NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỘNG DI TRUYỀN TRÊN QUẦN THỂ LAI HỒI GIAO CỦA GIỐNG CHỐNG CHỊU ĐỘ ĐỘC CỦA SẮT TRÊN CÂY LÚA (ORYSA SATIVA L ) GS TS Bùi Chí Bửu1, GS TS Nguyễn Thị Lang2 Mở đầu Độ độc sắt làm giảm nghiêm trọng suất hạt Trong đất phèn trồng lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, độ độc sắt xem yếu tố hạn chế chính, với hàm lượng hữu cao, phản ứng với ion sắt điều kiện đất ngập nước Trong điều kiện canh tác trồng cạn, thí dụ lúa canh tác đất có điều kiện thoáng khí, khó tìm tượng ngộ độc sắt (Quijano Mendoza, 1994) Trong biểu loại đất có vấn đề, độ độc sắt thường gặp điều kiện pH đất thấp, khả trao đổi cation (CEC) thấp, trạng thái base thấp, cung cấp Mn thấp mức độ thoát nước (Ponnaperuma 1974, Ponnaperuma Solivas 1982) Độ độc sắt thường tìm thấy đất phèn trẻ (Sulfaquepts), đất phù sa cổ đất phù sa cát thoát nước (Hydraquents, Fluvaquents) thung lũng, đất acid phù sa phù sa cổ Tropaquepts Tropaquents, đất than bùn (Quijano Mendoza, 1994) Độ độc sắt lúa biểu thị bên triệu chứng sau: đốm nâu nhỏ li ti thứ hai sau cùng, vết nhỏ lan rộng làm có màu nâu, tím, vàng cam tùy theo giống lúa Có lúa cuộn tròn lại Trong trường hợp ngộ độc sắt nặng, thứ hai trở xuống trở nên nâu sậm chết Mức độ tăng trưởng khả đẻ nhánh bị ức chế, hệ thống rễ trở nên thô cứng có màu nâu sậm Nếu tượng ngộ độc sắt xảy muộn, khả tăng trưởng không bị ảnh hưởng, suất hạt bị giảm tính chất bất thụ Rễ lúa phát triển, đen, thối có sắt bao bọc bên Vật liệu phương pháp 2.1 Vật liệu Thanh lọc 93 giống cải tiến từ ngân hàng gen Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long Giống chuẩn kháng Pokkali Giống chuẩn nhiễm IR28 Tổ hợp lai: OM 1490/ AS 996; OM 6073/ OMCS 2004; AS 998/ jasmine 85 2.2 Phương pháp Thanh lọc độ độc sắt, Đánh giá tính chống chịu tuần sau gieo cấy % khô Điểm Mức độ Quan sát 0-20 Kháng 21-35 Kháng 36-50 51-70 71-90 91-100 Kháng Hơi kháng Hơi nhiễm Nhiễm Cây phát triển bình thường, triệu chứng Đẻ chồi bình thường, chóp hay phần nửa có điểm trắng tròn Phát triển đẻ chồi chậm lại, số bị tròn Chồi phát triển hầu hết bị tròn, vài phát triển Sự phát triển ngưng lại, hầu hết bị khô, vài chết Tất chết Đánh giá thị phân tử theo Lang 2002 -1 ViệnKHKTNN miền Nam, 2Viện lúa ĐBSCL Kết Thảo luận 3.1 Thanh lọc lúa chống chịu độ độc sắt Tại Viện Lúa ĐBSCL, vật liệu tạo giống chọn lọc để đánh giá, phát triển quần thể lai, chọn theo phương pháp phả hệ, với 307 dòng chống chịu độ độc nhôm (được thống kê từ F2 đến F6) Chọn 12 dòng ưu tú quần thể F6 Quần thể hồi giao (BC) phát triển với 30 tổ hợp lai, theo dõi từ BC1F1 đến BC3F3, với 354 dòng chống chịu phèn quần thể phân ly cuối hệ BC3F3 chọn 50 dòng Hình A Cây lúa tuần tuổi (0 ppm) Hình D Cây lúa tuần tuổi (0 ppm) Hình B Cây lúa tuần tuổi (20 ppm) Hình E Cây lúa tuần tuổi (20 ppm) Hình C Cây lúa tuần tuổi (100 ppm) Hình F Cây lúa tuần tuổi (100 ppm) Hình Thanh lọc lúa chống chịu độ độc sắt 3.2 Đánh giá hệ số di truyền tổ hợp ghi nhận cho hệ số di truyền cao ba tổ hợp lai Kết ước lượng hệ số di truyền theo nghĩa hẹp (h2NS) trình bày bảng Nhìn chung hệ số di truyền có giá trị cao cho tính trạng chống chịu độ độc sắt ba tổ hợp lai Cho thấy tính trạng kiểm soát chủ yếu yếu tố di truyền bên khả di truyền tính trạng cho tiếp tục chọn lọc hệ Bảng 1: Phương sai kiểu gen, phương sai kiểu hình, hệ số di truyền, hiệu chọn lọc so với giá trị trung bình tổ hợp lai tên chống chịu độ độc sắt STT Tổ hợp lai RRL/ Sắt OM 1490/ AS 996 OM 6073/ OMCS 2004 AS 996/ Jasmine 85 Σ2G 0.0853 0.1037 0.0878 σ2 P 0.0854 0.1037 0.0879 Hệ số di truyền (h2) 0.9993 0.9994 0.99925 GA / trung bình 0.514103 0.566645 0.521492 Nồng độ 300-500 ppm Fe hòa tan vùng rễ gây độc cho lúa Tanaka ctv (1966) ghi nhận hàm lượng sắt gây độc cho lúa biến thiên rộng 10 1000 ppm Van Breeman (1978) ghi nhận mức gây độc 20-40 mg/L đất có mức độ dinh dưỡng thấp bị ức chế hô hấp Trong đất cát, độ độc sắt xảy hàm lượng sắt mức 40-100 mg/L (Van Breeman Moorman 1978) Thanh lọc chống chịu độ độc sắt dung dịch khuyến cáo 100 ppm Fe++ pH = (Fageria Robelo 1987); 200 ppm Fe++ pH = (Yamaguchi Yoshida 1981), 500 ppm Fe + sucrose làm chất “anti-oxidant” (Aranda Ortico 1978) Hình 2: Sự biến động chiều dài rễ tương đối (RRL) phản ứng độ độc sắt 100ppm quân thể AS996 / Jasmine 85 Hình 3: Sự biến động LBI (chỉ số hóa nâu) phản ứng với độ độc sắt 100ppm quân thể AS996 / Jasmine 85 TỔ HỢP OM6073/ OMCS2004 OMCS2004 (RRL= 0.24) Hình 4: Sự biến động chiều dài rễ tương đối (RRL) phản ứng độ độc sắt 100ppm quân thể F2 OM 6073/OMCS2004 Hình 5: Sự biến động LBI phản ứng độ độc sắt 100ppm quân thể F2 OM 6073/OMCS2004 TỔ HỢP OM1490 / AS996 Hình 6: Sự biến động chiều dài rễ tương đối (RRL) phản ứng độ độc sắt 100 ppm quân thể F2 OM1490 / AS996 Hình 7: Sự biến động LBI phản ứng độ độc sắt 100 ppm quân thể F2 OM1490 / AS996 Bảng cho thấy, hiệu chọn lọc tổ hợp lai AS996/Jasmine 85 OM6073/ OMCS2004 biểu thị hai tính trạng chống chịu độ độc sắt Giống AS996 giống dẫn suất (derivative) từ IR64 / lúa hoang Oryza rufipogon (được thu thập Tràm Chim, ĐTM, 1991) Giống công nhận thức vào năm 2003, biểu thị tính chịu phèn mặn tốt ĐBSCL 3.3 Ứng dụng thị phân tử chọn lọc dòng chống chịu độ độc sắt Phản ứng làm nâu (bronzing) màu xem phương pháp xác định mức độ chống chịu biết sớm (IRRI 1965, Ota 1968), người ta biết sở di truyền chế chống chịu tương ứng với mức độ “nâu” Kỹ thuật marker phân tử giúp nhà nghiên cứu tìm hiểu sở di truyền hai phương diện: tính trạng đơn gen tính trạng đa gen, tương tác epistasis (Tanksley, 1993) Khả áp dụng đồ liên kết gen khả thi việc phân tích tính trạng (Causse ctv 1994, Kurata ctv 1994) Trong báo cáo nầy việc ghi nhận sàng lọc PCR lần thứ hệ BC2F2 OM1490/ AS996, có 10 mang gen liên quan đến tính trạng LBI (chỉ số hóa nâu lá), kết hợp với tính trạng nông học mong muốn Xác định có diện gen chống chịu độ độc sắt 10 dòng Trong vụ Đông Xuân 2009, 10 dòng trồng với vật liệu làm bố mẹ để đánh giá đồng Tiến hành đánh dấu, thu mẫu lá, xét nghiệm PCR lần thứ hai để chọn tiếp cá thể mang gen chống chịu độ độc sắt Kiểu hình có liên quan nhiều chiều dài tương đối rễ thử nghiệm độ độc sắt dung dịch Yoshida Tổng số 15 BC3F2 quần thể hồi giao (OM1490 /AS996 IR28/AS996) chọn Riêng tổ hợp OMCS2000/Kiên Giang lộn chưa ghi nhận kiện chống chịu độ độc sắt biểu thông qua LBI Còn lại hai tổ hợp lai tất cá thể tuyển chọn đánh dấu, thu mẫu phục vụ cho việc xác định diện gen chống chịu thông qua xét nghiệm PCR Sau tách chiết, định lượng DNA tổng số, tiến hành chạy PCR với cặp mồi chuyên biệt liên quan đến gen chống chịu độ độc sắt Kết điện di sản phẩm PCR agarose 3% cho thấy có biểu đoạn đặc hiệu gen với kích thước 210- 220 bp locus RM kích thước 300-310 bp locus RM240 nhiễm sắc thể số Bên cạnh đó, locus RM6 cho kết đa hình quần thể BC1với mẹ (OM1490) mang alen A, biểu thị kích thước phân tử 220bp alen B (bố AS996) biểu thị kích thước 210 bp Tại locus RM240, alen B mẹ nằm vị trí 300bp alen A bố nằm vị trí 310bp Phân tích 10 mang gen liên quan đến tính trạng LBI thuộc tổ hợp OM1490/ AS996 cho kết đa hình locus RM252 Chỉ thị phân tử RM252 biểu thị alen A mẹ nằm vị trí 240bp alen B nằm vị trí 230bp Tại locus RM451, kết alen B mẹ nằm vị trí 240bp alen A bố nằm vị trí 250bp 210 bp 310 bp 200 bp 300 bp B A 250 bp 240 bp 240 bp 230 bp C D Hình 8: Sản phẩm khuếch đại PCR loci RM6 (A), RM240 (B), RM252 (C) RM451 (D) quần thể BC2F2 OM1490 /AS996 Số liệu kiểm tra PCR tổng hợp cho thấy số 10 hồi giao nghiên cứu có mang gen chống chịu độ độc sắt tổ hợp OM 1490/ AS 996 thị phân tử RM Tính chất đa hình (polymorphism) minh họa rõ nét kỹ thuật phân tử SSR thị phân tử RM RM 240 (trên nhiễm sắc thể số 6) RM 252 nhiễm sắc thể số Phân tích QTL theo phương pháp SMA, nhằm phát gen điều khiển tính chống chịu với độ độc sắt tổ hợp BC3F2 OM1490/AS996; thị phân tử RM6, RM240, RM252 RM451 cho kết đa hình với sản phẩm PCR có kích thước cách 10 bp alen kháng alen nhiễm Những thể băng đồng hợp tử alen kháng thị phân tử ghi nhận G5 (BC3-1-2), G11 (BC3-1-3), G16 G17 (BC3-2-1), G21 G24 (BC3-2-2) Các cá thể thể chống chịu độ độc sắt nồng độ 100 ppm FeCl2 Bảng 2: Tổng hợp kết PCR với RM6, RM240, RM252 RM451 Tìm kiếm gen chống chịu độ độc sắt tổ hợp BC3F2 OM1490/AS996 Mã số Kích thước sản phẩm PCR (bp) Ký hiệu dòng Ký Phản ứng với hồi giao Hiệu độ độc sắt RM6 RM240 RM252 RM451 chọn Tổ hợp OM1490 / AS996 P1 220 300 240 240 S OM1490 P2 210 310 230 250 T AS996 BC3-1-1 G1 220 300 240 250 S G2 210 310 230 240 T G3 210 310 230 240 T BC3-1-2 G4 210 310 230 240 T G5 210 310 230 250 T G6 210 310 230 240 T G7 210 310 230 240 T G8 210 300 230 250 T BC3-1-3 G9 210 300 230 250 T G10 210 300 230 250 T G11 210 310 230 250 T G12 210 310 230-240 240 T G13 220 310 240 240 S BC3-2-1 G14 210 310 230 240 T G15 210 310 230 240 T G16 210 310 230 250 T G17 210 310 230 250 T G18 210 310 230 240 T BC3-2-2 G19 210 310 230 240 T G20 210 310 230 240 T G21 210 310 230-240 250 T G22 210 310 230 240 T G23 210 310 230 240 T G24 210 310 230 250 T Bảng3: So sánh kiểu gen kiểu hình thị phân tử RM6, RM240, RM252 RM451 Chỉ thị phân tử RM6 RM240 RM252 RM451 Số cá thể Kháng Nhiễm Dị hợp Ước đoán Mức độ xác (%) 24 24 24 24 22 16 20 12 12 0 91,67 66,67 83,33 50,00 Việc xét nghiệm PCR, sàng lọc hồi giao mang gen kháng, dòng dùng vật liệu lai với giống tái tục; tiến trình kéo dài đến BC4 Các dòng BC bắt đầu với kiểu hình kiểm tra với viêc xét nghiệm PCR ghi nhận hệ BC4F2 khẳng định việc hồi giao thành công, chuyển gen mục tiêu từ giống cho vào giống nhận cách ổn định Có 20 dòng tuyển chọn để đánh giá chọn lọc tiếp tục; đưa dòng nầy sang so sánh sơ khởi, so sánh hậu kỳ khảo nghiệm quốc gia Kết số dòng đạt tốt đưa vào sản xuất tương lai Kết luận - Kết hợp phương pháp chọn tạo giống truyền thống thị phân tử để rút ngắn thời gian chọn giống; áp dụng GRAMENE để tìm kiếm nhiều thị có liên kết chặt vùng giả định với LOD >3,0 Có thị phân tử áp dụng, biểu thị đa hình (4 sắt: RM252, RM211, RM315, RM212 - Kiểu hình phân tích chống chịu sắt 0, 30, 100 ppm FeCl2 dung dịch dinh dưỡng Yoshida Kết chủ yếu dựa chiều dài tương đối rễ (RRL) độ hóa nâu sắt - Đề nghị chọn lọc tiếp đánh giá tính trạng có liên quan đến hiệu kinh tế để đưa vào sản xuất TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thị Lang 2002 Những phương pháp công nghệ sinh học NXBNN Ponnamperuma FN, JL Solivas 1982 Field amelioration of an acid sulfate soil with manganese dioxide and lime Pages 213-222 in Proc of Bangkok Symp on Acid Sulfate Soils H Dost and N van Breemen (eds.), IILRM, Wagenigen Ponnaperuma FN 1974 Problem rice soils Proc IRRI Conf., April 22-25, 1974, LosBanos, Philippines, 11p Quijano C, R Mendoza 1994 Mineral Toxicities in rice Breeding rice for flood-prone and problem soil areas IRRI 1994 pp 99-116 Tanaka A, SA Navasero 1966 Interaction between iron and manganese in the rice plant Soil Sci Plant Nutr 12:29-33 Van Breemen N 1978 Landscape, hydrology and chemical aspects of some problem soils in the Philippines and in Sri Lanka A terminal report submitted to IRRI, Los Banos, Philippines pp 247-282 Yamaguchi M, S Yoshida 1981 Physiological mechanism of rice tolerance for iron toxicity IRRI, Saturday Seminar, June  ... 3.1 Thanh lọc lúa chống chịu độ độc sắt Tại Viện Lúa ĐBSCL, vật liệu tạo giống chọn lọc để đánh giá, phát triển quần thể lai, chọn theo phương pháp phả hệ, với 307 dòng chống chịu độ độc nhôm (được... Hình 2: Sự biến động chiều dài rễ tương đối (RRL) phản ứng độ độc sắt 100ppm quân thể AS996 / Jasmine 85 Hình 3: Sự biến động LBI (chỉ số hóa nâu) phản ứng với độ độc sắt 100ppm quân thể AS996... (RRL= 0.24) Hình 4: Sự biến động chiều dài rễ tương đối (RRL) phản ứng độ độc sắt 100ppm quân thể F2 OM 6073/OMCS2004 Hình 5: Sự biến động LBI phản ứng độ độc sắt 100ppm quân thể F2 OM 6073/OMCS2004