Nghiên cứu tạo bước đẩu đánh giá thời gian tuần hoàn máu liposom doxorubỉcin gắn polyethylen glycol Bùi Bá Minh', Nguyễn Thị Lập^ 'Wớf Viện Quân Y, ^Trường Đại học Dược Hà Nội SUMMARY The present study demonstrated that a sterically stabilized liposomes, nanoscaled PEG conjugate ofDSPE modified doxorubicin liposomes can be prepared by lipid film hydration method and pH gradient technique The results from evaluation o f particle size, morphology and physicochemical properties o f desired products showed the obtained products were almost acceptably homogenous and stable.The average size o f the majority o f liposomes is around 135 nm and 124 nmfor liposomal doxorubicin without PEG and liposomal doxorubicin conjugated PEG, respectively The liposomal efficiency o f Dox loading was rather good, reached from 82 to 90% Especially, the results showed some o f the benefits associated with the use o f PEG modified liposomes, such as increased blood levels and enhanced circulation lifetime Từ khóa: liposom doxorubicin, polyethylen glycol, thời gian tuần hoàn máu Đặt Vấn đề Một nhược điểm lớn sử dụng chê' phẩm liposom nhanh chóng bị thải trừ khỏi vòng tuần hoàn tóm bắt tế bào thuộc hệ thực bào đơn nhân (MPS) Gắn polyme thân nước, phospholipid cholesterol, chưa có nghiên cứu sử dụng dẫn chất polyme để làm tăng thời gian tuẩn hoàn liposom Dox Do đó, tiến hành nghiên cứu tạo liposom Dox gắn PEG bước đầu đánh giá ảnh hưởng chế phẩm tới thời gian tuần hoàn máu đặc biệt polyethylen glycol (PEG) biện pháp hiệu để khắc phục nhược điểm Sự tăng thời Nguyên liệu, th iế t bị v phương p h p ng hiên cứu gian tuẩn hoàn liposom gắn PEG mang lại nhiều lợi ích: giảm rò rỉ thuốc tuần hoàn, giảm Nguyên Uệu thiết bị tác dụng không mong muốn thuốc, làm tăng Nguyên vật liệu hội thoát mạch vào khoảng gian bào liposom, Phospholipid lòng đỏ trứng hỵdrogen hóa tăng tích lũy thuốc chống ung thư khối [1], Cholesterol (Merck, Đức), 1,2-dioctadecanoyl- u tăng hiệu điều trị [2,4] Những năm gắn đây, sn-glycero-3-hosphoethanolamineamonipolyethy nhiểu nghiên cứu nước sử dụng liposom làm lene glycol 2000 (DSPE-PEGj„^„-NHj cung cấp chất mang doxorubicin (Dox) đạt nhiều kết Laysanbio (Mỹ), doxorubicin cung cấp đáng khích lệ Tuy nhiên, hẩu hết nghiên cứu Merck (Đức) Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích dừng lại việc chế tạo liposom từ nguyên liệu A Thiết bị Màng polycarbonat kích thước lỗ lọc 0,4 um 0,08 |am (Sigma-Aldrich, Mỹ) Túi thẩm tích MWCO: 12000 - 14000 Da (Spectrum Labs - Mỹ) Máy Hình thái liposom tạo thành: Chụp mẫu liposom kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Đưa mẫu sau xử lý lên lưới đóng có phủ màng collodion-carbon cố định mẫu, rửa mẫu nhuộm Emulsiílex - C5 (Canada) Máy đo quang phổ huỳnh quang Shimadzu RF1501 (Nhật Bản) Máy cất quay BUCHI R-210 (Thụy Sỹ) Kính hiển vi điện tử truyền dung dịch urani acetat 1% Quan sát kính qua (TEM) JEOL 1010 (Nhật Bản) hệ liposom trước sau thẩm tích loại Dox tự (không liposom hóa) Hiệu suất liposom hóa Nơi nghiên cứu - Phương pháp sửdụng thiết bị đẩy, ép qua màng tiến hành Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Phương pháp quang phổ huỳnh quang sửdụng máy Shimadzu RF1501 (Nhật Bản) tiến hành Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội - Chụp phân tích hình ảnh TEM tiến hành Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương - Các nghiên cứu khác tiến hành Bộ môn Hóa sinh, Bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội hiển vi điện tửtruyển qua JEOL với điện áp 80 kv Hiệu suất Hposom hóa Dox; Định lượng Dox xác định theo công thức: H (%) = Cs/ Ct X 100% (CịVà c nổng độ doxorubicin toàn phẩn trước sau thẩm tích loại Dox tự do) Định lượng Dox toàn phân hệ liposom: Lấy 125 nl dịch liposom, pha loãng với dung dịch NaCI 0,9% thành ml Thêm vào ml dung dịch Triton X 1001 %, ủ hỗn hợp 60°c Định lượng Dox phương pháp quang phổ hấp thụ khả kiến Ầ :=480 nm Mẫu trắng dung dịch gồm ml dung dịch NaCI 0,9% ml dung dịch Triton X -1001 % Nghiên cứu ảnh hưởng gắn PEG lên bề mặt liposom tới thời gian tuần hoàn máu liposom doxorubicin Phương pháp nghiên cứu Tạo liposom doxorubicin gắn polyethylen glycol Tạo tiểu phân liposom Dox gắn PEG theo Tiến hành theo phương pháp Gabizon, et al., [2] có cải tiến thẩm định Chuột nhắt trắng dòng Swiss, BALC 57/6, giống đực, có khối lượng từ 22 - 27 g Viện Vệ sinh Dịch tễTrung ương phương pháp Li, et al., [8] cải tiến, mô tả tóm tắt sau: phospholipid trứng hydro hóa, cung cấp Chia ngẫu nhiên thành nhóm, nhóm cholesterol DSPE-PEG^^i^/NH^Ítỷlệ mol 1,85:1:0,15 tương ứng) hòa tan vào 15 ml cloroform, cất ứng với liểu 10 mg Dox/kg thể tích tiêm 10 ml/kg: nhóm (tiêm Dox dạng tự pha nước muối sinh iý), nhóm (tiêm liposom Dox quay chân không nhiệt độ 50“C Hydrat hóa màng mỏng thu dung dịch đệm citrat 300 mM, pH 50°c Hỗn dịch liposom thu đẩy qua màng polycarbonat kích thước lỗ 0,40 |am lẩn 0,08 |aim 10 lần thiết bị Emulsiflex-C5 con: nhóm đầu tiêm tĩnh mạch đuôi tương không gắn PEG), nhóm (tiêm liposom Dox gắn PEG) nhóm ià nhóm trắng (tiêm lOml/kg nước muối sinh lý) Sau tiêm, khoảng thời gian phút (0,083 giờ), giờ, 24 giờ, máu chuột lấy (Canada) Dox đưa vào liposom phương pháp chênh lệch pH Liposom Dox (không gắn PEG) từ hốc mắt vào ống chứa heparin, ly tâm 4°c, 3000 tạo thành phương pháp tương tự, với 100 ụl huyết tương, thêm 2,4 ml isopropanol acid vòng/phút 10 phút để lấy huyết tương Hút nguyên liệu ban đầu phospholipid trứng hydro hóa (HCI 0,075 N isopropanol 90% (tt/tt)) Sau hóa cholesterol (tỷ lệ mol 2:1 tương ứng) 24 giờ, li tâm 4000 vòng/phút rong 20 phút, thu Đánh giá liposom tạo thành lấy phẩn dịch định lượng Dox toàn phần Kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân huyết tương phương pháp quang phổ zeta: Xác định thiết bị Zetasizer ZS90 huỳnh quang bước sóng kích thích 471 nm, bước (Anh) sau pha loãng hỗn dịch 200 lẩn dung sóng phát xạ 554 nm.Từ mật độ huỳnh quang thu dịch NaCI 0,9% lọc qua màng lọc 0,2 um được, nồng độ tương đương Dox xác định dựa vào đường chuẩn xây dựng từ dung dịch Dox biết trước nồng độ Bâng ĩhéZeta độ di chuyền cùa cóc mâu liposom Mẫu liposom Phương pháp xử lý số liệu Thế Zeta (mV) Độ di chuyển {|im.cm/v.s) Trước tải Dox Các số liệu xử lý phán mểm Microsoft office Excel 2007 để tính giá trị trung bình độ lệch Liposom -32,6 -2,553 chuẩn SD Sử dụng kiểm định t-test để đánh giá PEG-liposom -10,1 -0,7921 khác kết Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p < 0,05 Sau tải Dox Liposom Dox -40,1 -3,140 PE6-liposom Dox -8,88 -0,6963 Kết nghiên cứu Kết chụp TEM (hình 1) cho thấy liposom tạo Đánh giá đặc tinh tiểu phân liposom Dox tạo thành có hình tròn, kích thước tương đỗi Kích thước tiểu phân trung bình phân bố kích thước tiểu phân liposom Dox (không gắn PEG) PEG-liposom Dox (gắn PEG) tạo thành trước sau tải Dox trình bày bảng Bảng l Kích thước tiếu phân chì số đa phân tán (PDI) CÙQ máu liỊxsom Mẫu liposom PDI KTTB theo đường kính (nm) Liposom 0,074 108,9 PEG-liposom 0,081 100,6 Trước tải Dox Sau tải Dox Liposom Dox 0,110 135,8 PEG-liposom Dox 0,179 124,9 KĨTB: Kích thước trung bình N«3: 24100X 4:49:43 P04/27/U Print ■■ KV*«O.OkV Dir«cl Mag: laooox TUMMode: laagỉng Kết bảng cho thấy liposom trước tải Dox khác biệt đáng kể kích thước lẫn số PDI liposom gắn không gắn PEG soo nm Hình l Hmh ánh chụp TEM liposom doxorubiơn gân PEŨ độ phóng đợi 12.000 lân Tiếp theo, bảng thể hiệu suất liposom hóa Dox dạng chế phẩm gắn không gắn PEG Đa số liposom tạo thành có kích thước khoảng 100 nm Sau trình tải Dox, kích thước trung bình Kết cho thấy hiệu suất liposom hóa PEG - mẫu liposom tăng lên đạt kích thước tiểu liposom Dox thu tương đối cao (82,54%), phân trung bình khoảng 130 nm Chỉ số đa phân tán không khác nhiều so với dạng liposom Dox không (PDI) < 0,3 cho thấy hệ liposom tạo thành tương đối gắn PEG (89,60%) đồng Bàng Hiệu suát liposom hóơ cũũ mâu mâu liposom Kết Zeta thu bảng Trước loại Doxtựdo Sau loại Doxtựdo Nóng độ (mg/ ml) Nóng độ (mg/mí) Liposom Dox 1,894 1,697 89,60 PEG-liposom Dox 1,901 1,569 82,54 liposom không gắn PEG (trước sau tải Dox) có giá trị tuyệt đối > 30 mV cho thấy khả ổn định Hiêu suất (%) Mẫu liposom hệ cao Thế Zeta liposom gắn PEG thấp, tương ứng với -10,1 mV (trước tải thuốc) - 8,88 mV (sau tải Dox) So với liposom không gắn PEG, liposom gắn PEG di chuyển chậm Ảnh hưởng gắn PEG /én bề mặt liposom tới thời gian tuồn hoàn liposom máu Nồng độ tương đương Dox huyết tương chuột nhắt thời điểm phút, 24 đẩy cuối với kích thước lỗ lọc 80 nm để tạo liposom có kích thước khoảng 100 nm PEGLiposom Dox tạo thành có kích thước trung bình 124,9 nm sản phẩm thu nghiên cứu sau tiêm tĩnh mạch đuôi chuột trình bày (bảng ) tương đối phù hợp để đạt hiệu bảng tuẩn hoàn kéo dài Bàng Hông độ tương đương Dox huỵết tương chuột nhát rọi thời điểiTì 5phút (0,083 giờ), giờ, 24 giờsũu tiêm tĩnh m ứ ì đuôi Kết bảng cho thấy, so với liposom không gắn PEG, liposom gắn PEG di chuyển chậm Thời điểm (giờ) giá trị tuỵêt đối Zeta giảm Nóng độ tương đương doxorubicin trung bình (ụg/ml huyết tương) ± SD (n = 3) Nguyên nhân giảm Zeta có mặt chuỗi PEG bể mặt liposom làm giảm Doxtựdo Liposom Dox PEG-liposom Dox di chuyển liposom điện trường làm giảm Zeta [4], Ngoài ra, Zeta giảm 0,083 13,79 ±1,33 5,09 + 1,98 24 133,73 ± 10,98 152,491 14,06 p,, ... -1001 % Nghiên cứu ảnh hưởng gắn PEG lên bề mặt liposom tới thời gian tuần hoàn máu liposom doxorubicin Phương pháp nghiên cứu Tạo liposom doxorubicin gắn polyethylen glycol Tạo tiểu phân liposom. .. huyết chuột, kết nghiên cứu cho thấy gắn PEG lên tương nhóm chuột tiêm liposom doxorubicin bể mặt liposom có khả kéo dài thời gian tuần hoàn liposom máu, làm tăng nồng độ Dox gắn PEG cao có ý... Dox) So với liposom không gắn PEG, liposom gắn PEG di chuyển chậm Ảnh hưởng gắn PEG /én bề mặt liposom tới thời gian tuồn hoàn liposom máu Nồng độ tương đương Dox huyết tương chuột nhắt thời điểm