NGHIÊN c ứ BÀO CHÉ TIỂU PHÂN NANO CHỨA ARTESUNAT Nguyễn Hanh Thủy', Trần Tuấn Hiệp^ HDKH; Nguyễn Ngọc Chiến’, Chui Soon Yong^ ' Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia, Trường Đại học Dược Hà Nội ^Phòng thỉ nghiệm bào chế, Khoa Dược, Đại học Yeungnam, Hàn Quốc Từ khóa: artesunat, PLGA, tiểu phân nano, tác dụng chông ung thư Tóm tẳt Tiểu phân nano poly-d,l-lactide-co-glycolide (PLGA) chứa artesunat (ART) bào chế phương pháp bay dung môi từ nhũ tương dần/nước (0/W) với dỉcloromethan dung môi pha dầu Tỷ lệ pha dầu nước, nồng độ PLGA pha dầu loại tỷ lệ chất nhũ hóa có ảnh hưởng lớn tới kích thước tiểu phân thu Lượng thuốc đưa vào hệ khảo sát từ 2,5-10 mg cho khả nạp thuốc cao sử dụng Tween 80 1,5% (kl/tt) Hệ tiểu phân thu có kích thước nhỏ 170 nm khả giải phóng kẻo dài tới 24 giờ, ổn định đông khô với manitol tỷ lệ 5% (kl/tt) ban đầu cho thấy có tác dụng khảng lại dòng tê bào ung thư mô hình in vitro Đặt vấn đề Tác dụng kháng sốt rét artesunat (ART) dẫn chất artemisinin nhà khoa học nghiên cứu chứng minh từ lâu [1, 2] Bên cạnh đó, số nghiên cứu gần cho thấy tác dụng chống ung thư ART nhiều dòng tế bào tế bào biểu mô, tế bào phổi nhỏ, thận, bạch cầu, [2], Cơ chế tác dụng chống ung thư ART nghiên cứu với nhiều giả thuyết đưa ngăn cản tăng sinh nội mạc mạch máu, giảm phá hủy DNA hay ức chế xấm lấn hay di khổi u [2, 8], Tuy nhiên thời gian bán thải ngắn ART với tính ổn định nên việc gắn ART vào chất mang để kéo dài giải phóng độ ổn định dược chất cần thiết [1, 3], Tá dược có khả phân hủy sinh học sử dụng phổ biến chất mang cho hệ đưa thuốc có khả tăng sinh khả dụng, độc tính, hiệu suất bao gói kiểm soát giải phóng dược chất tốt PLGA polyme có đặc tính ứng dụng phổ biến giới cho bào chế dạng tiểu phân nano [4] Vì vậy, mục tiêu nghiên cứu phát triển hệ đưa thuốc cho ART có đặc tính hóa lý phù họp tăng hiệu chống ung thư ART Công thức thu đánh giá ảnh hưỏmg yếu tố tới kích thước tiểu phân, phân bố kích thước, khả nạp thuốc, bề mặt tiểu phân, đặc tính hóa lý giải phóng in vitro nghiên cứu độc tính in vitro dòng tế bào ung thư khác Nguyên liệu phưotig pháp nghiên cứu Nguyên liệu Artesunate (ART) từ Sao Kim Pharma (Hà Nội, Việt Nam) PLGA (Lakeshore 5050 DLG 2A) tò Enovik, Germany Natri lauryl sulfat (SLS), polysorbat 80 (Tween 80) từ Duksan Chemical Co (Ansan, Korea) Polyvinyl alcol (PVA), sucrose, trehalose manitol Sigma-Aldrich (St Louis, USA) Poloxamer 188 từ BASF Chemical Co (Ludwigshafen, Germany) Methanol, ethanol, acetonitril (ACN), dicloromethan (DCM) đạt tiêu chuẩn HPLC Các nguyên liệu khác đạt tinh khiết hóa học Phương pháp bào chế tiểu phân nano chửa artesunat Tiểu phân nano PLGA chứa ART bào chế phương pháp bốc dung môi từ nhũ tương dầu/nước (0/W) [5] Polyme ART hòa tan 5ml dicloromethan (DCM), sau nhỏ vào pha nước có chứa chất nhũ hóa Nhũ tương OAV đồng sử dụng đầu siêu âm (Vibracell VCX130; Sonics, USA) 100W phút khuấy nhiệt độ phòng để loại dung môi, ly tâm, rửa với nước để loại chất nhũ hóa đông khô thu sản phẩm Đánh giá đặc tính hóa lý hệ tiểu phân nano Kích thước tiểu phân xác định phương pháp đo tán xạ ánh sáng (DLS) sử dụng thiết bị Zetasizer Nano 90 (Malvem Instruments Ltd., Worcestershire, UK) Tiểu phân chụp ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM, H7600, Hitachi, Tokyo, Japan) mức điện 100 kv Hiệu suất vi nang hỏa khả nạp thuốc Định lượng hàm lượng dược chất tự sử dụng ống ly tâm có màng 10000 Da (MWCO 10000, Millipore, USA) [3, 7], Điều kiện sắc ký gồm cột C18 Inertsil ODS (150x4,6mm, 0,5^m, GL Sciences Inc., Japan), pha động ACN đệm phosphat pH 3,0 (55-45), bước sóng 216 nm, thể tích tiêm mẫu 50 Ịil, tốc độ dòng Iml/phút sử dụng hệ thống HPLC Hitachi, Nhật Bản Hiệu suất vi nang hóa (EE) khả nạp thuốc (LC) tính theo công thức; Tông ART-ART tưdo „ _ X100% (I) LC(%) Khôi iưọngtièuphảrnano ART (2) ^^ Thử khả giải thuốc từ tiểu phân nano Thử nghiệm giải phóng dược chất tiến hành túi thẩm tích (kích thước màng lOOOODa - Membrane Cel, Chicago, IL, USA) chứa khoảng mg dược chất, phân tán ml đệm phosphat pH 6,8 [1, 3], Túi thầm tích đặt ống chứa 30 ml dung dịch đệm phosphate pH 6,8 ống giữ bể điều nhiệt (HST-205 sw, Hambaek ST Co., Hàn Quốc) 37°c, lắc với tần suất 50 vòng/phút Hút ml dịch bổ sung môi trường thời điểm định lượng hàm lưọng dược chất giải phóng Thử độc tính in vitro tiểu phân nano PLGA chứa ART Thử độc tính tế bào SCC7 (tế bào ung thư biểu mô), A549 (tế bào ung thư phổi người) MCF-7 (tể bào ung thư vú người) (lấy từ ngân hàng tế bào Hàn Quốc nuôi môi trưòng RPMI-1640 (HyClone, USA) bổ sung huyết bò 10% (FBS) 1% streptomycin, 5% CO2 37°C) phương pháp MTT: 100 hỗn dịch tế bào nồng độ IxlO'* tế bào/ml nhỏ vào giếng đĩa môi trường 96 giếng ủ 24 Mầu tiểu phân PLGA trống, ART tự tiểu phân ART-PLGA (nồng độ từ 10 I^g/ml tới 100 |ig/ml dược chất) thêm vào giếng ủ 24 Môi trường với mẫu loại bỏ dung dịch MTT (100 i-il dung dịch MTT 1,25 mg/ml đệm RPMI) thêm vào ủ 37°c Loại bỏ môi trường MTT thêm 100 |a,l dimethy sulfoxyd (DMSO), ủ 15 phút đo độ hấp thụ bước sóng 570 sử dụng thiết bị đọc đĩa micro (Multiskan EX, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) [5] Tỷ lệ tế bào hoạt động tính theo công thức: ODs7o(mấu)-ODs7o(trăng;i xlOO% Tv lệ TB hoat động = (3) ODs7o(chứng)-OD57(j(trắng) Kết Kết bào chế tiểu phân nano PLGA Ảnh hưỏTig tỷ lệ pha dầu (DCM) pha nước (dung dịch PVA 0,1%) khảo sát từ 1;5 đến 1;20 Kết hình cho thấy tiểu phần PLGA tạo thành khoảng từ 220-270 nm Khi tỷ lệ pha nước tăng lên làm giảm kích 0.4 0.3 300 Ị I Ị -250 57-ĩ-r:- É1 I t 0.2 gi I I 200J -4) ị •§ 150 100 - -P D I ^ K T T P (nm) 'r '" ML 0.3 0.2 Q 0,0 1.5 N n g đ ộ P L G A (k l/tt) Hình Ảnh hưởng tỷ lệ dầu/nước Hình Ảnh hưởng tỷ lệ PLGA tới tới kích thước tiểu phân kích thước tiểu phân Tỷ lệ polyme pha nội ảnh hưởng lớn tới hình thành tiểu phân nano Hình cho thấy kích thước tiểu phân tăng lên tăng nồng độ polyme từ 0,5 đển 2% (Id/tt) tỷ lệ PLGA cao (>1%) (MW 17000-18000 Da), kích thước tiểu phân số PDI thu tăng lên Tuy nhiên, tỷ lệ nước cao hay nồng độ polyme thấp, mật độ tiểu phân thấp, Idió để thu lấy sản phẩm cho nghiên cứu Do vậy, tỷ lệ dầu - nước nồng độ PLGA lựa chọn 1; 10 1% cho nghiên cứu Ảnh hưởng chất diện hoạt: tiểu phân nhỏ 208,0 ± 2,1 Inm; 72,69 ± 0,74nm 166,4 ± 3,44 nm sử dụng dung dịch pha nước PVA 0,25% (Hình 3A), SLS 0,75% (Hình 3B) va Tween 80 1,5% (Hình 3C) íĩi^KTTP r 0.1 0.25 0.5 0.75 N n g đ ộ PVA (k l/tt) 0.25 ,5 0.75 N n g đ ộ S L S (k i/tt) ■4 0.5 1.5 N n g đ ộ T w een 80 (k»/tt) í, Hình Ảnh hưởng chất diện hoạt tới kích thước tiểu phân, (A) PVA; (B) SLS; (C) Tween 80 Bảng Ảnh hưởng tỷ lệ thuốc đưa vào hệ nano tới đặc tính tiểu phân Lượng Chất diện hoạt ART (mg) Tween 80 (1,5%) SLS (0,25%) 2,5 10 2,5 10 Kích thước (nm) 166,4±3,4 162,4±1,2 167,2±2,8 177,7±1,7 72,5±0,1 11,1±Q,\ 78,5±0,5 82,7±0,5 0,228±0,004 0,191±0,015 0,183±0,040 0,143±0,025 0,125±0,021 0,118±0,012 0,177±0,035 Hiệu suất vi nang hóa EE (%) 83,40±0,50 78,57±0,46 77,52±1,03 77,76±1,57 60,5 5± 1,24 0J84±0,009 59,55±5,28 PDI Khả nạp thuốc LC (%) 8,12±0,34 13,58±0,41 23,67±0,61 8,06±0,92 12,32±0,53 19,43±1,72 o 208,0±3,4 0,201±0,010 PVA 2,5 289,6±4,6 0,214±0,015 42,36±0,76 4,34±0,23 (0,25%) 295,9±1,2 0,237±0,008 40,32±1,96 7,46±0,66 10 305,5±4,3 0,209±0,037 41,34±1,66 14,19±0,56 Ó ty le cúa tímg chát dién hoat có kích thirác tiéu phán nhó nhát, tién hánh phoi hgp dirgc chát tír 2,5-10 mg (PLGA la 25mg/2,5ml DCM) dé dánh giá hieu suát vi nang hóa va náng nap thuóc cúa he (báng 1) Khi táng lirgng ART, kích thiróc tiéu phán déu táng song táng nhiéu nhát düng PVA la chát nhü hóa Các cóng thúc sú dung PVA cüng cho két vi nang hóa tháp dáng ké so vói sú dung Tween hay SLS He có náng bao gói tót han Ichi lugng ART dua váo tháp, tot nhát vói cóng thúc düng Tween 80 phói hop 2,5 mg ART (lén tói > 80%) Tuy nhién, dé có tác dung chong ung thu, ART dirgc cho la cán düng vói liéu lón [1, 9] Vi vay, lugng ART dua váo he dugc chgn la 10 /1 ^ W A 1A ^ 1^ ' rv ^ O/ A > OT o \ ♦ %• tú tiéu phán nano PLGA 120 ^ 100 -i PLGA chúa ART sú dung Tween 80 120 (A ) A - h _ (B )S C C -7 -2 h 100 I “ i ¿ o V 60 ■ -É 40 ■ P LG A ttóng a ART t i j I OART-PLGA - 20 O -f- e ‘ I SOI f 60 j I I , - J i- l 10 25 50 N&ng (pg/mL) ■‘S 40 -i " 20 J O 4- « P L G A tró n a ART t y de O AR T-P LG / Ití] 25 50 N6ng d (pg/mL) 100 ■ P L G A tr ô n g B A R T tụ- d o •‘Ä 40 O A R T -P L G A ' 20 O N n g d ô ( p g /m L ) Hình Tỷ lệ tế bào hoạt động dòng tế bào, (A) A549; (B) SCC-7; (C) MCF-7 Khả giải phóng dirợc chất in vitro Đánh giá khả giải phóng in vitro công thức sử dụng pha nước Tween 80 1,5% SLS 0,25% thể hình cho thấy tiểu phân ART-PLGA có bùng nổ giải phóng 10 đầu đạt tới 80% trường hợp, sử dụng SLS 60% với Tween 80 Điều liên kết lỏng lẻo phân tử dược chất polyme bề mặt tiểu phân tỷ lệ dược chất cao so với polyme Ngoài ra, kích thước tiểu phân nhỏ khiến ART giải phóng từ hệ SLS nhanh so với hệ Tween 80 Với mục tiêu trì nồng độ thuốc máu lâu hom giảm độc tính chất diện hoạt gây ra, Tween 80 lựa chọn cho nghiên cứu Hình ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua TEM có thấy tiểu phân có cấu trúc đồng nhất, cầu, với kích thước khoảng 170 nm (hình 5) Kết thử độc tính tế bào in vitro Tỷ lệ tế bào hoạt động dòng tế bào SCC7, A549 MCF-7 sau 24 nồng độ ART từ 10-100 )ag/ml thể hình cho thấy tất dòng tế bào, ART tự tiểu phân ART-PLGA có hoạt tính mạnh đặc biệt với dòng A549 MCF-7 (hình 6A 6B) tiểu phân trống trì tỷ lệ tế bào hoạt động tới 80% sau 24 cho thấy tiểu phân PLGA trống độc tính nồng độ khảo sát Tiểu phân ART-PLGA có khả ức chế tế bào tốt dạng ART tự tất dòng tế bào ung thư Độ ổn định tiểu phân ART-PLGA Tiểu phân PLGA chứa ART làm khô đông khô sử dụng chất bảo vệ manitol, sucrose trehalose Kết hình cho thấy thay đổi kích thước tiểu phân sau đông kliô tăng nhẹ sử dụng manitol hay sucrose ừong với ứehalose kích thước tàng đáng kể Banđẳu Man.5%Man.10%Suo,5%Suc.10%Tre,5%Trs.10% Hình Ảnh hưỏfng chất mang tới kích thước tiểu phân sau Iđii đông khô Bảng Độ ổn định tiểu phân nano ART-PLGA tháng bảo quản Nhiệt độ phòug Dạng bào chế — KTTP(nm) Hàm luựng (%) KTTP (nm) Hàm lượng (%) Hỗn dịch 162,77 ±3,83 95,81 ± 2,65 164,89 ± 1,99 82,60 ± 3,62 Bột đông khô 165,90 ±3,28 99,34 ± 1,65 163,61 ± 3,66 97,12 ±1,36 Kích thước tiêu phân gân không thay đôi trình bảo quản điều kiện sau tháng theo dõi (bảng 2) Tuy nhiên hàm lượng dược chất mẫu hỗn dịch giảm đáng kể điều kiện phòng Tuy nhiên, bột đông Ichô cho kết ổn định với hàm lượng đạt 97% Bàn luận Độ nhớt sức căng bề mặt phân cách pha ảnh hưởng lớn kích thước tiểu phân phụ thuộc vào loại tỷ lệ chất diện hoạt sử dụng [4], Do đó, tăng độ nhót pha (tăng nồng độ polyme, ữiay đổi loại chất diện hoạt) thay đổi tỷ lệ pha dầu - nước ảnh hưởng lớn tới kích thước phân bố tiểu phân Với SLS Tween 80 sử dụng chất nhũ hóa cho tiểu phân có kích thước nhỏ 200nm đem lại nhiều im điểm qua hàng rào mạch máu - mô ung thư Tuy nhiên, tiểu phân hệ sử dụng SLS có khả nạp thuốc khả kiểm soát giải phóng dược chất so với hệ sử dụng Tween 80 Tiểu phân sau đông khô ổn định vật lý lẫn hóa học so với dạng hỗn dịch ban đầu Đánh giá độc tính tế bào in vitro cho thấy tiểu phân PLGA trống Iđiá an toàn, Iđii ART tự tiểu phân ART-PLGA có tác dụng mạnh ứên dòng tế bào sử dụng Tác dụng dòng ung thư dạng tiểu phân ART-PLGA mạnh dạng thuốc tự cần liều cao tác dụng Điều phù họp với số nghiên cứu liều dùng cùa ART mô hình ung thư lên tới 100-240 mg/kg thể trọng [1, 7, 8], Kết luận Tiểu phân nano PLGA chứa ART bào chế theo phưong pháp bốc dung môi từ nhũ tưong dầu/nước Tiểu phân có hình cầu đều, phân bố kích thước hẹp, khả nạp thuốc cao, kéo dài giải phóng ART tới 24 giờ, ổn định sau đông khô có hoạt tính tốt tất dòng tế bào Như vậy, tiểu phân nano PLGA hệ phân phối thuốc ART nghiên cứu xa mô hình chống ung thư in vivo Tài liệu tham khảo Chadha, R., Gupta, s., and Pathak, N Artesunate-loaded chitosan/lecithin nanoparticles; Preparation, characterization, and in vivo studies Drug Development and Industrial Pharmacy, 38, 1538-1546 (2012) Efferth, T Willmar Schwabe Award 2006; antiplasmodial and antitumor activity of artemisinin-from bench to bedside Planta medica, 73, 299-309 (2007) Gabriels, M., and Plaizier-Vercammen, J Physical and chemical evaluation of liposomes, containing artesunate Journal o f pharmaceutical and biomedical analysis, 31, 655-667 (2003) Kumari, A., Yadav, s K., and Yadav, s c Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 75, 1-18 (2010) Pradhan, R., Poudel, B K., Ramasamy, T., Choi, H.-G., Yong, c s., and Kim, J o Docetaxel-Loaded Polylactic Acid-Co-Glycolic Acid Nanoparticles; Formulation, Physicochemical Characterization and Cytotoxicity Studies Journal o f Nanoscience and Nanotechnology, 13, 5948-5956 (2013) Woerdenbag, H J., Moskal, T A., Pras, N., Malingré, T M., El-Feraly, F s., Kampinga, H H., and Konings, A w Cytotoxicity of artemisinin-related endoperoxides to Ehrlich ascites tumor cells Journal o f natural products, 56, 849-856 (1993) Xiao, X.-C., and Hong, Z.-G Firstborn microcrystallization method to prepare nanocapsules containing artesunate International journal o f nanomedicine, 5, 483 (2010) Xu, Q., Li, z.-x., Peng, H.-Q., Sun, Z.-W., Cheng, R.-L., Ye, Z.-M., and Li, W.-X Artesunate inhibits growth and induces apoptosis in human osteosarcoma HOS cell line in vitro and in vivo Journal o f Zhejiang University SCIENCE B, 12, 247-255 (2011) ... 2,5 10 Kích thước (nm) 16 6,4±3,4 16 2,4 1, 2 16 7,2±2,8 17 7,7 1, 7 72,5±0 ,1 11, 1±Q, 78,5±0,5 82,7±0,5 0,228±0,004 0 ,19 1±0, 015 0 ,18 3±0,040 0 ,14 3±0,025 0 ,12 5±0,0 21 0 ,11 8±0, 012 0 ,17 7±0,035 Hiệu suất vi... 77,52 1, 03 77,76 1, 57 60,5 5± 1, 24 0J84±0,009 59,55±5,28 PDI Khả nạp thuốc LC (%) 8 ,12 ±0,34 13 ,58±0, 41 23,67±0, 61 8,06±0,92 12 ,32±0,53 19 ,43 1, 72 o 208,0±3,4 0,2 01 0, 010 PVA 2,5 289,6±4,6 0, 214 ±0, 015 ... (nm) Hàm lượng (%) Hỗn dịch 16 2,77 ±3,83 95, 81 ± 2,65 16 4,89 ± 1, 99 82,60 ± 3,62 Bột đông khô 16 5,90 ±3,28 99,34 ± 1, 65 16 3, 61 ± 3,66 97 ,12 1, 36 Kích thước tiêu phân gân không thay đôi trình