KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT Đ ộ , THỜI GIAN NUÔI CẤY TỚI KHẢ NĂNG SINH TỐNG HỢP PROTEASE NGOẠI BÀO CỦA BACILLUS SUBTILIS NATTO Nguyễn Thùv Dương ^ HDKH: TS Đàm Thanh Xuân, DS Lê Ngọc Khánh^ ‘Lớp M1.K64 -Trường Đại học Dược Hà Nội ^Bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội Từ khóa: B subtilis natto, nhiệt độ, protease, thời gian Tóm tắt Trong trình sinh trưởng, Bacillus subtỉlis natto có khả tổng hợp nhiều nhóm enzym ngoại bào: protease, cellulose, amylase, y-transpeptỉdase [1] Nghiên cứu nhằm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp protease ngoại bào B subtilis natto Từ bước đầu lựa chọn điều kiện môi trường nuôi cấy cho sản xuất protease Phương pháp giếng thạch với chất casein, CMC, tinh bột dùng để khảo sát hoạt tính enzym ngoại bào B subtilis natto Kết quả: nhiệt độ 37°c thời gian nuôi cấy 24 hoạt tính protease cao dịch lên men, dịch chiết enzym amoni Sulfat 60% bão hòa Đặt vấn đề Protease - enzym phá vỡ liên kết peptid amino acid protein nhóm enzym ứng dụng rộng rãi Trong nguyên liệu sản xuất protease, vi khuẩn thuộc chi Bacillus có nhiều ứng dụng Bacillus subtilis natto thuộc chi Bacillus vi khuẩn có khả sinh nhiều nhóm enzym\ protease, cellulase, 'ftranspeptidase [ ]; đặc biệt quan trọng nhóm proíease có khả phân giải fibrin, ứng dụng để phòng ngừa bệnh huyết khối Nghiên cứu: '’’Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian nuôi cấy tới khả tổng hợp protease ngoại bào B subtilis natto” tiến hành nhằm bước đầu lựa chọn điều kiện môi trường nuôi cấy cho tách chiết protease tiêu fibrin Nguyên liệu, thiết bị phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu thiết bị Vi sinh vật sử dụng: Bacillus subtilỉs natto - Nhật Bản Nguyên liệu, hóa chất sử dụng- nguồn gốc: pepton, cao thịt-Ấn Độ; NaCl, casein, CMC, KI, lod, HCl, Na-K tatrat, NaOH, (NH4)2 S0 , KH 2P -Trimg Quốc; thạch bột, tinh bột, xanh methylen - Việt Nam Môi trường: Công thức môi trường thạch thường: pepton (1,0 gam); thạch bột (2,3 gam); cao thịt (0,5 gam); NaCl (0,5 gam); nước mảy vđ (100 ml); công thức môi trường canh thang: pepton (1,0 gam); cao thịt (0,5 gam); NaCl (0,5 gam); nước máy vđ ( 0 ml) Máy móc dụng cụ - nguồn gốc: Tủ cấy vô trùng (ưv Bioair) - Italia; tủ ấm, tủ sấy (Memment) - Đức; nồi hấp tiệt trùng (ALP) - Nhật; lò vi sóng - Hàn Quốc; máy li tâm (Rotofix) - Đức; cân phân tích (Satorius) - Đức; cân kỹ thuật (Satorius) - Đức; máy đo pH (Presica) - Đức; máy đo vòng phân giải (Halopes caliper) - Tây Ban Nha; dụng cụ sử dụng: bình nón, bình định mức, cốc có mỏ, đĩa petri nhựa (đường kính 8,8 cm), ống nghiệm, pipetman, pipet tip Phương pháp nghiên cứu Phương pháp giữ giống nuôi cấy Bacillus subtilis natto Giữ giống thạch nghiêng: cấy giữ giống môi trường thạch thường, ủ tủ ấm 37°C/24 giờ, bảo quản 4-5°C, cấy truyền 1-2 tháng/lần Nhân giống bình nón: nhân giống bình nón 250 ml chứa 100 ml môi trường canh thang hấp tiệt khuẩn latm/20 phút, ủ máy lắc 37°c 24 với tốc độ lắc 100 vòng/phút PhưoTĩg pháp lên men: lên men bình nón 250 ml chứa 100 ml môi trường canh thang hấp tiệt khuẩn latm/2 phút, tỷ lệ cấy truyền %, ủ máy lắc nhiệt độ, thời gian nuôi cấy nghiên cứu với tốc độ lắc 0 vòng/phút Phương pháp sơ thử hoạt tính nhóm enzym theo nguyên tắc khuếch tán thạch Thử sơ hoạt tính enzym protease\ amylase', cellulase theo phưong pháp giếng thạch môi trưòng thạch % chất tưoTig ứng là: casein % 10 giọt xanh methylen; tinh bột 1%; CMC 1% Đục giếng thạch đường kính 0,6 cm Nhỏ 0,05 ml dịch thử vào giếng thạch, ủ tủ ấm 37°c 24 giờ; nhỏ dung dịch Lugol để quan sát vòng phân giải tinh bột, CMC [3] Phương pháp chiết xuất protease amoni S u l f a t 60% bão hòa Giữ dịch lên men 4“c /l Thêm dần amoni Sulfat vào lOOml dịch lên men đến đạt nồng độ amoni Sulfat 60% bão hòa Sau muối tan hết, để yên Li tâm với tốc độ 15.000 vòng/ phút 4°c 20 phút thu tủa enzym Hòa tan tủa enzym vào 10 ml dd đệm pH 7.6 thu dịch chiết enzym [1 , ] Phương pháp khảo sát ảnh htrởng nhiệt độ môi trường nuôi cầy lên khả sinh protease B subtilis natto Lên men mẫu bình nón 250 ml, ủ máy lắc điều kiện 30°c 37°c 24 với tốc độ lắc 100 vòng/phút Thử so sánh hoạt tính enzym dịch lên men dịch chiết enzym mẫu theo nguyên tắc khuếch tán thạch nêu Phương pháp khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh protease B subtiUs natto Lên men mẫu bình nón 250 ml, ủ máy lắc 37°c với tốc độ lắc 100 vòng/phút Lấy mẫu thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 72 Sau thử so sánh hoạt tính enzym dịch lên men dịch chiết enzym mẫu theo nguyên tắc khuếch tán ứên thạch nêu Kết Bảng Đưòng kính vòng phân giải chất (dcochất: mm) dịch lên men B subtilis natto nuôi cấy nhiệt độ khác \d ^casein (ram) dtinh bội (ram) dcMC (mm) f c \ L L2 L3 TB LI L2 L3 TB L L2 L3 TB 30”c 17,23 17,97 18,00 17,73 13,20 13,50 13,30 13,33 13,05 13,55 13,27 13,29 17,80 17,60 17,56 17,65 (-) (-) (-) (-) 9,21 8,94 9,31 9,15 37”C Bảng Đường kính vòng phân giải chât (dcơchất: ĩiim) dịch chiêt enzym thu từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto nhiệt độ khác \ d ^casein dcMC dĩinh bột L2 L3 TB LI L2 L3 TB L L2 L3 TB 30”C 23,49 23,76 23,46 23,57 19,00 18,76 18,85 18,87 20,26 20,82 20,76 20,61 23,10 23,12 23,22 23,14 10,26 10,14 10,00 10,13 16,74 16,38 16,53 16,55 t“C \ ĩT C L 37°c 30“C 37“C 37“C 30"C ® Cơ chất tinh bột -a chất CMC • chất casein — / '" Hình Vòng phân giải dịch lên men chât - ' Hình Vòng phân giải dịch chiêt enzym chât ** Protease ® Amylase Cellulase DLM37 DC30 DLM30 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ môi ữưòmg nuôi cấy tới khả sinh enzym ngoại bào B subtilis natto (Ghi chú: DLM 37, DLM 30, DC37, DC 30: dịch lên men 37°c, 30°c, dịch chiết enzym amoni Sulfat 60% bão hòa 37°c, 30°C) Khăo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tói khả sinh tổng họp protease B subtilis natto Bảng Đường kính vòng phân giải chất (dca chất'- ĩĩmi) dịch lên men theo thời gian nuôi cấy B subtilis natto dcasein V dcMC dxinh bột t/x 24h LI L2 L3 TB LI L2 L3 TB LI L2 L3 TB 17,80 17,60 17,56 17,65 (-) (-) (-) (-) 9,21 8,94 9,31 9,15 48h 17,40 17,3 16,9 17,20 (-) (-) (-) (-) 10,72 ,8 10,77 10,79 72h 16,40 16,60 16,60 16,53 (-) (-) (-) (-) 9,50 9,32 9,23 9,35 “■»^•ptotease Tf ÍT ã ầ 20 “■»“ Cellulâse IS 10 ì ■ ■ 24h amylase 48h 72h th i g ia « (h) Hình Biểu đồ thể ảnh hưỏfng thời gian nuôi cấy lên kliả tổng họp enzym ngoại bào qua đường kính vòng phân giải chất (dcachất^ dịch chiết enzyme Bàn luận - Các kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ môi trưòmg nuôi cấy lên khả sinh tổng họp protease B subtilis natto cho thấy thay đổi nhiệt độ nuôi cấy B subtỉlỉs natto (30°c 37°C), hoạt độ protease dịch lên men dịch chiết emym không thay đổi, 30“c hoạt độ amylase cellulase lớn nhiều so với 37"c (Bảng 1, Bảng 3) Vì chọn nhiệt độ nuôi cấy 37°c để tạo điều kiện thuận lợi cho việc chiết tách thu protease Đã nhiều công trình công bố ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ protease: Đỗ Thị Bích Thủy (2012) chủng Bacillus amylolyquefacien NI 35°C; nghiên cứu c Wang (2009) P Chantawannakul (2002) chọn nhiệt độ 37°c để nuôi cấy B subtilis natto [3, 5, ] Do đó, chọn nhiệt độ nuôi cấy 37°c để tiếp tục khảo sát ảnh hưỏTig thời gian nuôi cấy lên sinh tổng hợp enzym ngoại bào B siibtilis natto - Từ kết kỉiảo sát hoạt độ enzym ngoại bào thời đ i ể m 24 g iờ , 48 g iờ , 72 thấy; hoạt tính protease, amylase có xu hướng giảm dần (hoạt tính protease dịch chiết enzym qua đường kính vòng phân giải chất tưong ứng theo thời gian 24 giờ; 48 giờ; 72 23.14 mm; 20.19 mm; 19.65 mm) Hoạt tính celluỉase tăng nhẹ sau 48 nuôi cấy Sự giảm hoạt độ protease môi trường nuôi cấy giải thích nhiều lý do; thành phần môi trưòrng thay đổi, lượng dinh dưỡng giảm làm cho tế bào vi Iđiuẩn suy thoái, enzym bất hoạt Hơn nữa, protease xảy tượng autolysis (hiện tượng enzym tự thủy phân) vi khuẩn tổng hợp nên chất kìm hãm môi trưòĩig làm hoạt độ protease giảm Vì lựa chọn 24 thời gian nuôi cấy B subtilis natto để thu hoạt độ protease lớn nhất, đồng thời tiết kiệm thời gian nuôi cấy Đã có nhiều nghiên cứii ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới hoạt tính protease: Đỗ Thị Bích Thủy (2012) chủng Bacillus amvlolyquefacien NI 32 giờ; I Ahmed (2011) lựa chọn thòd gian nuôi cấy B subtilỉs 24 hoạt tính protease cao [3, 4] Kết iuận điều kiện nhiệt độ nuôi cấy 37°c, B subtilis natto sinh tổng hợp protease có hoạt tính cao, nhiệt độ hạn chế sinh tổng hợp a m y la se cellulase B subtilis natto v ề thời gian nuôi cấy B subtilis natto, lựa chọn thời gian nuôi cấy 24 giờ, vừa thu hoạt tính protease cao nhẩt, đồng thời tiết kiệm thời gian nuôi cấy Như bước đầu lựa chọn nhiệt độ môi trường thời gian nuôi cấy B subtỉlỉs natto 37°c 24 để tạo điều kiện cho tách chiết protease enzym có khả tiêu fibrin - ứng dụng phòng ngừa huyết khối Tài liệu tham khảo Đinh Thu Hương (2013), Nghiên cíai điều kiện nuôi cấy chiết enzym protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis natto, Luận văn thạc s ĩ dược học, Trường đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 3, 45 - 48 Lê Thanh Mai (2009), Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, NXB Khoa học kỹ thuật, tr 186 - 190 Đỗ Thị Bích Thủy (2012), “Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng tới sir thu nhận chế phẩm protease ngoại bào Bacillus amylolyquefacien N l, Tạp chí khoa học, Đại học Huế, 71(2), tr 286 - 288 I Ahmed, Muhammad Anjum Zia (2011), “Purification and kinetic parameters characterization of an alkaline protease produced from Bacillus subtilis through submerged fermentation technique” World Applied Sciences Journal, 12 (6 ), p 751 - 757 P Chantawannakul, Anchalee Oncharoena (2002), “Characterization of proteases of Bacillus subtilis strain 38 isolated from traditionally fermented soybean in Northern Thailand”, Science Asia, 28, p 241 - 245 c Wang, Ming Du (2009), “Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis natto B - 12”, Journal o f Agricultural and food chemistry article, 57, p 9722 - 9729  ... chọn nhiệt độ 37°c để nuôi cấy B subtilis natto [3, 5, ] Do đó, chọn nhiệt độ nuôi cấy 37°c để tiếp tục khảo sát ảnh hưỏTig thời gian nuôi cấy lên sinh tổng hợp enzym ngoại bào B siibtilis natto. .. Khăo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tói khả sinh tổng họp protease B subtilis natto Bảng Đường kính vòng phân giải chất (dca chất'- ĩĩmi) dịch lên men theo thời gian nuôi cấy B subtilis natto. .. Vì lựa chọn 24 thời gian nuôi cấy B subtilis natto để thu hoạt độ protease lớn nhất, đồng thời tiết kiệm thời gian nuôi cấy Đã có nhiều nghiên cứii ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới hoạt tính protease: