc đáo nớc ta Mặt khác, ba kích lại câychỉ thích hợp để trồng xen đất đồi, không cạnh tranh đất với trồng khác, vậy, có ý nghĩa to lớn cho việc tăng thu nhập cho đồng bào vùng cao Trớc năm 1970, nguồn ba kích dựa vào việc khai thác tự nhiên từ rừng thuộc số tỉnh phía Bắc nh Tuyên Quang, Yên Bái, Phú Thọ, Lạng Sơn, Hà Bắc, Quảng Ninh, Hoà Bình Hà Tây [2] Do nhu cầu nớc giới ngày tăng nên ba kích mọc hoang bị khai thác ngày kiệt quệ Mặt khác, rừng vùng phân bố ba kích bị tàn phá nghiêm trọng khiến lâm vào tình trạng gần nh tuyệt chủng bị liệt vào sách đỏ Việt Nam [1] Vì vậy, việc nghiên cứu trồng ba kích đờng để trì phát triển nguồn thuốc quý Nhng nay, việc nhân giống tồn tại, cản trở việc mở rộng diện tích trồng ba kích Cây trồng sau 15 tháng có 3,5% số hoa sau 22 tháng có 1,2% số đậu Sau năm, tý lệ đạt khoảng 30% hệ số nhân giống hạt chí đạt 1,1/năm Ba kích nhân giống cành giâm, nhng hệ số nhân phơng pháp đạt 0,61/năm, sử dụng chất kích thích sinh trởng [3] Tóm lại, phơng pháp nhân giống truyền thống nh gieo hạt, giâm cành đáp ứng nhu cầu giống để phát triển trồng ba kích, vòng 15 - 20 năm tới, cha kể đến hạn chế phơng pháp sinh trởng, phát triển, suất chất lợng trồng Vì vậy, việc sử dụng công nghệ tế bào thực vật để nhân nhanh ba kích yêu cầu cấp bách Cây ngu tất Rễ củ ngu tất vị thuốc quan trọng phổ biến y học cổ truyền, công hiệu bệnh có nguyên từ gan, thận, đau lng, mỏi gối, viêm thấp đa khớp, chân tay co quắp, bại liệt Ngu tất có mặt hàng trăm thuốc đông y khác đợc bào chế thành dạng thuốc lu hành rộng rãi thị trờng nh viên Bidentin dùng để chữa tăng cholesterol máu, rối loạn lipoprotein máu, cao huyết áp, viên Dentonin chữa viêm lợi viêm quanh [10] Là di thực (1960) trở thành địa, ngu tất đợc trồng quy mô lớn đồng trung du Bắc cấu trồng vụ đông với sản lợng hàng ngàn tấn, đạt hiệu cao nhiều rau màu vụ đông khác Tuy nhiên, năm gần đây, nhu cầu nớc giới ngày tăng diện tích trồng ngu tất lại dần bị thu hẹp Nguyên nhân dẫn đến tình trạng giống ngu tất bị thoái hoá theo chiều hớng hoa sớm, củ nhỏ, nhiều xơ, suất giảm làm nản lòng ngời trồng hiệu kinh tế thấp Bình thờng, ngu tất gieo trồng vào tháng 9-10, đến thu hoạch (tháng 4-5 năm sau ) hoa Nhng nay, trồng sau 2-3 tháng hoa (tháng 12-1) chí có năm hoa vào tháng 11 Việc phục tráng thiết lập hệ thống sản xuất hạt giống ngu tất có chất lợng cao nhu cầu xúc Cho đến nay, cha có công trình nghiên cứu để giải vấn đề cách triệt để để ứng dụng vào sản xuất Đối tợng phơng pháp nghiên cứu Đối tợng nghiên cứu: Giống ba kích (3 năm tuổi) đợc lấy từ vờn giống Thanh Hoá thuộc đề tài KHYD 02-21R Bộ Y tế quản lý Giống ngu tất đợc lấy từ Trung tâm nghiên cứu trồng chế biến thuốc Hà Nội Viện Dợc liệu Giống đợc dùng sản xuất dợc liệu đồng trung du Bắc Phơng pháp nghiên cứu: Là phơng pháp phổ biến nuôi cấy mô - tế bào thực vật a Ba kích: Ngọn chồi đốt thân (dài 1-1,5 cm) lấy từ ba kích năm tuổi trồng đồng đợc rửa nớc xà phòng loãng, ngâm thuốc diệt năm khử trùng bề mặt HgCl2 0,07% 10 phút, tráng lại nhiều lần nớc cất vô trùng, cấy vào môi trờng dinh dỡng Murashige Skoog (MS) [6] Các chất điều hoà sinh trởng đợc bổ sung vào môi trờng với tổ hợp nồng độ khác Nồng độ thạch đợc dùng 6,5 g/l Tất môi trờng đợc điều chỉnh đến pH=5,8 trớc cho thạch hấp vô trùng 116 Co, áp suất 0,8kg/cm2 40 phút Mỗi công thức thí nghiệm đợc quan sát 12 mẫu b Ngu tất: Đoạn gốc thân (thờng gọi vùng mắt cua) đợc lấy trớc mầm ngủ phát động, khử trùng nuôi cấy tơng tự nh ba kích Riêng hypocotyl đợc tạo nh sau: Hạt ngu tất đợc cho nảy mầm giấy ẩm đĩa petri đặt tối hoàn toàn Khi dài 1,5-2 cm, tách lấy đoạn hypocotyl, đoạn dài 0,3-0,4 cm, khử trùng bề mặt cấy vào môi trờng dinh dỡng c Phòng nuôi: Đợc trì nhiệt độ 25-270C, độ ẩm 70%, cờng độ chiếu sáng 2000 lux với chu kỳ chiếu sáng 14 giờ/ngày Số liệu đợc xử lý theo Microsoft Excel (Anova) Kết nghiên cứu I Cây ba kích Tái sinh chồi sơ cấp in vitro Không có chồi lấy từ in vivo năm tuổi sống sót sau khử trùng nồng độ HgCl2 thời gian khác Chỉ có 20-30% số đốt thân (single-node stem cuttings) sống tái sinh đợc 1-2 chồi nách môi trờng MS có agar chứa 0.5 mg/l kinetin (Kin) (ảnh 1) Môi trờng đợc sử dụng để tạo số chồi sơ cấp đủ lớn để phục vụ cho nghiên cứu ảnh Chồi ba kích sơ cấp tái sinh từ lát cắt đốt thân môi trờng MS + 0,5 mg/l Kin ảnh chụp tuần sau cấy Nhân nhanh chồi Ngọn chồi đốt thân dài khoảng cm lấy từ chồi in vitro đợc cấy vào môi trờng dinh dỡng gồm khoáng, vitamin, đờng, thạch theo MS có bổ sung BAP với nồng độ 0,5; 1; 2; mg/l Kết theo dõi 75 ngày sau cấy đợc trìng bày bảng Bảng 1: ảnh hởng BAP đến khả tái sinh cụm chồi chồi đốt thân ba kích in vitro môi trờng MS có thạch BAP (mg/l) 0,5 1,0 2,0 3,0 5,0 0,5 1,0 2,0 3,0 5,0 Tỷ lệ hình thành cụm Số chồi/lát cắt chồi (%) Ngọn chồi 100 6,92 3,58 a 100 9,75 4,45 b 100 8,38 4,96 a 100 18,80 8,99 c 100 9,69 6,96 b Lát cắt đốt thân 100 8,87 4,12a 100 12,22 4,89b 100 10,60 4,72ab 100 23,52 9,26c 100 14,00 6,71b Độ dài chồi (cm) 5,502,61 4,642,86 4,042,15 3,761,93 3,352,37 5,622,01 4,541,94 4,101,76 3,681,32 3,212,08 Các số trung bình cột đợc đánh dấu chữ khác ý nghĩa thống kê mức xác suất 5% theo Duncans multiple range test Cụm chồi hình thành tất môi trờng nuôi cấy sau khoảng 20 ngày nuôi cấy Lúc đầu, khối mô sẹo nhỏ xuất mặt dới lát cắt, sau nhiều chồi bắt đầu hình thành từ nách lát cắt đốt thân nách thấp chồi Sau đó, chồi đợc tái sinh từ chồi phụ khối mô sẹo (adventitious shoots) Nh vậy, chồi đợc hình thành đờng trực tiếp từ chồi nách đờng gián tiếp thông qua moo sẹo Số chồi/lát cắt cao (18.80 8.99 chồi từ chồi 23.52 9.26 chồi từ lát cắt đốt thân) đạt đợc môi trờng MS chứa 3.0 mg/l BAP Ngọn chồi tỏ lát cắt đốt thân việc tái sinh chồi (ảnh 2) Điều chồi chịu ảnh hởng u ảnh Cụm chồi ba kích tái sinh từ đốt thân (hàng trên) từ chồi (hàng dới) môi trờng MS + 3,0 mg/l BAP ảnh chụp 60 ngày sau cấy Khi tăng nồng độ BAP lên ngỡng tối u (3mg/l), chiều cao chồi giảm dần, nhng đạt chiều cao cần thiết cho việc tách chồi để cấy truyền Vợt ngỡng này, số chồi/mẫu lẫn chiều cao chồi giảm bắt đầu có tợng mọng nớc (vitrification) Căn vào kết thí nghiệm này, chọn môi trờng MS + 3mg/l BAP để tạo cụm chồi ba kích môi trờng này, hệ số nhân chồi đạt cao nhng độ biến động mẫu tơng đối lớn, thể độ lệch chuẩn cao Thực tế có mẫu 40 chồi, nhng có mẫu đạt 5-7 chồi Muốn tăng hệ số nhân, cần nghiên cứu tăng độ đồng mẫu Sau thu hoạch tất đốt thân chồi, phần gốc lại cụm đợc cấy truyền lần cấy Đáng ý khối mô ngày to cho nhiều chồi Cụm chồi tái sinh từ gốc thờng sinh trởng nhanh, khoẻ, to so với chồi tái sinh từ đốt thân chồi (ảnh 3) ảnh Cây ngu tất in vitro nhân từ đốt thân môi trờng MS chất ĐTST ảnh chụp 20 ngày sau cấy c Chuyển vờn ơm Sau 30 ngày nuôi ống nghiệm, ngu tất đợc chuyển vờn ơm theo phơng pháp nh sau: Cây đợc rửa khỏi môi trờng bám rễ, sau trồng giá thể gồm cát + đất + phân mục (1:1:1) khay đạt nhà lới, tớ ẩm hàng ngày Sau 7-8 ngày, bắt đầu hồi xanh, rễ tiếp tục sinh trởng bình thờng Ngay đa vào thời điểm (mùa hè) không phù hợp với thời vụ bình thờng ngu tất nhng sống với tỷ lệ >70%, chứng tỏ nhân theo phơng pháp trình bày có sức sống tốt (ảnh 7) ảnh Cây ngu tất in vitro vờn ơm ( 75 ngày tuối) Nghiên cứu tạo mô sẹo ngu tất a/ Từ gian đốt thân Đoạn đốt thân (gian đốt, internode) không chứa chồi nách dài 0,3-0,5cm lấy từ phần gốc đồng ruộng trớc giai đoạn cua đợc cấy vào môi trờng khác để tạo mô sẹo Kết đợc trình bày bảng ảnh Bảng ảnh hởng chất ĐTST đến hình thành mô sẹo từ gian đốt thân ngu tất (30 ngày sau cấy) Thành phần môi trờng Tỷ lệ hình thành mô sẹo (%) Ghi MS+1mg/lNAA 100 Xốp MS+1mg/lNAA+0,2mg/lBAP 100 Rắn, cục MS+1mg/l 2,4-D 100 Mọng nớc MS+1mg/l 2,4-D+0,2mg/lBAP 100 Xốp Kết cho thấy môi trờng có tác dụng kích thích hình thành mô sẹo Với mục đích tạo mô sẹo để tái sinh thành sau này, chọn môi trờng MS + mg/l NAA +0,2 mg/l BAP môi trờng này, mô sẹo rắn có cấu trúc dạng cục Theo kinh nghiệm, dạng mô sẹo có khả tái sinh cao ảnh ảnh hởng chất ĐTST đến hình thành mô sẹo từ gian đốt thân ngu tất Từ trái sang phải: MS+1mg/lNAA; MS + mg/l NAA + 0,2 mg/l BAP; MS+1mg/l 2,4-D; MS + 1mg/l 2,4-D + 0,2 mg/l BAP Tuy nhiên, mô sẹo ngu tất nhanh chóng bị hoá nâu trình cấy chuyền, thử bổ sung chất chống oxy hoá nh acid ascorbic, acid citric, thay saccharose glucose chất hấp phụ nh than hoạt polyvinylpyrrolidon với nồng độ khác Vì vậy, thử tạo mô sẹo từ hypocotyl loại mô có tính chất phôi sinh cao b/ Từ hypocotyl Hạt ngu tất đợc ủ nảy mầm giấy thấm đĩa petri đặt buồng tối Sau 15 ngày, dài 2-2,5 cm, cắt lấy đoạn hypocotyl dài 0,3-0,5 cm, xử lý vô trùng cấy vào môi trờng khác Mỗi công thức gồm 20 mẫu Kết đợc trình bày bảng Bảng Tác dụng IBA tới trình hình thành mô sẹo từ hypocotyl ngu tất (30 ngày sau cấy) Thành phần môi trờng Tỷ lệ hình thành mô sẹo (%) Ghi MS + 0,5mg/lIBA 100 Màu nâu đen, nhỏ nh hạt đậu MS +1mg/l IBA 100 Màu vàng nâu, to hạt lạc, có mẫu tái sinh thành MS +1,5mg/l IBA 100 Màu nhạt, to hạt lạc, mọng nớc MS + 2mg/l IBA 100 Màu sầm, to hạt lạc, mọng nớc, nhiều rễ Bảng cho thấy môi trờng MS +1mg/l IBA môi trờng thích hợp để tạo mô sẹo từ hypocotyl ngu tất Chúng dùng môi trờng để tạo mô sẹo phục vụ cho việc cấy truyền Nhng sau 12-15 ngày, khối mô sẹo bị hoá nâu (ảnh 9) áp dụng tất biện pháp nh dùng mô sẹo từ gian đốt thân không khắc phục đợc tợng ảnh Mô sẹo ngu tất từ hypocotyl môi trờng MS +1mg/l IBA (20 ngày sau cấy) Kết luận chung Cây ba kích Chồi in vitro tái sinh thuận lợi từ lát cắt đốt thân môi trờng MS + 0,5 mg/l Kin Môi trờng tốt để nhân nhanh cụm chồi từ chồi lát cắt đốt thân MS + 3,0 mg/l BAP Chồi in vitro rễ in vitro tốt (>90%) môi trờng 1/4MS không chứa chất ĐTST Từ tháng đến tháng điều kiện thời tiết Hà Nội, chồi in vitro xử lý cho rễ ex vitro đạt 100% Cây in vitro đạt tỷ lệ sống 70-80% tuỳ theo thời điểm cây, rễ ex vitro đạt tỷ lệ sống 100% Cây ngu tất Môi trờng tạo chồi in vitro sơ cấp tốt MS + 0,1 mg/l IBA Môi trờng tốt để nhân nhanh tạo rễ từ lát cắt đốt thân chồi MS chất ĐTST môi trờng này, tỷ lệ rễ đạt 90% nhng khoẻ, không kèm theo mô sẹo đạt tỷ lệ sống 100% chuyển vờn ơm Có thể tạo mô sẹo từ gian đốt thân môi trờng MS + 1mg/l NAA + 0,2mg/l BAP từ hypocotyl môi trờng MS +1mg/l IBA Mô sẹo ngu tất từ hai nguồn nguyên liệu bị hoá nâu trình cấy chuyền Cha tìm đợc biện pháp khắc phục Tài liệu tham khảo Bộ KHCN & MT Sách đỏ Việt Nam NXB KHKT, Hà Nội, 1996 Nguyễn Chiều et al Phân bố ba kích miền Bắc Việt Nam Thông báo dợc liệu 10, 30, 1978 Nguyễn Chiều Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Bộ KHYD 02-21R - Viện Dợc liệu, 2001 Li YF, Yuan L, Xu YK, Yang M, Zhao YM, Luo ZP Antistress effect of oligosaccharides extracted from Morinda officinalis in mice and rats Acta Pharmacol Sin 2001, 22(12):1084-8 Li YF, Gong DH, Yang M, Zhao YM, Luo ZP Inhibition of the oligosaccharides extracted from Morinda officinalis, a Chinese traditional herbal medicine, on the corticosteron induced apoptosis in PC12 cells Life Sci.2003, 72(8): 933-42 Murashige, T and F Skoog 1962 A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Physiol Plant 15: 473-97 Pierik, R L M In vitro culture of Higher Plants Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, 1987, p.206 Soon, Y Y., Tan, B K H Evaluation of the hypoglycemic and anti-oxydant activities of Morinda officinalis in the streptozotoin-induced diabetic rats Singapore Medical Journal 2002, 43(2): 77-85 Viện Dợc liệu, Tài nguyên thuốc Việt Nam NXB KHKT, Hà Nội, 1993 10 Viện Dợc liệu Selected Medicinal Plants in Vietnam, NXB KHKT, 1999 (in English) 11 Yoshikawa M, Yamaguchi S, Nishisaka H, Yamahara J, Murakami N Chemical constituents of Chinese natural medicine, morindae radix, the dried roots of Morinda officinalis How: structures of morindolide and morofficinaloside Chem Pharm Bull (Tokyo) 1995, 43(9): 1462-5 12 Zhang ZQ, Yuan L, Yang M, Luo ZP, Zhao YM The effect of Morinda officinalis How, a Chinese traditional medicinal plant, on the DRL 72-s schedule in rats and the forced swimming test in mice Pharmacol Biochem Behav 2002, 72(1-2): 39-34 I - Gii thiu chung Cõy ba kớch (Morinda officinalis How Rubiaceae) Theo y hc c truyn, ba kớch l v thuc cú tỏc dng b trớ nóo, tr dng, ớch tinh, mnh gõn ct, cha cỏc bnh v tỡnh dc, ngi gi mt mi, kộm n, ớt ng nhng khụng cú biu hin v bnh lý c bit, giỳp bỡnh thng húa v ci thin tỡnh dc nhng ba kớch khụng kớch dc, khụng cú tỏc dng kiu androgen v khụng c Gn õy, thnh phn húa hc v nhiu tỏc dng dc lý mi ca ba kớch ó c phỏt hin nh chng stress, chng trm cm, v chng oxy húa Vi phng trõm phũng bnh hn cha bnh ca ngnh y t, vic nghiờn cu sn xut cỏc loi thuc b tng cng sc khe thng xuyờn ca cng ng, gúp phn ngn nga bnh tt ngy cng c y mnh Trong bi cnh ú, ba kớch ang tr thnh mt nhng cõy thuc bn a c ỏo ca nc ta Mt khỏc, ba kớch li l cõy ch thớch hp trng xen t i, khụng cnh tranh v t vi cỏc cõy trng khỏc, vỡ vy, nú cú ý ngha to ln vic tng thu nhp cho ng bo vựng cao Trc nhng nm 1970, ngun ba kớch ch da vo vic khai thỏc t nhiờn t rng thuc mt s tnh phớa Bc nh Tuyờn Quang, Yờn Bỏi, Phỳ Th, Lng Sn, H Bc, Qung Ninh, Ho Bỡnh v H Tõy Do nhu cu nc v th gii ngy cng tng nờn ba kớch mc hoang b khai thỏc ngy cng kit qu Mt khỏc, rng vựng phõn b ca ba kớch b tn phỏ nghiờm trng khin cõy lõm vo tỡnh trng gn nh tuyt chng v b lit vo sỏch Vit Nam Vỡ vy, vic nghiờn cu trng cõy ba kớch l ng nht trỡ v phỏt trin ngun thuc quý ny Nhng hin nay, vic nhõn ging l mt tn ti, cn tr vic m rng din tớch trng ba kớch Cõy trng sau 15 thỏng mi cú 3,5 % s cõy hoa v sau 22 thỏng mi cú 1,2 % s cõy u qu Sau nm, t l ny cng ch t khong 30 % v h s nhõn ging bng ht ch t 1,1/nm (thu ht ca trng 1,1 ha) Ba kớch cng cú th nhõn ging bng cnh giõm, nhng h s nhõn ca phng phỏp ny ch t 0,61/nm (thu cnh ca trng 0,65 ha), mc dự ó s dng cỏc cht kớch thớch sinh trng Túm li, cỏc phng phỏp nhõn ging truyn thng nh gieo ht, giõm cnh khụng th ỏp ng nhu cu v cõy ging phỏt trin trng ba kớch, ớt nht vũng 15 20 nm ti, cha k n nhng hn ch ca phng phỏp ny i vi s sinh trng, phỏt trin, nng sut v cht lng ca cõy ging Vỡ vy, vic s dng cụng ngh t bo thc vt nhõn nhanh ba kớch l yờu cu rt cp bỏch Cõy ngu tt (Achyranthes bidentata Blume Amaranthaceae) R c ngu tt l v thuc quan trng v ph bin y hc c truyn, rt cụng hiu i vi cỏc bnh cú cn nguyờn t gan, thn nh au lng, mi gi, viờm thp a khp, chõn tay co qup, bi litNgu tt cú mt hng trm bi thuc ụng y khỏc v ó c bo ch thnh cỏc dng thuc lu hnh rng rói trờn th trng nh viờn Bidentin dựng cha tng cholesterol mỏu, ri lon lipoprotein mỏu, cao huyt ỏp; viờn Dentonin cha viờm li v viờm quanh rng L mt cõy di thc (1960) ó tr thnh cõy bn a, ngu tt c trng trờn quy mụ ln ng bng v trung du Bc b c cu cõy trng v ụng vi sn lng hng ngn tn, t hiu qu cao hn nhiu cõy rau mu v ụng khỏc Tuy nhiờn, my nm gn õy, nhu cu nc v th gii ngy cng tng thỡ din tớch trng ngu tt li gim dn cõy b thoỏi húa theo chiu hng hoa sm, c nh, nhiu x, nng sut gim v vỡ vy, hiu qu kinh t thp Bỡnh thng, ngu tt gieo trng vo thỏng 10, n sp thu hoch (thỏng 4-5 nm sau) mi hoa Nhng hin nay, cõy trng sau 2-3 thỏng ó hoa (thỏng 12-1) thm cú nm cõy hoa vo thỏng 11 Vic phc v thit lp mt h thng sn xut ht ging ngu tt cú cht lng cao l mt nhu cu bc xỳc Cho n nay, cha cú cụng trỡnh no nghiờn cu gii quyt ny mt cỏch trit ng dng vo sn xut II - a ch ỏp dng Cỏc n v sn xut ging, sn xut dc liu c bit thớch hp vi cỏc phũng nuụi cy mụ ca cỏc tnh nỳi v trung du Vit Nam III Trang thit b, hoỏ cht Trang thit b: Trang thit b ca mt phũng nuụi cy mụ c bn gm t cy laminar, ni hp, mỏy ct nc, mỏy o pH, ng nghim v bỡnh tam giỏc thu tinh chu nhit, v cỏc dng c thao tỏc pha mụi trng (ng ong) v cy mu t cy (dao, kộo, panh, a petri) Phũng nuụi c trỡ nhit 25-270C, m 70 %, cng chiu sỏng 2000 lux vi chu k chiu sỏng 14 gi/ngy Thnh phn mụi trng: theo mụi trng ca Murashige v Skooge nm 1962 (MS) Chun b cỏc dung dch m: Cỏc cht khoỏng c pha thnh cỏc dung dch m: MS1 MS2 MS3 NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 33 g 38 g 8,8 g 9,2 g 3,4 g FeSO4.7H2O EDTA 2,785 g 3,725 g H3BO3 MnSO4 ZnSO4 KI Na2MoO4 CuSO4 CoCl2 310 mg 1115 mg 430 mg 41,5 mg 12,5 mg 1,25 mg 1,25 mg Pha lớt Pha 0,5 lớt Pha 0,5 lớt Cỏc dung dch m c bo qun t lnh Khi pha mụi trng, mt lng nc ct bng 2/3 th tớch cn pha vo mt cc, bỡnh thu tinh hoc ni nhụm/inox, ri cho thờm cỏc dung dch m vi lng nh sau: MS1: 100 ml MS2: ml MS3: 10 ml Sau ú, cho vo mi lớt mụi trng cỏc cht vi nng tng ng di õy: Pyridoxin (VTM B6) A nicotinic Thiamin (VTM B1) Glicin Adenin Inositol 0,5 mg 0,5 mg 0,1 mg mg mg 100 mg VTM ng sucrose Tu theo giai on (s ghi c th phn sau) Cỏc cht iu tit sinh trng (vi nng tu theo giai on): Cytokinin: 6- benzyladenin purin (BAP); kinetin (Kn) Auxin: -indol butiric acid (IBA); -naphtyl acetic acid ( NAA) Dựng dung dch 0,1N HCl hoc 0,1 KOH chnh pH n 5,8 Sau ú, thờm: Thch (agar) g/l Than hot tớnh (THT) 0,5 g/l un sụi nh la v khuy thng xuyờn n tan ht thch mụi trng vo ng nghim hoc bỡnh cy vi lng theo yờu cu, nỳt li v kh trựng 116OC, ỏp sut 0,8 kg/cm2 40 phỳt Khi ht thi gian kh trựng, ly mụi trng ni hp, mang vo phũng cy c nh cho mụi trng ngui dn v ụng li IV Qui trỡnh 1- Cõy ba kớch Bc 1: Ly mu: Chn cnh non, kho, khụng b sõu bnh, b lỏ Nu mang i xa, phi nhỳng vo nc sach, bc giy bỏo, b vo tỳi nylon buc kớn gi cho cnh khụng bi hộo Trỏnh lm gip nỏt cnh Bc 2: Trc kh trựng mu, cn ng t cy (laminair) mỏy lm vic ớt nht 30 phỳt Cỏc dng c dựng thao tỏc t cy nh cc thu tinh hoc bỡnh tam giỏc ming rng, dao, kộo, panh phi c hp vụ trựng Kh trựng mu: Lúng ca ba kớch khỏ di, vỡ vy, nờn ct cnh thnh nhng on di 3-4cm, mi on cha mt t khong gia Ra sch bi t bng nc mỏy, ngõm nc x phũng loóng t 10 -12 phỳt v lc u, sau ú, sch bng nc vụ trựng a mu vo t cy, chuyn sang cc thu tinh hoc bỡnh tam giỏc ming rng, mu bng cn 75%, dung dch HgCl2 0,07 % vo v ngõm 10 phỳt, sau ú, li nhiu ln bng nc ct vụ trựng Khi cy, ct b hai u mu (v phn ngoi cng lỏ, gn sỏt n t thõn), ch li mt on di 1-1,5cm cha t thõn/mt ng khong gia ri cy vo mụi trng dinh dng Bc 3: Cy ng Mu sau c kh trựng cy vo mụi trng :(BS1) MS + VTM + 30 g/l ng + 0,7 g/l thch + 0,5 mg/l Kn + pH 5,8 Sau tun , t mi t thõn phỏt sinh chi nỏch nỏch lỏ ca t thõn Sau 16 tun chi ln cy truyn Bc 4: Giai on nhõn nhanh Ct cỏc chi thu c giai on ng thnh tng ngn v tng t thõn riờng l (khong 1cm), cy c loi mu: ngn, t v phn gc cũn li vo mụi trng BS2: MS + VTM + mg/l BAP + 30 g/l ng + 7mg/l thch + pH 5,8 Sau 12 tun nuụi cy, trung bỡnh mi mu cho khong 20 chi, vi chiu cao mi chi t 2-5cm Bc 5: Giai on to cõy hon chnh Tỏch cỏc chi t tiờu chun t 3-4 t thõn tr lờn cy vo mụi trng to r, (BS3): 1/4 MS + VTM + 0,5 g/l THT + g/l thch + pH 5,8 Nuụi giai on ny 1,5 thỏng Cỏc chi khụng t tiờu chun to r tip tc c cy chuyn vo mụi trng nhõn nhanh nh bc Bc 6: Giai on a cõy m Thng tin hnh vo xuõn, hố v thu ri nuụi tip n thỏng nm sau Cho cõy lm quen dn vi mụi trng t nhiờn bng cỏch a bỡnh nuụi phũng nuụi, t iu kin nhit v ỏnh sỏng phũng Cú hai cỏch to cõy ging ngoi m, ú l: Cỏch 1: To r ex vitro Tỏch cỏc chi in vitro cú t t tr lờn ( 4cm) cm, sch mụi trng bng nc thng, nhỳng nhanh (quick-deep) vo dung dch IBA (1 mg/l), ri cy vo bu nylon cha hn hp t mu, tru hun v phõn mc (6:2:1) v nuụi iu kin phun sng vi tn sut 15 phỳt/gi Sau 10 ngy cỏc chi hỡnh thnh r Cỏch 2: a cõy bu Rỳt cõy in vitro bỡnh, sch thch bỏm r ri cng cy vo bu nylon v nuụi iu kin mụi trng nh trờn Thi im thớch hp cho phng phỏp ny l t thỏng n thỏng iu kin thi tit H Ni Cỏc bc tin hnh trờn c mụ t bng qui trỡnh sau: 14 lát cắt đốt thân in vivo Tái sinh chồi sơ cấp Tháng thứ 14 ống nghiệm môi trờng BS1 (=210 ml BS1) Tháng thứ 28 mẫu, cấy vào 28 bình tam giác môi trờng BS2 (=2100 ml BS2) Tháng thứ 1680 mẫu, cấy vào 560 bình tam giác môi trờng BS2 (3 mẫu/bình; = 42000 ml môi trờng BS2) Tháng thứ 11 100800 chồi, cấy vào 20160 bình tam giác môi trờng BS3 (5 chồi/bình; =1512000 ml môi trờng) Giai đoạn nhân nhanh (tạo cụm chồi) Giai đoạn tạo hoàn chỉnh Tháng thứ 12 100800 con, chuyển bầu đất Cõy ngu tt a) Nhõn nhanh in vitro bng phng phỏp tỏi sinh trc tip Bc 1: Ly mu Ly on gc thõn (thng c gi l mt cua) trc mm ng phỏt ng, di 1- 1,5cm t cõy ó c chn lc Bc 2: Kh trựng Kh trựng cỏc on gc thõn trờn tng t nh i vi ba kớch Bc 3: Cy ng (To cõy in vitro s cp) Cỏc mu sau kh trựng c cy vo mụi trng NS1, bao gm cỏc thnh phn sau: MS + 0,1 mg/l IBA + VTM + 20 g/l ng + pH 5,8 (NS1) Sau 40 ngy, chi ng phỏt sinh mt cua, cao ti 11cm nhng ch cú trung bỡnh 2-3 t Bc 4: Nhõn nhanh Ct ngn chi v t thõn cõy ngu tt in vitro (di 1- 1,5cm) cy vo mụi trng: MS + VTM + 20 g/l ng + 7g/l thch + pH 5,8 (NS2) Cy truyn nhiu ln nhõn c s cõy cn thit C sau mi 30 ngy cy chuyn mt ln Cõy nhõn mụi trng ny khụng cn phi qua giai on to r v cú th a thng bu Bc 5: a cõy m (thng thc hin vo thỏng 9- thỏng 10 hng nm) Sau 30 ngy nuụi ng nghim, cy ngu tt c chuyn m theo phng phỏp nh sau: Cõy c sch mụi trng nuụi cy bỏm trờn r, sau ú trng vo bu nylon cha cỏt + t + phõn mc (1:1:1) t cỏc bu ny iu kin m v ti m hng ngy Sau 30 ngy a cõy rung trng thu ht b) Nhõn in vitro bng ng giỏn tip: Mụ so to c t gian t thõn (internode) cõy in vivo v t hypocotyl u b húa nõu quỏ trỡnh cy truyn Cha tỡm c bin phỏp khc phc Quy trỡnh nhõn nhanh cõy ngu tt: Cõy ngu tt in vivo Kh trựng HgCl2 10 phỳt Tỏi sinh chi s cp (NS1) 40 ngy Nhõn nhanh (NS2) Cõy in vitro t thõn v ngn chi 30 ngy Ra bu Cỏt: t:phõn mc (1:1:1) 30 ngy Rung (thỏng 9-10 hng nm) V- Mt s iu cn lu ý: Cõy ba kớch: - Qui trỡnh c hon thin khong thi gian n 1,5 nm, vi h s nhõn l (3 x 20)4/ nm - Giai on to r in vitro nờn c thc hin vo ụng n xuõn cú th a cõy bu - to 10 cõy mt nm cn a vo kh trựng 14 mu t in vivo, v cn 210 ml = 0,21 lớt mụi trng tỏi sinh (BS1); 44100 ml = 44,1 lớt mụi trng nhõn nhanh (BS2); 1512000 ml = 1.512 lớt mụi trng to r (BS3) Cõy ngu tt: - Vỡ ngu tt l cõy cú nhiu ht v nhõn ging khỏ d dng bng ht, nờn phng phỏp ny ch ỏp dng cho vic nhõn nhanh nhng cỏ th u dũng ó c chn lc ú l nhng cỏ th cú thi gian sinh trng sinh dng kộo di, chm hoa v cho nng sut c cao - Vo thi v ca ngu tt (thỏng 9- 10 hng nm), to cõy in vitro a ngoi - Qui trỡnh nhõn nhanh in vitro ngu tt kộo di nm, vi h s nhõn l 129/nm [...]... nồng độ của IBA -Khi bổ sung BAP vào môi trờng có IBA, chồi không những không sinh trởng mạnh thêm mà có chiều hớng giảm đi Điều này cho thấy tác dụng kích thích sinh trởng chồi của IBA thực chất là hệ quả của việc kích thích hình thành rễ Đầu tiên, IBA phát động sự hình thành rễ (từ khối mô sẹo), sau đó các rễ này tổng hợp nên cytokinin nội sinh để kích thích sinh trởng của chồi Quy luật có vẻ bất thờng... hainanense [] -IBA cũng có tác dụng kích thích hình thành mô sẹo Nhng mô sẹo thực chất đợc hình thành từ gian đốt (internode) ở phần gốc Bổ sung thêm BAP, mô sẹo hình thành và phát triển mạnh hơn Đây là tác dụng cộng hởng (synergic action) giữa hai nhóm auxin và cytokinin đối với quá trình phát sinh mô sẹo Tóm lại, chồi trong các môi trờng nói trên đều đợc tái sinh trực tiếp từ những chồi ngủ sẵn có. .. tái sinh trực tiếp Ngu tất là cây có nhiều hạt và nhân giống khá dễ dàng bằng hạt Mục tiêu của chúng tôi là thiết lập quy trình nhân nhanh in vitro không phải để trồng lấy dợc liệu mà để phục vụ cho việc nhân nhanh các cá thể đầu dòng đợc chọn tạo sau này Các cá thể này sẽ đợc trồng để thu hạt giống, sau đó dùng hạt giống để trồng lấy dợc liệu theo cách làm thông thờng a Tạo cây in vitro sơ cấp Để tạo... nylon và nuôi trong điều kiện nh trên Trong thời gian từ tháng 3 đến tháng 5 ở Hà Nội, 100% số chồi ra rễ chỉ sau 7-10 ngày và tiép tục sinh trởng, phát triển tốt (ảnh 5) ảnh 5 Cây ba kích ra rễ ex vitro và sinh trởng trong bầu ảnh chụp 90 ngày sau khi cấy Quy trình nhân nhanh in vitro cây ba kích Từ những kết quả nghiên cứu trên đây, chúng tôi đề xuất một quy trình nhân nhanh in vitro cây ba kích. .. đốt thân in vivo Khử trùng 0,07% HgCl2, 10 phút Tái sinh chồi sơ cấp MS + 0,5 mg/l Kin Nhân nhanh cụm chồi bằng lát cắt đốt thân và ngọn chồi, MS + 3,0 mg/l BAP Tách chồi đơn từ cụm chồi Tạo rễ in vitro (vào mùa đông) 1/4MS không có auxin Tạo rễ ex vitro trong bầu (vào mùa xuân, hè và thu) Ra bầu Theo tính toán, hệ số nhân của quy trình này đạt trung bình 204/năm II Cây ngu tất 1 Nhân nhanh in vitro... 3-butyric acid (IBA) đều ức chế sự ra rễ của ba bích tuỳ thuộc vào nồng độ (bảng 2) Phối hợp cả hai auxin cũng có tác dụng tơng tự (bảng 3) Hiện tợng dờng nh trái quy luật này đợc khẳng định thông qua việc bổ sung một lợng nhỏ kinetin, khi tỷ lệ ra rễ đợc cải thiện (hai tổ hợp cuối bảng 3) Điều này có thể do lợng cytokinin nội sinh của chồi ba kích in vitro khá cao Trong môi trờng MS không chứa auxin, tỷ lệ... chồi ba kích tái sinh từ ngọn chồi (trái), đốt thân (giữa) và phần gốc (phải) trong môi trờng MS + 3,0 mg/l BAP ảnh chụp 60 ngày sau khi cấy 3 Tạo rễ Các chồi đơn (đều không có rễ) dài ít nhất 3 cm, có 3 đôi lá trở lên đợc tách từ cụm chồi in vitro để nghiên cứu tạo rễ a/ Tạo rễ in vitro Tác dụng của các chất điều tiết sinh trởng: Trong môi trờng MS cò thạch, cả -naphthaleneacetic acid (NAA) và indole... hoá nâu (ảnh 9) áp dụng tất cả các biện pháp nh đã dùng đối với mô sẹo từ gian đốt thân đều không khắc phục đợc hiện tợng này ảnh 9 Mô sẹo ngu tất từ hypocotyl trong môi trờng MS +1mg/l IBA (20 ngày sau cấy) Kết luận chung Cây ba kích 1 Chồi in vitro tái sinh thuận lợi nhất từ lát cắt đốt thân trong môi trờng MS + 0,5 mg/l Kin 2 Môi trờng tốt nhất để nhân nhanh cụm chồi từ ngọn chồi và lát cắt đốt thân... 6 Môi trờng tốt nhất để nhân nhanh và tạo rễ từ lát cắt đốt thân và ngọn chồi là MS không có chất ĐTST ở môi trờng này, tỷ lệ ra rễ chỉ đạt 90% nhng cây khoẻ, không kèm theo mô sẹo và đạt tỷ lệ sống 100% khi chuyển ra vờn ơm 7 Có thể tạo mô sẹo từ gian đốt thân trong môi trờng MS + 1mg/l NAA + 0,2mg/l BAP và từ hypocotyl trong môi trờng MS +1mg/l IBA 8 Mô sẹo ngu tất từ cả hai nguồn nguyên liệu đều... môi trờng trên đều có tác dụng kích thích hình thành mô sẹo Với mục đích tạo ra mô sẹo để tái sinh thành cây sau này, chúng tôi đã chọn môi trờng MS + 1 mg/l NAA +0,2 mg/l BAP ở môi trờng này, mô sẹo rắn hơn và có những cấu trúc dạng cục Theo kinh nghiệm, đây là dạng mô sẹo có khả năng tái sinh cao ảnh 8 ảnh hởng của các chất ĐTST đến sự hình thành mô sẹo từ gian đốt thân ngu tất Từ trái sang phải: ... y tế viện dợc liệu báo cáo kết nghiên cứu đề tài nhánh cấp nhà nớc Tên đề tài nhánh: Sử dụng công nghệ tế bào thực vật để phục tráng, nhân nhanh xây dựng hệ thống sản xuất giống ba kích (Morinda... officinalis How-Rubiaceae) ngu tất (Achyranthes bidentata Blume- Amaranthaceae) có chất lợng cao bắt nguồn từ in vitro Thuộc đề tài: Nghiên cứu sử dụng công nghệ tế bào kỹ thuật thi phân tử phục. .. cầu giống để phát triển trồng ba kích, vòng 15 - 20 năm tới, cha kể đến hạn chế phơng pháp sinh trởng, phát triển, suất chất lợng trồng Vì vậy, việc sử dụng công nghệ tế bào thực vật để nhân