I HC THI NGUYấN TRNG I HC NễNG LM HONG TH HNG HNH NGHIấN CU BIU HIN GEN M HểA KHNG NGUYấN B MT CA TRYPANOSOMA EVANSI V NG DNG KHNG NGUYấN TI T HP SN XUT KT CHN ON BNH TIấN MAO TRNG GIA SC Chuyờn ngnh: Thỳ y Mó s: 60.64.01.01 LUN VN THC S TH Y Ngi hng dn khoa hc: TS Phan Th Hng Phỳc TS Phm Th Tõm Thỏi Nguyờn, nm 2013 S húa bi trung tõm hc liu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LI CAM OAN Tụi xin cam oan cỏc kt qu nghiờn cu c trỡnh by lun ny l ca chỳng tụi Cỏc s liu, kt qu nghiờn cu lun ny cha tng c cụng b bt k cụng trỡnh no khỏc Tỏc gi lun Hong Th Hng Hnh S húa bi trung tõm hc liu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LI CM N Nhõn dp hon thnh lun Thc s khoa hc nụng nghip chuyờn ngnh Thỳ y tụi xin by t lũng bit n sõu sc n GS TS Nguyn Th Kim Lan, TS Phan Th Hng Phỳc Khoa Chn nuụi Thỳ y Trng i hc Nụng Lõm Thỏi Nguyờn, TS Phm Th Tõm Khoa Cụng ngh sinh hc Vin i hc M H Ni, ó trc tip hng dn, tn tỡnh ch bo v to mi iu kin tt nht cho tụi sut quỏ trỡnh hc v nghiờn cu khoa hc Tụi xin trõn trng cm n: - Cỏc thy cụ giỏo Khoa Chn nuụi Thỳ y, ó giỳp tụi hon thnh khúa hc v nõng cao cht lng lun - Khoa o to sau i hc ó to iu kin cho tụi sut quỏ trỡnh hc ti trng Cui cựng tụi xin by t lũng bit n n nhng ngi thõn, gia ỡnh ó ng viờn, giỳp tụi hon thnh lun ny Xin trõn trng cm n! Thỏi Nguyờn, thỏng 10 nm 2013 Tỏc gi lun Hong Th Hng Hnh S húa bi trung tõm hc liu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii CH VIT TT V Kí HIU CATT Card Agglutination Test for Trypanosomiasis ADN Deoxyribo Nucleic Acid dNTP Deoxynucleotid triphotphat EDTA Ethylen Diamin Tetra Acetic IFAT Indirect Fluorescent Antibody Test IPTG Isopropyl D thiogalactoside PBS Phosphat Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction ARN Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulfat SDS PAGE Sodium Dodecyl Sulfat Poly Acrylamide TEA Tris axit acetic EDTA T evansi Trypanosoma evansi VAT Variant Antigen Tupe VSG Variant Surface Glucoprotein v/p Vũng/phỳt S húa bi trung tõm hc liu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv MC LC T VN 1 Tớnh cp thit ca ca ti Mc tiờu ca ti í ngha khoa hc v ý ngha thc tin ca ti 3.1 í ngha khoa hc 3.2 í ngha thc tin Chng 1: TNG QUAN TI LIU 1.1 TIấN MAO TRNG V BNH TIấN MAO TRNG GIA SC 1.1.1 c im hỡnh thỏi, cu trỳc v phõn loi tiờn mao trựng 1.1.2 Dch t hc bnh tiờn mao trựng 1.1.3 c im bnh lý v lõm sng ca bnh 11 1.1.4 Chn oỏn bnh tiờn mao trựng 14 1.1.5 Phng phỏp phỏt hin ADN ca tiờn mao trựng bng phn ng PCR (Polymerase Chain Reaction) 20 1.1.6 Phũng tr bnh tiờn mao trựng cho trõu, bũ, nga 21 1.2 VECTOR TCH DềNG 24 1.2.1 Khỏi nim 24 1.2.2 Cỏc loi vector tỏch dũng 25 1.2.3 Plasmid pCR 2.1 26 1.3 VECTOR BIU HIN 28 1.3.1 Khỏi nim 28 1.3.2 Cỏc h thng biu hin gen 29 Chng 2: VT LIU, NI DUNG V PHNG PHP NGHIấN CU 31 2.1 i tng 31 2.2 Vt liu, trang thit b v dng c nghiờn cu 31 2.1.1 Chng vi khun v plasmid 31 2.1.2 Cỏc b sinh phm, thang chun 31 2.1.3 Húa cht, mỏy múc v thit b 31 S húa bi trung tõm hc liu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v 2.1.4 Mụi trng v m 33 2.1.5 Cp mi s dng 33 2.2 NI DUNG, A IM V THI GIAN NGHIấN CU 34 2.3 Phng phỏp nghiờn cu 34 2.3.1 S nghiờn cu 34 2.3.2 Cỏc phng phỏp nghiờn cu 35 2.3.3 Phng phỏp biu hin 39 2.3.4 Phng phỏp tinh sch protein tỏi t hp bng ct ỏi lc Ni2+ 39 2.3.5 Phng phỏp in di protein (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) 42 2.3.6 Phn ng ELISA giỏn tip (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) 42 2.3.7 Phn ng Western blot (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) 43 2.3.8 Xỏc nh nhy v c hiu ca phn ng ELISA 44 2.3.9 Xỏc nh lp li ca kt qu phn ng ELISA 44 Chng 3: KT 46 3.1 Xỏc nh cỏc iu kin nuụi cy chng E coli BL21/pET-RoTAT 1.2 46 3.2 Biu hin gen mó húa khỏng nguyờn tỏi t hp RoTAT 1.2 48 3.3 Nghiờn cu xỏc nh cỏc iu kin biu hin gen mó húa khỏng nguyờn RoTAT 1.2 E.coli 50 3.3.1 Nghiờn cu xỏc nh thi gian tng sinh chng biu hin 50 3.3.2 Nghiờn cu xỏc nh nhit tng sinh chng biu hin 51 3.3.3 Nghiờn cu xỏc nh mi tng quan gia mt vi khun v mc biu hin gen mó húa khỏng nguyờn RoTAT 1.2 51 3.3.4 Nghiờn cu xỏc nh pH phự hp sinh tng hp protein tỏi t hp RoTAT 1.2 53 3.3.5 Nghiờn cu xỏc nh nng khỏng sinh phự hp cho s tng hp khỏng nguyờn tỏi t hp RoTAT 1.2 54 3.3.6 Nghiờn cu nh hng ca IPTG n s tng hp khỏng nguyờn tỏi t hp RoTAT 1.2 55 3.4 Biu hin v tinh sch khỏng nguyờn tỏi t hp RoTAT 1.2 56 S húa bi trung tõm hc liu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi 3.5 Nghiờn cu s dng khỏng nguyờn tỏi t hp RoTAT 1.2 xõy dng quy trỡnh phn ng ELISA phỏt hin bnh tiờn mao trựng 58 3.5.1 Kt qu xỏc nh hm lng khỏng nguyờn v pha loóng khỏng th thớch hp cho phn ng ELISA 59 3.5.2 Kho sỏt tỏc nhõn block ging 60 3.5.3 Kt qu xỏc nh thi gian a ELISA vi khỏng th c hiu ca T.evansi v anti-bovine IgG:HRPO 61 3.6 Kt qu xỏc nh nhy, c hiu ca phn ng ELISA 62 3.7 Xỏc nh mc lp li ca kt qu phn ng 63 3.7.1 ỏnh giỏ kh nng phỏt hin ca bnh ca phn ng ELISA trờn mu mỏu trõu bũ nghi nhim tiờn mao trựng 64 KT LUN V NGH 66 Kt lun 66 ngh 67 TI LIU THAM KHO 68 S húa bi trung tõm hc liu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii DANH MC BNG BIU Bng 2.1 Cỏc húa cht chớnh 32 Bng 2.2 Cỏc mỏy v thit b chớnh 33 Bng 2.3 Cụng thc pha gel tỏch (12%) 40 Bng 2.4 Cụng thc pha gel co (5%) 40 Bng 3.1 Xỏc nh hiu giỏ huyt v nng khỏng nguyờn ti u cho phn ng ELISA (S/N) 59 Bng 3.2 Giỏ tr OD ca phn ng ELISA vi cỏc tỏc nhõn block 60 Bng 3.3 Kt qu phn ng ELISA xỏc nh nhy v c hiu 63 Bng 3.4 Kt qu xỏc nh mc lp li kt qu phn ng ELISA 63 Bng 3.5 Kt qu xỏc nh trõu, bũ nhim bnh tiờn mao trựng bng phng phỏp ELISA v PCR 64 S húa bi trung tõm hc liu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ viii DANH MC HèNH Hỡnh 2.1 Kớch thc cỏc thang chun 31 Hỡnh 3.1 Trỡnh t gen v trỡnh t axit amin suy din ca RoTAT 1.2 46 Hỡnh 3.2 Kt qu bin np plasmid tỏi t hp vo E coli BL21 47 Hỡnh 3.3 Kt qu in di protein tng s ca trờn gel SDS-PAGE 48 Hỡnh 3.4 Kt qu Western blot kim tra tớnh c hiu ca protein tỏi t hp RoTAT 1.2 vi khỏng th c hiu ca Trypanosoma evansi 49 Hỡnh 3.5 Mc biu hin khỏng nguyờn RoTAT 1.2 theo thi gian cm ng 50 Hỡnh 3.6 Mc biu hin khỏng nguyờn RoTAT 1.2 cỏc nhit nuụi cy 51 Hỡnh 3.7 Mc biu hin khỏng nguyờn RoTAT 1.2 cỏc giỏ tr OD khỏc 52 Hỡnh 3.8 Mc biu hin khỏng nguyờn RoTAT 1.2 cỏc giỏ tr pH khỏc 53 Hỡnh 3.9 Mc biu hin khỏng nguyờn RoTAT 1.2 cỏc nng khỏng sinh ampicillin b sung vo mụi trng 54 Hỡnh 3.10 Mc biu hin khỏng nguyờn RoTAT 1.2 cỏc nng IPTG cm ng 55 Hỡnh 3.11 Protein thu c t dch nuụi cy chng E.coli BL21- pET32/ RoTAT1.2 56 Hỡnh 3.12 in di protein RoTAT 1.2 tinh sch trờn gel SDS-PAGE 57 Hỡnh 3.13 Phn ng western blot kim tra tớnh c hiu ca protein RoTAT 1.2 58 Hỡnh 3.14 nh hng ca thi gian huyt n kt qu phn ng ELISA 61 Hỡnh 3.15 nh hng ca thi gian anti-bovine IgG:HRPO n kt qu phn ng ELISA 62 S húa bi trung tõm hc liu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ T VN Tớnh cp thit ca ca ti Bnh tiờn mao trựng l bnh ký sinh trựng ng mỏu ph bin v gõy tỏc hi ln cho trõu, bũ v nhiu loi ng vt khỏc Trypanosoma evansi (T evansi) gõy Theo Phan ch Lõn v cs (2004) [9], Phan Vn Chinh (2006) [3], bnh tiờn mao trựng xut hin nhiu vựng trờn c nc, vi t l mc khỏ cao: trờn trõu l 13 30%, trờn bũ l 14%, ú t l gia sỳc cht/gia sỳc mc lờn ti 6,3 20% Bnh gõy thit hi ln cho ngnh chn nuụi nh hng n sn lng tht, sa v sc kộo Trong cỏc phng phỏp chn oỏn bnh tiờn mao trựng hin nc ta nh: phng phỏp chn oỏn truyn thng, phng phỏp chn oỏn huyt hc, phng phỏp chn oỏn sinh hc phõn t thỡ phng phỏp chn oỏn huyt hc c ỏnh giỏ l cú nhy v c hiu cao, cho kt qu nhanh v cú kh nng chn oỏn vi s lng mu ln thi gian ngn Tuy nhiờn, hin ti nc ta phi s dng Kớt nhp ngoi nờn giỏ thnh cao, cha cú kh nng s dng rng rói chn oỏn bnh tiờn mao trựng Vit Nam, sn xut Kớt huyt hc chn oỏn bnh tiờn mao trựng cũn l rt mi Cỏc cụng trỡnh nghiờn cu hu nh ch chung vo xỏc nh c im dch t, hiu qu chn oỏn ca mt s phng phỏp phỏt hin tiờn mao trựng v phng phỏp phỏt hin khỏng th, cha cú cụng trỡnh no nghiờn cu ch to Kớt chn oỏn bnh sn xut Kớt chn oỏn, cn phi cú mt lng ln khỏng nguyờn RoTAT 1.2, ngun khỏng nguyờn ny cú th c sn xut bi phng phỏp: t nhiờn v tỏi t hp Khỏng nguyờn t nhiờn c tỏch t ký sinh trựng sau tng sinh trờn ng vt thớ nghim u im ca phng phỏp ny l cú th ng thi to mt lng ln khỏng nguyờn Tuy nhiờn, khỏng nguyờn ny khụng tinh khit, thnh phn a dng, vỡ vy cú kh nng gõy phn ng dng tớnh gi vi cỏc khỏng th khỏc Trong khỏng nguyờn tỏi t hp cú th khc phc c nhng hn ch trờn 56 Kt qu hỡnh 3.10 cho thy, IPTG cú nh hng rt ln n s biu hin protein tỏi t hp RoTAT 1.2, lng protein tỏi t hp tng t l vi nng IPTG nng IPTG l mM cho bng protein l m nht hay lng protein tỏi t hp c tng hp nhiu nht Vi mong mun thu c lng khỏng nguyờn tỏi t hp nhiu nht, thc t, chỳng tụi ó kho sỏt mc biu hin khỏng nguyờn RoTAT 1.2 vi nng IPTG l 4-6 mM nhng kt qu cho thy rng protein tỏi t hp RoTAT 1.2 cng khụng c biu hin nhiu hn Do vy, nng cht cm ng IPTG l mM l thớch hp biu hin gen mó húa khỏng nguyờn RoTAT 1.2 3.4 Biu hin v tinh sch khỏng nguyờn tỏi t hp RoTAT 1.2 Sau ó la chn cỏc iu kin nuụi cy thớch hp, chng E coli BL21pET32/RoTAT1.2 c nuụi cy vi cỏc iu kin: pH mụi trng l 7; nng Amp l 100 g/ml; nhit nuụi cy l 37oC, thi gian tng sinh gi sau ú b sung IPTG vi nng mM cm ng gi, dch nuụi cy vi khun c thu, kim tra, tinh sch v kim tra kh nng c phỏt hin bi khỏng th c hiu vi Trypanosoma evansi Kt qu thớ nghim c trỡnh by cỏc hỡnh 3.11, 3.12, 3.13 Hỡnh 3.11 Protein thu c t dch nuụi cy chng E coli BL21pET32/RoTAT1.2 1-7: protein thu c t dch nuụi cy chng E coli BL21- pET32/RoTAT1.2, M: thang protein chun 57 Kt qu hỡnh 3.11 cho thy bng protein kớch thc kDa xut hin rt m cỏc ng chy s 1-7 chng t chng E coli BL21- pET32/RoTAT1.2 biu hin tt cỏc iu kin nuụi cy ó la chn c Tuy nhiờn, hỡnh nh in di cng thy rừ: protein tỏi t hp sau biu hin thnh cụng b ln cỏc protein khỏc thu c protein tinh sch, chỳng tụi ó tin hnh tinh sch protein tỏi t hp bng ct sc ký ỏi lc Ni2+ Protein tỏi t hp khỏng RoTAT 1.2 cú cha gc histidine õy l uụi Histag c mó húa bi cỏc b mó húa nm trờn gen mó húa khỏng th tỏi t hp c hiu khỏng nguyờn RoTAT 1.2 (hỡnh 3.1) uụi Histag ny cú ỏi lc mnh i vi Ni2+ nờn chy qua ct Ni2+ s gn kt tm thi vi Ni2+ cỏc protein khỏc s c trụi Protein tỏi t hp gn ct sc ký Ni2+ c tỏch bi native elution buffer (hỡnh 3.12) Hỡnh 3.12 in di protein RoTAT 1.2 tinh sch trờn gel SDS-PAGE M: Thang protein chun, 1-5: khỏng nguyờn RoTAT 1.2 thu pha 1, 2, 3, Kt qu in di trờn hỡnh 3.12 cho thy, tt c cỏc phõn on dch tinh sch u ch xut hin nht mt bng protein kớch thc kDa, ú, phõn on thu c lng protein nhiu nht Chng t rng ó tinh sch thnh cụng protein RoTAT 1.2 Khi mi c to ra, dch tng sinh v cm ng chng vi khun biu hin E 58 coli BL21- pET32/RoTAT1.2 ó c s dng xỏc nh tớnh khỏng nguyờn c hiu ca T evansi Tuy nhiờn, tri qua quỏ trỡnh ti u u kin nuụi cy vi khun v tinh sch protein RoTAT 1.2, liu rng protein ny cũn c phỏt hin c hiu bi khỏng th khỏng T evansi hay khụng Kt qu phn ng western blot trờn hỡnh 3.13 cho thy protein ny c nhn bit c hiu bi khỏng th khỏng T evansi, vch phn ng ca protein RoTAT 1.2 vi khỏng th c hiu vi T evansi tng ng vi vch phn ng ca khỏng nguyờn hũa tan ca T evansi vi khỏng th c hiu Kt qu ny cho phộp kt lun rng, khỏng nguyờn RoTAT 1.2 ó c ch to thnh cụng bng cụng ngh tỏi t hp gen Hỡnh 3.13 Phn ng western blot kim tra tớnh c hiu ca protein RoTAT 1.2 M: Thang protein chun, 1: khỏng nguyờn hũa tan ca T evansi vi khỏng th c hiu, 2: protein RoTAT 1.2 vi khỏng th c hiu ca T evansi 3.5 Nghiờn cu s dng khỏng nguyờn tỏi t hp RoTAT 1.2 xõy dng quy trỡnh phn ng ELISA phỏt hin bnh tiờn mao trựng Quy trỡnh ELISA chỳng tụi s dng l ELISA giỏn tip vi cỏc bc nh sau: Ph khỏng nguyờn tỏi t hp RoTAT 1.2 Ph sa tỏch b Gn khỏng th c hiu vi T evansi Gn khỏng th c hiu loi cú gn enzyme (conjugate) C cht sinh mu Dng phn ng bng H2SO4 59 S dng phng phỏp checkerboard xỏc nh cỏc thụng s ca quy trỡnh bao gm: nng khỏng nguyờn, pha loóng khỏng th, thi gian ph khỏng nguyờn, thi gian khỏng th, thi gian khỏng th c hiu loi 3.5.1 Kt qu xỏc nh hm lng khỏng nguyờn v pha loóng khỏng th thớch hp cho phn ng ELISA Khỏng nguyờn RoTAT 1.2 c ch to bng cụng ngh tỏi t hp gen mó húa khỏng nguyờn b mt ca T evansi t bo E coli BL21, khỏng nguyờn ny cú th c nhn bit c hiu bi khỏng th khỏng T evansi Khỏng nguyờn RoTAT1.2 c pha loóng v ph lờn a ELISA (Nunc, M) cỏc nng : 15; 20; 25; 30, 35 àg/ml Huyt cha khỏng th c hiu ca T evansi c pha loóng PBS theo cỏc t l 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600 Kt qu xỏc nh hm lng khỏng nguyờn v pha loóng khỏng th thớch hp cho phn ng ELISA bng 3.1 cho thy: giỏ tr S/N t cao nht l 3,85, tng ng vi nng khỏng nguyờn RoTAT1.2 l 30 àg/ml, pha loóng huyt l 1:400 õy l cỏc nng c coi l thớch hp nht cho phn ng ELISA phỏt hin khỏng th c hiu ca T evansi Bng 3.1 Xỏc nh hiu giỏ huyt v nng khỏng nguyờn ti u cho phn ng ELISA (S/N) Nng khỏng nguyờn RoTAT 1.2 (àg/ml) pha loóng huyt dng chun 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 15 3,30 3,46 3,08 2,67 2,85 20 3,30 3,43 2,19 2,62 2,57 25 3,21 3,64 3,33 2,78 2,72 30 3,33 3,31 3,85 2,81 3,36 35 2,27 3,43 2,44 2,85 2,58 60 3.5.2 Kho sỏt tỏc nhõn block ging i vi cỏc th nghim dch lai trờn pha rn nh ELISA thỡ tin hnh trờn mu, cỏc protein khụng phi l protein mc tiờu cú th gn lờn b mt ging ti nhng v trớ khụng cú khỏng th ph ging v lm gim nhy v c hiu ca quy trỡnh Tỏc nhõn block ging c s dng hn ch hin tng ny Cỏc tỏc nhõn block thng s dng ELISA l cỏc protein nh BSA (bovine serum albumin), sa gy hoc casein, gelatin Trong thớ nghim ny, ba tỏc nhõn block ging l BSA, sa tỏch b (skim milk) v gelatin c kho sỏt tỡm tỏc nhõn block cho tớn hiu nn thp nht cho quy trỡnh ELISA, mi giỏ tr nng ca mt tỏc nhõn block c lp li ln Cỏc ging thớ nghim ny khụng b sung khỏng nguyờn RoTAT 1.2 m b sung tỏc nhõn block nhm xem xột tớn hiu nn ca phn ng Kt qu c trỡnh by bng 3.2 Bng 3.2 Giỏ tr OD ca phn ng ELISA vi cỏc tỏc nhõn block Tỏc nhõn block BSA Sa tỏch b Gelatin Nng OD Ln Ln Ln Trung bỡnh STD 1% 1,007 0,942 0,93 0,960 0,041 b 3% 0,41 0,402 0,388 0,400 0,011 c 5% 0,279 0,264 0,272 0,272 0,008 d 1% 0,150 0,173 0,154 0,159 0,012 e 3% 0,124 0,122 0,129 0,125 0,003 e 5% 0,099 0,095 0,097 0,097 0,001 e 1% 0,187 0,149 0,152 0,163 0,002 a 3% 0,101 0,102 0,099 0,101 0,012 a (Theo hng dc nhng s mang ch cỏi khỏc cú ý ngha thng kờ) Giỏ tr OD thp nht t c nng sa tỏch b 5% v gelatin 3% Tuy nhiờn, xột v mc n nh ca giỏ tr OD gia cỏc ln thớ nghim vi cỏc nng khỏc thỡ sa tỏch b th hin kh nng hn ch hin tng dng tớnh gi tt hn gelatin S khỏc bit v OD gia ba nng ny vi cỏc nng cũn li cú ý ngha thng kờ nhng s khỏc bit gia chỳng thỡ khụng cú 61 ý ngha thng kờ Vỡ vy, chỳng tụi chn sa tỏch b 5% lm tỏc nhõn block ging cho quy trỡnh ELISA 3.5.3 Kt qu xỏc nh thi gian a ELISA vi khỏng th c hiu ca T evansi v anti-bovine IgG:HRPO Vi nng khỏng nguyờn RoTAT1.2 l 30 àg/ml, a qua ờm 4oC pha loóng huyt cha khỏng th c hiu ca T evansi l 1:400, phn ng khỏng nguyờn-khỏng th c thc hin 370C 45, 60, 90, 120 phỳt Giỏ tr OD450 ca phn ng c o ln cho thy: tt c cỏc t l S/N ti cỏc thi gian phn ng u nm khong 3,6-3,8, ú giỏ tr ny cao nht t ti thi im 90 phỳt phn ng õy chớnh l thi gian thớch hp khỏng th vi khỏng nguyờn Hỡnh 3.14 nh hng ca thi gian huyt n kt qu phn ng ELISA Thớ nghim xỏc nh nh hng ca iu kin phc hp phn ng khỏng nguyờn-khỏng th v anti-bovine IgG:HRPO c thc hin 30, 45, 60, 90 phỳt nhit phũng, giỏ tr OD450 cng c xỏc nh ln, giỏ tr S/N ca cỏc mu phn ng cng nm khong t 3,6 n 3,8 (hỡnh 3.14), ú t l S/N ti 45 phỳt l cao nht, õy chớnh l thi gian thớch hp anti-bovine IgG:HRPO vi phc hp khỏng th- khỏng nguyờn 62 Hỡnh 3.15 nh hng ca thi gian anti-bovine IgG:HRPO n kt qu phn ng ELISA 3.6 Kt qu xỏc nh nhy, c hiu ca phn ng ELISA ỏnh giỏ hiu qu chn oỏn ca mt phng phỏp huyt hc thỡ cỏc giỏ tr nhy v c hiu phi c thc hin trờn gia sỳc gõy nhim v khụng gõy nhim vi mm bnh Tuy nhiờn, nghiờn cu ny, s lng gia sỳc thớ nghim khụng nhiu (3 trõu gõy nhim T evansi v 07 trõu khụng gõy nhim) vỡ vy cú th gõy sai s tớnh cỏc giỏ tr ny chớnh xỏc hn vic xỏc nh nhy v c hiu ca phn ng ELISA s dng khỏng nguyờn tỏi t hp RoTAT1.2 xỏc nh bnh T evansi trờn trõu Vit Nam, chỳng tụi s dng 52 mu huyt trõu thớ nghim, ú cú: 18 mu dng tớnh vi T evansi ó c kim tra bng phng phỏp tiờm truyn chut v ELISA vi khỏng nguyờn hũa tan ca T evansi (bao gm 03 mu trõu gõy nhim vi T evansi), 34 mu õm tớnh vi T evansi (bao gm 07 mu trõu khụng gõy nhim T evansi, ó c iu tr Berenil v kim tra huyt õm tớnh vi T evansi thỏng) c s dng thit lp phn ng ELISA chn oỏn bnh T evansi bng khỏng nguyờn RoTAT 1.2 Kt qu phn ng ELISA c th hin bng 3.7 63 Bng 3.3 Kt qu phn ng ELISA xỏc nh nhy v c hiu Xột nghim (+) Cỏc mu huyt trõu nhim T evansi 17 Cỏc mu huyt trõu khụng nhim T evansi Xột nghim (-) 32 02 Tng s 18 34 10 Kt qu Tng s 08 T 18 mu mỏu trõu dng tớnh vi T evansi cú 17 mu dng tớnh vi phn ng ELISA s dng khỏng nguyờn tỏi t hp RoTAT1.2, iu ỏng chỳ ý l 03 mu mỏu trõu gõy nhim vi T evansi phõn lp c t Lng Sn u cú kt qu dng tớnh Tng t nh vy, 32/34 mu mỏu trõu õm tớnh vi T evansi v phn ng ELISA cng bao gm 07 mu mỏu trõu khụng gõy nhim T evansi Kt qu trờn cho phộp phỏt hin nhy ca phn ng (Se) l 94,12%, c hiu ca phn ng (Sp) l 99,44% 3.7 Xỏc nh mc lp li ca kt qu phn ng 10 mu huyt trõu c ly ngu nhiờn thc hin ln phn ng ELISA vi khỏng nguyờn RoTAT1.2 cỏc iu kin nh Kt qu phn ng c o ti bc súng 450 nm Bng 3.4 Kt qu xỏc nh mc lp li kt qu phn ng ELISA Mu huyt Kt qu ELISA OD450 Ln Ln Ln Ln Ln 0,203 0,199 0,186 0,217 0,217 Giỏ tr trung bỡnh 0,204 0,075 0,072 0,069 0,071 0,068 0,071 3,86 0,217 0,217 0,198 0,203 0,199 0,207 4,59 0,181 0,192 0,187 0,184 0,194 0,187 2,89 0,096 0,111 0,099 0,125 0,118 0,109 11,22 0,091 0,094 0,092 0,087 0,084 0,09 4,51 0,068 0.00,061 0,069 0,064 0,065 5,22 0,195 0,201 0,198 0,197 0,199 ,198 1,13 0,468 0,453 0,487 0,467 0,417 0,458 5,70 10 0,071 0,075 0,068 0,069 0,072 0,071 3,86 0,063 CV(%) 6,41 64 Kt qu bng 3.8 cho thy, h s bin ng (CV) cao nht l 11,22%, h s ny cng cao thỡ s sai khỏc gia cỏc ln phn ng cng ln Xỏc nh s sai khỏc gia cỏc ln lp cho thy, phn ng ELISA chn oỏn bnh T evansi da vo khỏng nguyờn RoTAT1.2 cho kt qu hon ton tng ng gia cỏc ln thớ nghim 3.7.1 ỏnh giỏ kh nng phỏt hin ca bnh ca phn ng ELISA trờn mu mỏu trõu, bũ nghi nhim tiờn mao trựng Trong phn ng ELISA, mt mu huyt c xem l cú tng tỏc c hiu nhtvi mt khỏng nguyờn giỏ tr OD ca mu ú ln hn mt giỏ tr ngng (cut-off) ỏng tin cy Thụng thng, giỏ tr ngng c tớnh da trờn giỏ tr OD trung bỡnh ca mt lng ln cỏc mu õm tớnh vi khỏng nguyờn mc tiờu S mu õm cng ln thỡ giỏ tr ngng cng ỏng tin cy Cụng thc xỏc nh giỏ tr ngng (cut off): Cut off = OD trung bỡnh ca cỏc mu õm + 2* STD ln nht ca cỏc mu õm S mu õm m chỳng tụi s dng d tớnh giỏ tr ngng l 15 mu Giỏ tr ngng tớnh c l 0,63 Huyt ca trõu, bũ nghi nhim bnh tiờn mao trựng c gi t 800C 60 mu huyt gm 46 mu huyt trõu v 14 mu huyt bũ c thu thp phỏt hin khỏng th c hiu ca T evansi Cỏc mu mỏu ca nhng trõu,bũ ny c kim tra song song bng phng phỏp PCR so sỏnh hiu qu phỏt hin Kt qu c trỡnh by bng 3.9 Bng 3.5 Kt qu xỏc nh trõu, bũ nhim bnh tiờn mao trựng bng phng phỏp ELISA v PCR Kt qu phn ng ELISA Kt qu phn ng PCR S mu dng S mu õm tớnh tớnh Tng s S mu dng tớnh S mu õm tớnh 49 51 Tng s 52 60 65 Vi 60 mu huyt trõu, bũ thu thp ngoi thc a, phn ng PCR ó phỏt hin c mu dng tớnh v 52 mu õm tớnh, t l phỏt hin dng tớnh t 13,3%; ú, phn ng ELISA phỏt hin c mu dng tớnh v 51 mu õm tớnh, t l phỏt hin dc tớnh t 15% So vi phng phỏp PCR, t l trựng hp ngu nhiờn ca cỏc mu dng tớnh ELISA l: 6/(6+2) x 100%= 75% , t l trựng hp ngu nhiờn ca cỏc mu õm tớnh ELISA l 49/(49+3) x 100%= 94%, t l trựng hp ngu nhiờn tng s l: (6+49)/60* 100%= 91,7% Trong nghiờn cu ny, nhy v c hiu ca phn ng ELISA t ti 94,12% v 99,44% v theo Holland, 2001[26]: nhy ca phn ng PCR l 78,2%, c hiu l 100% Trong thc t, ELISA l phng phỏp phỏt hin giỏn tip bnh tiờn mao trựng thụng qua s cú mt ca khỏng th c hiu vi T evansi ú PCR l phng phỏp phỏt hin trc tip s cú mt ca ký sinh trựng mỏu ca vt ch Vỡ vy, vt mi mc bnh khong tun u, hm lng khỏng th to thp cú th dn ti hin tng õm tớnh gi vi phn ng ELISA Cỏc trng hp vt ch mi bnh, ký sinh trựng khụng cũn tn ti c th nhng khỏng th c hiu tn lu mỏu dn ti hin tng dng tớnh gi ca ELISA Mc dự vy, phn ng ELISA cú u im ni tri ú l cú th xột nghim cựng lỳc nhiu mu bnh phm, thi gian xột nghim nhanh, quy trỡnh thc hin n gin 66 KT LUN V NGH Kt lun Qua quỏ trỡnh nghiờn cu ti chỳng tụi ó thu c nhng kt qu sau: - Xỏc c cỏc iu kin nuụi cy chng E coli BL21/pET RoTAT theo phng phỏp bin np dch nuụi cy c tri trờn a mụi trng LB thch cú b sung cht khỏng sinh Ampicillin 100 mg/ml v nuụi 37oC qua ờm - Biu hin c gen mó húa khỏng nguyờn tỏi t hp c hiu ca khỏng nguyờn RoTAT 1.2, ú: Xỏc nh c thi gian tng sinh ca chng biu hin tt nht l gi Xỏc nh c nhit tng sinh ca chng biu hin 37oC l phự hp nht Xỏc nh c mi tng quan gia mt vi khun v mc biu hin gen mó húa khỏng nguyờn RoTAT 1.2 khụng nh hng nhiu ti mc biu hin Xỏc nh c pH phự hp chng E coli BL21 pET32(+) sinh tng hp protein tỏi t hp RoTAT 1.2 l khong Xỏc nh c nng khỏng Amp l 100 g/ml l thớch hp biu hin khỏng nguyờn t chng vi khun ny Xỏc nh c nh hng ca cht cm ng IPGT n s tng hp khỏng nguyờn tỏi t hp nng 3mM l thớch hp biu hin gen mó húa khỏng nguyờn tỏi t hp - Biu hin v tinh sch thnh cụng khỏng nguyờn tỏi t hp RoTAT 1.2 (khỏng nguyờn tỏi t hp RoTAT 1.2 ca T evansi ó c ch to thnh cụng bng cụng ngh tỏi t hp gen) - Thit lp thnh cụng KIT chn oỏn bnh tiờn mao trựng trờn trõu bũ Xỏc nh c hm lng khỏng nguyờn RoTAT 1.2 l 30 g/ml v pha loóng khỏng th l 1: 400 thớch hp cho phn ng ELISA Kho sỏt tỏc nhõn block ging cho thy sa tỏch b 5% l hn ch c hin tng dng tớnh gi phn ng ELISA Xỏc nh c thi gian thớch hp khỏng nguyờn vi khỏng th l 90 phỳt v thi gian anti-bovine IgG:HRPO vi phc hp khỏng nguyờn khỏng th l 45 phỳt 67 Xỏc nh c nhy ca phn ng (Se) l 94,12% v c hiu (Sp) ca phn ng ELISA l 99,44% Xỏc nh c mc lp li ca kt qu phn ng cho kt qu l tng ng gia cỏc ln thớ nghim ỏnh giỏ c kh nng phỏt hin ca bnh ca phn ng ELISA trờn mu mỏu trõu, bũ nghi nhim tiờn mao trựng bng cỏch so sỏnh vi phn ng PCR cho kt qu trựng hp ngu nhiờn ca cỏc mu dng tớnh l 75%, õm tớnh l 94%v tng s l 91,7% ngh Tip tc nghiờn cu ch to khỏng nguyờn tỏi t hp phc v cho vic sn xut Kớt chn oỏn bnh tiờn mao trựng cho gia sỳc Vit Nam 68 TI LIU THAM KHO ỏi Duy Ban, L Th Cm Võn (1994), Cụng ngh gen v cụng ngh sinh hc ng dng nụng nghip hin i Nxb nụng nghip, H Ni Phm Chin, Nguyn c Tõn, Lờ c Quyt (1999), Kt qu kho sỏt ký sinh trựng ng mỏu trờn n bũ huyn Mi Dinh Daklak", Kt qu hot ng KHKT Thỳ y, tr 53 Phan Vn Chinh (2006), Bnh tiờn mao trựng Trypanosoma evansi trõu, bũ nuụi ti cỏc tnh Trung v bin phỏp phũng tr, Lun ỏn Tin s nụng nghip, H Ni Nguyn Quc Doanh (1999), Mt s c tớnh sinh hc ca T evansi (Steel, 1885), bnh hc chỳng gõy ra, quy trỡnh bo qun v s dng ging T evansi chn oỏn bnh tiờn mao trựng, Lun ỏn Tin s nụng nghip, H Ni Lng Vn Hun, Lờ Hu Khng (1997), Ký sinh v bnh ký sinh gia sỳc, gia cm, Nh xut bn i hc Quc gia TP.HCM Nguyn ng Khi (1995), "V triu chng sy thai bnh tiờn mao trựng trõu bũ T evansi", Tp khoa hc k thut thỳ y, III, s 1, tr 69 - 71 Phm S Lng (1982), Mt s c im dch t hc bnh tiờn mao trựng trõu, bũ Trypanosoma evansi cỏc tnh phớa Bc Vit Nam, Lun ỏn Phú tin s khoa hc Thỳ y Phan ch Lõn (1974), Thnh phn h mũng Tabanidae v vai trũ truyn bnh ca nú Bc Vit Nam, Tp Khoa hc K thut Nụng nghip Phan ch Lõn (2004), Bnh ngó nc trõu bũ, Nxb Nụng nghip, H Ni, tr 56 - 73 10 H Vit Lng (1998), n bo ký sinh, c im dch t v bin phỏp phũng tr bnh Trypanosomiasis bũ thuc Nam Trung B, Lun Thc s khoa hc Nụng nghip, H Ni 11 Lờ Ngc M (1994), "Kt qu bc u thit lp phn ng ELISA chn oỏn bnh tiờn mao trựng" Tp khoa hc k thut thỳ y, II, s 69 12 Lờ Ngc M (1994), "Phng phỏp ELISA phỏt hin khỏng nguyờn v cỏc phng phỏp ký sinh trựng hc chn oỏn bnh tiờn mao trựng (T evansi) trõu bũ mc bnh t nhiờn", Tp Khoa hc k thut Thỳ y, II, s 13 on Vn Phỳc, Phm S Lng, Nguyn ng Khi (1981), Thớ nghim dựng Trypamidium iu tr bnh tiờn mao trựng", Thụng tin thỳ y - Vin Thỳ y, H Ni 14 on Vn Phỳc v cs (1994), Kt qu ng dng mt s phng phỏp huyt hc chn oỏn bnh tiờn mao trựng trõu thc a", Tp Khoa hc k thut Thỳ y, II, s 15 Vng Th Lan Phng (2004), Nghiờn cu khỏng nguyờn b mt Trypanosoma evansi phõn lp t trõu, bũ phớa Bc Vit Nam v tinh ch khỏng nguyờn dựng phn ng dch hunh quang giỏn tip Lun ỏn Tin s Nụng nghip, H Ni 16 Lờ c Quyt (1995), "Tỡnh hỡnh trõu, bũ nhim tiờn mao trựng mt s tnh duyờn hi Trung v Tõy Nguyờn", Tp Khoa hc k thut Thỳ y, III, s 17 Khut Hu Thanh (2003) C s di truyn phõn t v k thut gen Nxb khoa hc v k thut, H Ni 18 Khut Hu Thanh, (2006) K thut gen Nguyờn lý v ng dng Nxb khoa hc v k thut, H Ni 19 Nguyn Nh Thanh (2000), C s ca phng phỏp nghiờn cu dch t hc thỳ y, Nxb Nụng nghip H Ni, tr 126 20 Lng T Thu (1994), "Kt qu sn xut Conjugate hunh quang chn oỏn bnh tiờn mao trựng v so sỏnh nhy ca nú vi cỏc phng phỏp chun khỏc", Tp Khoa hc k thut Thỳ y, II, s 21 Lng T Thu, Lờ Ngc M (1996), "Nghiờn cu ng dng cỏc phng phỏp ngng kt trờn bn nha (CATT) chn oỏn tỡnh hỡnh bnh tiờn mao trựng (do T evansi) trờn n trõu Vit Nam", Tp Khoa hc k thut Thỳ y, IV, s *Ting Anh 22 Barry J D., Tumer C M R (1991), The diamics of antigenic variation and growth of African trypanosomes, Parasitology Today, 7, pp 207 - 21 70 23 Davison (1999) Evaluation of diagnostic test for T evansi and then application in epidemiogical studies in Indonesia, PhS thesis Eliburgh 24 Jacoboson RH (1998),The sensitivity and specificity of a test can be obtained, Diagnostic Laboratory, College of Veterinary Medicine, Comell University, Ithaca, United States of America, pp 469 486 25 Holland WG, Claes F, My LN, Thanh NG, Tam PT, Verloo D, Bỹscher P, Goddeeris B, Vercruysse J (2001): A comparative evaluation of parasitological tests and a PCR for Trypanosoma evansi diagnosis in experimentally infected water buffaloes.2001, 97 : 23-33 PubMed Abstract 26 Hoare C A (1972), The Trypanosomes of MammaIs A zoological monograph, Black well scientific Publication Oxford and Edinburgh 27 Losos G J., Ikede B O (1972), Review of the pathology of diseases of domectic and laboratory animal caused by T congolense, T vivax, T brucei, T rhodensiense and T gambiense, Joumal of Veterinary pathology, 9, pp - 15 28 Luckins A G (1988), Trypanosoma evansi in Asia, Parasitology today, pp - 49 29 Raper J., Portela Molina M P., (2002), Natural immunity to human African trypanosomiasis: Trypanosomelytic factor and the blood incubation infectivity test Trans R Soc Trop Med Hyg, Apr, 96 30 Urakawa T, Phelix AO Majiwa , Bruno Goddeeris, Philip, Magda Radwanska (2001), Variable Surface Glycoprotein RoTat 1.2 PCR as a specific diagnostic tool for the detection of Trypanosoma evansi infections, Japan International.Cooperation Agency 31 Ventura, Verloo D, Moens L, Bỹscher P, Majiwa PAO(2004): Trypanosoma evansi: cloning and expression in Spodoptera fugiperda insect cells of the diagnostic antigen RoTat 1.2 32 Yoshihito Kiwaraki, (2002), Immunological Laboratory techniques, Japan International.Cooperation Agency 33 Bashir Salim, (2010), DNA Extratcion from FTA cards www.animalgenone.org.com.muity/ /3429.html [...]... về biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi và ứng dụng để sản xuất Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 3 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Đề tài chế tạo được kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho gia súc tại Việt Nam, nhằm phục vụ cho việc chẩn đoán nhanh và hiệu quả bệnh tiên mao trùng cho gia súc 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TIÊN MAO TRÙNG VÀ BỆNH... phát hiện kí sinh trùng Trypanosoma evansi gây bệnh trên gia súc và đề xuất biện pháp phòng bệnh hiệu quả là vấn đề cấp thiết Với mục tiêu sản xuất được Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trong nước, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi và ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở gia súc ...2 Theo nghiên cứu của Urakawa và cs (2001) [30], kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 được sản xuất dựa trên chức năng biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên vào tế bào côn trùng dòng Sf 9 Dòng tế bào tái tổ hợp có khả năng tổng hợp và tiết kháng nguyên vào dịch nuôi cấy tế bào Khi ứng dụng kháng nguyên RoTAT 1.2 vào sản xuất Kít chẩn đoán, kháng nguyên tái tổ hợp có độ nhạy tương tự như với kháng nguyên RoTAT... tương ứng là 99% và 89,3% Kết quả này cho thấy khả năng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 phát hiện được kháng thể đặc hiệu của Trypanosoma evansi Như vậy, để chủ động nguồn kháng nguyên tinh khiết để sản xuất Kít chẩn đoán nhanh và chính xác, từ đó có biện pháp điều trị kịp thời và hiệu quả bệnh tiên mao trùng cho gia súc ở Việt Nam thì vấn đề nghiên cứu chế tạo kháng nguyên tái tổ hợp sản xuất Kít. .. độ của phản ứng Phương pháp ELISA hiện đang được sử dụng rộng rãi ở các nước trên thế giới Ở Việt Nam, Lê Ngọc Mỹ và cs (1994) [12] đã bước đầu chế kháng nguyên tiên mao trùng và ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở nước ta * Các phương pháp phát hiện kháng nguyên tiên mao trùng - Phương pháp ELISA kháng nguyên (Ag - ELISA) Đây là phương pháp sử dụng phản ứng ELISA kháng nguyên để phát hiện kháng. .. đổi kháng nguyên bề mặt của ký sinh trùng đã có ngay ở pha đầu tiên của quá trình nhiễm (trước khi xuất hiện đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ) Theo Hajduc và Vickernlan (1981), hiện tượng biến đổi kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng còn thấy ở gia súc đã bị tiêm thuốc làm suy giảm miễn dịch Những quan điểm này là hoàn toàn mới để lý luận về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên mao trùng. .. Mục tiêu của đề tài Mục tiêu chung - Sản xuất được Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng tại Việt Nam có độ nhạy và độ đặc hiệu cao Mục tiêu cụ thể - Sản xuất được kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của loài tiên mao trùng Trypanosoma evansi - Chế tạo được bộ Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho gia súc ở Việt Nam 3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học Kết quả của đề tài... mao trùng bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR là phương pháp hiện đại nhất, mới được đưa vào ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trong những năm gần đầy Nguyên lý: dựa vào phản ứng chuỗi Polymerase để xác định sự có mặt gen AND của tiên mao trùng trong máu động vật nhiễm bệnh Mullis và cs (1986) đã thiết lập qui trình phản ứng để ứng dụng chẩn đoán bệnh tiên mao trùng Sau đó, Desquesnes... số lượng tiên mao trùng trong máu, sau đó giảm và khó phát hiện thấy tiên mao trùng Mỗi đợt tiên mao trùng tăng lên trong máu là biểu hiện sự xuất hiện một quần thể tiên mao trùng có tính kháng nguyên bề mặt mới, quần thể này có thể tiếp tục sinh sản và tồn tại một thời gian cho đến khi cơ thể xuất hiện kháng thể đặc hiệu với chúng Tiên mao trùng phát triển nhanh trong máu, tiêu thụ Glucose và các chất... để phát hiện kháng thể lưu động có trong máu của gia súc mắc bệnh tiên mao trùng Nguyên lý của phương pháp LATEX: khi kháng nguyên bề mặt T evansi gắn lên các hạt latex kết hợp với kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng ở trên bản nhựa, thì sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên với kháng thể Hiện tượng ngưng kết có thể quan sát được bằng mắt thường, và được giải thích là do kháng nguyên bề ... sản xuất Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng nước, tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu biểu gen mã hóa kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất Kít. .. biểu gen mã hóa kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi ứng dụng để sản xuất Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 3 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Đề tài chế tạo kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất Kít chẩn. .. xuất kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT1.2 - Nghiên cứu ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 để thiết lập phản ứng ELISA chẩn đoán bệnh tiên mao trùng - Bước đầu đánh giá hiệu chẩn đoán bệnh tiên