TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG NGÔ THỊ THẢO OANH MSSV: 2071829 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN ĐẾN HIỆU QUẢ SINH TỔNG HỢP PECTIN METHYLESTERASE TỪ ASPERGILLUS NIGER SỬ DỤNG PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã ngành: 08 Người hướng dẫn Ths TRẦN THANH TRÚC NĂM 2010 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CAM ĐOAN Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài “Ảnh hưởng điều kiện lên men đến hiệu sinh tổng hợp Pectin Methylesterase từ Aspergillus Niger sử dụng phụ phẩm nông nghiệp” sinh viên Ngô Thị Thảo Oanh thực báo cáo hội đồng chấm luận văn thông qua Người viết Ngô Thị Thảo Oanh Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Trang i Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM TẠ Nhờ tận tình giúp đỡ thầy cô bạn, mà đề tài tốt nghiệp hoàn thành sau ba tháng làm việc phòng thí nghiêm Có kết này, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến: Cô Trần Thanh Trúc, người trực tiếp hướng dẫn quan tâm giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Nguyễn Văn Mười giúp đỡ em nhiều trình thực luận văn Mặc dù bận rộn với công việc giảng dạy thầy cô thường xuyên theo dõi, hướng dẫn giúp đỡ em tận tình Thầy cô môn Công Nghệ Thực Phẩm, người cho em kiến thức quý báu thời gian học tập trường.Cán phòng thí nghiệm môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại học Cần Thơ, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài Các chị học viên cao học Công nghệ sinh học K16, Công nghệ Thực phẩm Đồ Uống K17 bạn sinh viên lớp Công nghệ Thực phẩm K33 nhiệt tình đóng góp ý kiến động viên giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài phòng thí nghiệm Em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý thầy cô trường Đại học Cần Thơ tận tình truyền đạt kiến thức cho em suốt bốn năm học tập trường Cuối lời, kính gởi đến cha mẹ người thân yêu lòng biết ơn sâu sắc giành cho con, bên con, tạo đầy đủ điều kiện cho học tập nghiên cứu Kính chúc quý thầy cô bạn dồi sức khỏe thành công sống Em xin chân thành cảm ơn ! Cần Thơ, 06 tháng 12 năm 2010 Sinh viên thực Ngô Thị Thảo Oanh Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Trang ii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Mục tiêu đề tài khảo sát hiệu trình nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase (PME, EC 3.1.1.11) từ Aspergillus niger điều kiện lên men bề mặt môi trường rắn (SSF) chất gồm bã táo ta khô vỏ bưởi tươi tỷ lệ khác Sự thay đổi thành phần hóa học chất lên men xác định suốt trình nghiên cứu nhằm tạo điều kiện lên men tối ưu cho việc sinh tổng hợp enzyme pectin methylesterase Kết nghiên cứu cho thấy, thành phần hóa học bã táo khô có đầy đủ thành phần dinh dưỡng thích hợp cho trình lên men sinh enzyme PME hàm lượng pectin cao (34,83%) thêm vào kết hợp với vỏ bưởi tươi có độ DE đến 84,77% điều kiện tối thích cho Aspergillus niger sinh tổng hợp PME Trên chất bã táo khô vỏ bưởi tươi, tỷ lệ thích hợp cho trình sinh tổng hợp PME 5:5 (bổ sung nước tạo độ ẩm 60%) Hoạt tính enzyme đạt giá trị cao sau ngày lên men hoạt tính thu khoảng 41,16 ± 4,18 U/mL, cao gấp 8,5 lần so sánh với môi trường lên men sử dụng bã táo Từ khóa: Aspergillus niger, PME, bã táo, vỏ bưởi, thời gian ủ, hoạt tính Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Trang iii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM TẠ ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC .iv DANH SÁCH HÌNH .vi DANH SÁCH BẢNG .vii CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu CHƯƠNG 2.1 Cơ chất pectin 2.1.1 2.2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU Tổng quan chất pectin Enzyme pectin methylesterase (PME) 2.2.1 Giới thiệu chung 2.2.2 Các tính chất PME .6 2.2.3 Các nguồn PME khác tự nhiên đặc tính loại .7 2.2.4 Ứng dụng PME 10 2.3 Sơ lược nấm mốc Aspergillus .10 2.3.1 Aspergillus 10 2.3.2 Aspergillus niger 11 2.4 Thu nhận enzyme PME từ nấm mốc Aspergillus niger 12 2.5 Các điều kiện ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp PME từ A.niger 13 2.5.1 Vai trò chất trình lên men sinh enzyme PME 13 2.5.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến hiệu sinh tổng hợp PME .14 2.6 Giới thiệu sơ lược táo bưởi, nguồn chất giàu pectin 15 2.6.1 Táo ta 15 2.6.2 Bưởi 16 2.7 Các nghiên cứu có liên quan .17 CHƯƠNG 3.1 PHƯƠNG TIỆN – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 Phương tiện nghiên cứu 19 3.1.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 19 Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Trang iv Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Trường Đại học Cần Thơ 3.1.2 Dụng cụ, thiết bị .19 3.1.3 Hóa chất .20 3.1.4 Đối tượng nghiên cứu 20 3.2 Phương pháp nghiên cứu 20 3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 20 3.2.2 Phương pháp phân tích đo đạc kết 21 3.2.3 Phương pháp thu thập xử lý kết 22 3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 22 3.3.1 Phân tích thành phần hóa học chất lên men 22 3.3.2 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn bã táo vỏ bưởi .22 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ đến khả sinh tổng hợp PME từ A.niger 23 CHƯƠNG 4.1 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 25 Xác định thành phần hoá học (pectin, DE, đường tổng số, đạm ), độ ẩm chất lên men .25 4.2 Ảnh tỷ lệ phối trộn bã táo vỏ bưởi đến khả sinh tổng hợp PME từ nấm mốc A.niger 25 4.3 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả sinh tổng hợp PME từ A.niger 28 4.4 Xác định hàm lượng pectin, DE, pH độ ẩm chất lên men sau thời gian lên men 30 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32 5.1 Kết luận .32 5.2 Kiến nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO .33 PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH viii PHỤ LỤC KẾT QUẢ THỐNG KÊ xiii Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Trang v Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Mô hình cấu trúc vách tế bào thực vật bậc cao Hình 2: Cấu tạo phân tử pectin Hình 3: Sơ đồ thủy phân pectin PME Hình 4: Sự phân cắt pectin PME nhóm carboxyl .7 Hình 5: Nấm Aspergillus với khuẩn ty, cọng bào tử, túi thể bình 11 Hình 6: Aspergillus niger .11 Hình 7: Táo ta 16 Hình 8: Bưởi da xanh .17 Hình : Sơ đồ bố trí thí nghiệm 23 Hình 10: Đồ thị biểu diễn hoạt tính PME theo tỷ lệ chất 27 Hình 11: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên men đến hoạt tính PME 30 Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Trang vi Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Hàm lượng pectin mức độ ester hóa pectin số loại trái Bảng 2: Đặc tính sinh hóa số PME tinh khiết từ thực vật Bảng 3: Phương pháp phân tích đo đạc tiêu 21 Bảng Hàm lượng đường, đạm, pectin, DE độ ẩm chất lên men 25 Bảng 5: Hoạt tính enzyme theo tỷ lệ chất 26 Bảng : Hàm lượng pectin, DE theo tỷ lệ chất sau trùng 28 Bảng 7: Ảnh hưởng thời gian lên men đến hoạt tính PME từ A.niger 29 Bảng 8: Hàm lượng pectin, DE, pH độ ẩm chất lên men sau thời gian nuôi cấy 30 Bảng PL1 Bảng tra lượng đường nghịch chuyển xii Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Trang vii Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 CHƯƠNG Trường Đại học Cần Thơ TỔNG QUAN 1.1 Tính cấp thiết đề tài Cùng với phát triển khoa học kỹ thuật ngày đại ngành công nghệ sinh học với nghiên cứu, phát minh mẻ ngày khẳng định vai trò khoa học đời sống Trong đó, công nghệ enzyme lĩnh vực không phần quan trọng công nghệ sinh học Enzyme chất xúc tác cho phản ứng sinh học, chất enzyme protein Từ phát enzyme khả chuyển hóa enzyme, người tăng nhanh trình sản xuất ứng dụng công nghiệp Trong lĩnh vực thực phẩm enzyme ứng dụng rộng rãi Đặc biệt, trình sản xuất rượu vang, nước quả, nước uống không cồn nhóm enzyme pectinase đóng vai trò quan trọng Trong nhóm enzyme pectinase, pectin methylesterase (PME) đảm nhiệm chức thủy phân pectin thành phân tử pectin có độ methoxyl thấp acid pectic (Martin et al., 2004) Enzyme pectin methylesterase ý quan tâm nhằm: hạn chế phá hủy cấu trúc tế bào thực vật, tăng hiệu suất trích ly nước thúc đẩy tách nước từ mô tế bào suốt trình sấy (Van Buren, 1979) Việc gia tăng hoạt động PME trình chế biến rau thực cách kích hoạt nội enzyme điều kiện thích hợp nhiệt độ, áp suất, thời gian, nồng độ muối, (Duvetter, 2007) hay bổ sung chế phẩm PME (Tran Thanh Truc et al., 2008) Đối với loại rau có diện PME nội bào thấp, việc nghiên cứu bổ sung chế phẩm PME biện pháp khả thi Lĩnh vực trích ly ứng dụng PME có nguồn gốc từ thực vật công nghiệp chế biến sản phẩm Việt Nam chưa quan tâm mức Trong lại phát triển mạnh mẽ nhiều quốc gia (Suutarinen et al., 2002) Hiện nay, PME thương mại chưa sản xuất nước ta, việc nhập chế phẩm PME từ nước thường có giá cao Chính thế, nghiên cứu ly trích PME điều kiện Việt Nam cần thiết, cần quan tâm PME sản xuất từ nhiều loại vi khuẩn nấm mốc bao gồm: Aspergillus spp., Botrytis cinerea, Fusarium monilforme, Rhizopus stolonifer, Trichoderma sp… (Polizeli et al.,1991), Aspergillus nguồn chủ yếu (Torres et al.,2005) Aspergillus niger (A.niger) sử dụng phổ biến công nghệ thực phẩm nhiều thập kỷ qua đánh giá an toàn sức khỏe người (Taylor et al.,1979 &Dijck et al., 2003) Thêm vào đó, Aspergillus niger loại nấm mốc có khả phát triển nhanh chóng chất rẻ tiền tiết enzyme môi trường, dễ dàng thu hồi (Oxenboll, 1994) Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiêp SHUD Trang Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Trường Đại học Cần Thơ Trong trường hợp sinh tổng hợp pectin methylesterase (PME) pectinase khác (enzyme thủy phân rau giàu pectin), chất cảm ứng tương thích yếu tố quan trọng, để thu nguồn enzyme dồi từ vi sinh vật, cần phải tiến hành trình nuôi cấy thích hợp với tham gia chất cảm ứng (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Sự diện chất cảm ứng thích hợp môi trường nuôi cấy kìm hãm làm yếu tác dụng kìm toả chất kìm hãm, nhờ thúc đẩy hiệu sinh tổng hợp enzyme Cơ chất biết đến PME pectin, acid pectic, D-galacturonate số nguồn carbohydrate khác (Sajjaanantakul &Pitifer, 1991) Vì thế, theo nghiên cứu Beg et al., 2000 &Martin et al., 2004 ; Joshi et al., 2006 ; Martin et al., 2000 ; Silva et al., 2002 &2005 ; Boccas et al., 1994 nhiều phụ phẩm nông nghiệp giàu pectin sử dụng làm chất cho trình lên men trạng thái rắn (SSF) để sản xuất PME từ Aspergillus niger :bã cam, bã táo, vỏ cam, bã cà phê , bã táo phế phẩm ý Táo (Ziziphus mauritiana) loại trồng phổ biến đồng sông Cửu Long Đây loại xếp hàng đầu việc cung cấp sản xuất pectin (Denes et al., 2000; Marcon et al., 2005), chất cho trình lên men thu nhận nhiều loại enzyme nguồn phân lập, tuyển chọn nấm mốc có khả sinh pectinase nói chung (Martin et al., 2004) Trần Thanh Trúc cộng (2010) cho thấy hiệu nghiên cứu sử dụng bã táo ta vỏ cam sành làm chất cho trình sinh tổng hợp enzyme PME từ Aspergillus niger Ngoài cam bưởi loại trồng nhiều miền Nam, họ citrus với cam Vỏ bưởi chứa hàm lượng pectin cao, thêm vào đó, bề mặt vỏ bưởi môi trường thích hợp cho phát triển số loài nấm mốc, có Aspergillus niger (Lê Thị Thanh Hương & Nguyễn Thùy Châu, 2005) Việc sử dụng phụ phẩm từ táo bưởi cho trình sinh tổng hợp PME từ Aspergillus niger hướng nghiên cứu mới, góp phần tích cực vào việc nâng cao giá trị kinh tế cho số loại ăn đồng sông Cửu Long đồng thời giảm chi phí cho việc sản xuất enzyme Chính thế, sử dụng bã táo ta vỏ bưởi làm chất cho trình lên men sinh tổng hợp PME từ Aspergillus niger đề nghị 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Đề tài thực nhằm mục tiêu xác định tác động thành phần chất, thông qua việc sử dụng phụ phẩm nông nghiệp bã táo ta vỏ bưởi cho trình sinh tổng hợp PME từ Aspergillus niger phương pháp lên men bề mặt môi trường rắn Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiêp SHUD Trang Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 PHỤ LỤC Trường Đại học Cần Thơ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Xác định ẩm phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi Nguyên lý: Dùng nhiệt làm bay hết nước sản phẩm, cân khối lượng sản phẩm trước sấy sau sấy, từ tính % ẩm sản phẩm Tiến hành: Sấy khô cốc nhôm đến khối lượng không đổi cho vào cốc 2g mẫu đem sấy nhiệt độ 100 ÷ 105oC, thời gian tối thiểu Mỗi lần đem mẫu cân phải sử dụng bình hút ẩm để tránh cho mẫu bị hút ẩm trở lại Kết tính theo công thức: X = (G − G ) × 100 (%) G1 − G X: % ẩm có 100g thực phẩm G: Khối lượng cốc không mẫu (g) G1: Khối lượng cốc mẫu trước sấy (g) G2: Khối lượng cốc mẫu sau sấy (g) Xác định đạm tổng số phương pháp Kjedahl Nguyên lý: Nitơ có thành phần hợp chất hữu cơ, tác dụng H2SO4 đậm đặc với diện chất xúc tác thích hợp tất chất hữu bị oxy hoá, NH3 giải phóng liên kết với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 Dùng kiềm mạnh (NaOH, MgO) để đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 hình thành thể tự Định lượng NH3 dung dịch acid có nồng độ xác định H2SO4 đặc Các hợp chất hữu (NH4)2SO4 Tiến hành: Đốt đạm (vô hoá) Cân xác 1g mẫu cho vào bình Kjedahl cho tiếp vào 5g chất xúc tác, 10mL H2SO4 đậm đặc, để nghiêng bình Kjedahl bếp đun từ từ đến thu dung dịch suốt không màu có màu xanh lơ CuSO4 để nguội Cất đạm Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Trang viii Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Trường Đại học Cần Thơ Sau vô hoá mẫu hoàn toàn, cho nước cất vào bình Kjedahl để tráng cho vào bình định mức 100mL, tráng rửa bình Kjeldahl vài lần cho tiếp vào bình định mức Đưa nước bình định mức lên đến 100mL Dùng pipet hút 10mL mẫu cho vào bình cầu hệ thống kéo đạm cho tiếp 10 ÷ 15mL NaOH 40% vào Sau gia nhiệt để cất kéo nước hứng NH3 thoát ra, ngưng tụ bình tam giác 100mL có chứa sẵn 20mL dung dịch acid boric 20g/L thu 100mL dung dịch Định lượng dung dịch hứng H2SO4 0,1N Tính kết quả: Hàm lượng Nitơ tổng số = 0.0014 ⋅ V ⋅ 10 × 100% m V: thể tích H2SO4 0,1N (mL) m: khối lượng nguyên liệu vô vơ hoá (g) 10: hệ số pha loãng 0,0014: số gam nitơ tương ứng với 1mL H2SO4 0,1N Hàm lượng protein tổng số: % protein tổng số = % nitơ tổng số × H H: hệ số protein Đối với thực phẩm có nguồn gốc động vật H = 6,25 Phương pháp phân tích pectin Nguyên tắc Trong môi trường kiềm loãng, pectin hòa tan giải phóng nhóm methoxyl thành rượu methylic acid pectic tự Acid pectic tự môi trường có mặt acid acetic kết hợp với CaCl2 thành dạng muối kết tủa canxi pectate Từ hàm lượng muối kết tủa tính hàm lượng pectin có mẫu phân tích Hóa chất Dung dịch NaOH 0,1N Dung dịch CH3COOH 0,1N CaCl2 2N Dung dịch AgNO3 1% Tiến hành Lấy 20 mL dịch cho vào bình tam giác 250ml, cho thêm 100 mL NaOH 0,1N, để hỗn hợp cho pectin bị xà phòng hóa hoàn toàn thành acid pectic Sau đó, Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Trang ix Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Trường Đại học Cần Thơ thêm vào 50ml dung dịch acid acetic 0,1N để yên phút, thêm 50mL NaCl 1N để Sau đun sôi phút lọc qua giấy lọc sấy khô đến trọng lượng không đổi, rửa kết tủa canxi pectate nước cất nóng không ion Cl- (thử nước rửa với dung dịch nitrate bạc 1%) Sau rửa xong, đặt giấy lọc có kết tủavào cốc, cân sấy 105°C đến trọng lượng không đổi Kết Hàm lượng pectin dịch đươc tính theo công thức sau: Pectin = Trong đó: m1 × 0,92 × 1000 , g/L V hay Pectin (%) = m1 × 0,92 × 100 m m1 - khối lượng cặn pectate calci thu được, g; 0,92 - hệ số chuyển từ calci pectate sang pectin; V - số mL dịch lấy mang phân tích Phương xác định mức độ ester hóa (DE) pectin (theo Food Chemical Codex, FCC, 1981; trích dẫn Singthong et al., 2005) Cách tiến hành Cân 500 g mẫu khô cho vào bình tam giác 250 mL, thêm mL ethanol pha loãng 100 mL nước cất Sau mẫu hòa tan hoàn toàn, thêm giọt phenolphtalein, mẫu chuẩn độ với dung dịch NaOH 0,5 N dung dịch có màu hồng nhạt ghi nhận kết ghi nhận kết Vbđ Sau thêm vào 10 mL NaOH 0,5 N lắc thật mạnh để yên khoảng 15 phút 10 mL HCl thêm tiếp vào lắc màu hồng biến Thêm vào giọt phenolphtalein chuẩn độ với NaOH 0,5 N dung dịch có màu hồng nhạt bền 30 giây Ghi lại kết Vs Tính toán kết % DE = Vs Vbđ + Vs Phương pháp trích ly enzyme Để trích ly enzyme huyền phù sau lên men, bổ sung nước với tỷ lệ nước:hỗn hợp lên men 2:1(v/w) vào bình Tiến hành khuấy gián đoạn huyền phù Sau tiến hành lọc qua giấy lọc thu dịch enzyme Phương pháp phân tích đường Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Trang x Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Trường Đại học Cần Thơ Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng đường nghịch đảo khử đồng dung dịch Fehling thành oxit đồng (Cu2O) có màu đỏ gạch Hóa chất xác định NaOH 30%, 10%, 1N Pb(CH3COO)2 30% Na2SO4 bão hòa 30% Xanh metylen 1% nước Fehling A CuSO4 tinh thể Nước cất đến 69,28 g 1000 ml Fehling B Kalinatritartrate NaOH 100 g Nước cất đến 1000 ml 346 g Giấy quỳ hộp Tiến hành Thủy phân mẫu Cân m gam mẫu cần phân tích 50 mL nước cất mL HCl đậm đặc Thời gian thủy phân mẫu Đường sucrose: phút (2 phút nâng nhiệt, phút giữ nhiệt nhiệt độ 68 ÷ 70°C) Tinh bột, dextrin: Đường glucose: không thủy phân Đường lactose: thủy phân nhiệt độ sôi 30 phút Sau thủy phân làm lạnh Trung hòa với NaOH với nồng độ giảm dần từ 30%, 10%, 1N (dùng phenolphtalein làm chất thị màu) Khử tạp chất mL Pb(CH3COO)2 Để yên phút đến thấy xuất lớp chất lỏng suốt bên lớp cặn coi khử tạp chất xong Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Trang xi Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Trường Đại học Cần Thơ Loại bỏ Pb(CH3COO)2 18 ÷ 20 mL Na2SO4 Na2HPO4 Lắc để kết tủa lắng xuống Nếu có kết tủa Na2HPO4 tác dụng với chì acetate thừa để yên 10 phút, với Na2SO4, lớp nước bên bị đục phải để lâu đến 24 Kiểm tra lại xem kết tủa chì acetate thừa chưa cách cho cẩn thận vài giọt disodium phosphat hay sodium sulfate Nếu không thấy đục, chất lỏng tiếp xúc với coi hết chì acetate Lọc, pha loãng sử dụng Tuỳ hàm luợng đường thực phẩm mà sử dụng HSPL khác nhau.Ví dụ: hàm lượng đường 60% cân gam pha loãng ÷ lần Cho vào becher 5mL Fehling A + 5mL Fehling B + 15 mL dịch lọc Đem đốt bếp chuẩn độ Mỗi lần chuẩn nhỏ 1mL dung dịch đường đến màu đỏ gạch không ánh xanh Thử lại cách nhỏ giọt xanh metylen vào dung dịch sôi thấy màu xanh trở màu đỏ gạch Đọc kết tra bảng tính hàm lượng đường Công thức tính toán: Số tra bảng* HSPL*100 Hàm lượng đường = % (mg/100mL) Khối lượng mẫu *1000 Bảng PL1 Bảng tra lượng đường nghịch chuyển mL dung dịch đường sử dụng 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Lượng đường nghịch chuyển mg/100 mL 336 316 298 282 267 254,5 242,9 231,8 222,2 mL dung dịch đường sử dụng 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Lượng đường nghịch chuyển mg/100 mL 213,3 204,8 197,4 190,4 183,7 177,6 171,7 166,3 161,2 mL dung dịch đường sử dụng 33 34 35 36 37 38 39 40 41 Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Lượng đường nghịch chuyển mg/100 mL 156,06 152,2 147,09 143,9 140,2 136,6 133,3 130,1 127,1 mL dung dịch đường sử dụng 42 43 44 45 46 47 48 49 50 Lượng đường nghịch chuyển mg/100 mL 124,2 121,4 118,7 116,1 113,7 111,4 109,2 107,1 105,1 Trang xii Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 PHỤ LỤC Trường Đại học Cần Thơ KẾT QUẢ THỐNG KÊ Hàm lượng pectin ban đầu tỷ lệ phối trộn Analysis Summary Dependent variable: pectin Factor: ty le Number of observations: 14 Number of levels: Table of Means for pectin by ty le with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error ty le Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -4:06 14.2474 0.287217 13.7672 14.7276 5:05 17.677 0.287217 17.1968 18.1572 6:04 21.1066 0.287217 20.6264 21.5868 7:03 24.5223 0.287217 24.042 25.0025 8:02 27.9179 0.287217 27.4377 28.3981 buoi 0.529 0.287217 0.0487602 1.00924 tao 34.825 0.287217 34.3448 35.3052 -Total 14 20.1179 Table of Means for pectin by ty le with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error ty le Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -4:06 14.2474 0.287217 13.7672 14.7276 5:05 17.677 0.287217 17.1968 18.1572 6:04 21.1066 0.287217 20.6264 21.5868 7:03 24.5223 0.287217 24.042 25.0025 8:02 27.9179 0.287217 27.4377 28.3981 buoi 0.529 0.287217 0.0487602 1.00924 tao 34.825 0.287217 34.3448 35.3052 -Total 14 20.1179 Multiple Range Tests for pectin by ty le -Method: 95.0 percent LSD ty le Count Mean Homogeneous Groups -buoi 0.529 X 4:06 14.2474 X 5:05 17.677 X 6:04 21.1066 X 7:03 24.5223 X 8:02 27.9179 X tao 34.825 X -Contrast Difference +/- Limits -4:06 - 5:05 *-3.4296 0.96048 4:06 - 6:04 *-6.8592 0.96048 4:06 - 7:03 *-10.2749 0.96048 4:06 - 8:02 *-13.6705 0.96048 4:06 - buoi *13.7184 0.96048 4:06 - tao *-20.5776 0.96048 Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Trang xiii Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Trường Đại học Cần Thơ 5:05 - 6:04 *-3.4296 0.96048 5:05 - 7:03 *-6.84525 0.96048 5:05 - 8:02 *-10.2409 0.96048 5:05 - buoi *17.148 0.96048 5:05 - tao *-17.148 0.96048 6:04 - 7:03 *-3.41565 0.96048 6:04 - 8:02 *-6.8113 0.96048 6:04 - buoi *20.5776 0.96048 6:04 - tao *-13.7184 0.96048 7:03 - 8:02 *-3.39565 0.96048 7:03 - buoi *23.9933 0.96048 7:03 - tao *-10.3028 0.96048 8:02 - buoi *27.3889 0.96048 8:02 - tao *-6.9071 0.96048 buoi - tao *-34.296 0.96048 -* denotes a statistically significant difference Hàm lượng DE ban đầu tỷ lệ phối trộn Analysis Summary Dependent variable: DE Factor: ty le Number of observations: 14 Number of levels: ANOVA Table for DE by ty le Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 487.26 81.2101 7.82 0.0079 Within groups 72.7313 10.3902 Total (Corr.) 559.992 13 Table of Means for DE by ty le with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error ty le Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -4:06 76.799 2.27927 72.9879 80.6101 5:05 74.8075 2.27927 70.9964 78.6186 6:04 72.816 2.27927 69.0049 76.6271 7:03 70.8245 2.27927 67.0134 74.6356 8:02 68.833 2.27927 65.0219 72.6441 buoi 84.765 2.27927 80.9539 88.5761 tao 64.85 2.27927 61.0389 68.6611 -Total 14 73.385 Multiple Range Tests for DE by ty le -Method: 95.0 percent LSD ty le Count Mean Homogeneous Groups -tao 64.85 X 8:02 68.833 XX 7:03 70.8245 XXX 6:04 72.816 XX 5:05 74.8075 XX 4:06 76.799 X Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Trang xiv Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Trường Đại học Cần Thơ buoi 84.765 X -Contrast Difference +/- Limits -4:06 - 5:05 1.9915 7.6221 4:06 - 6:04 3.983 7.6221 4:06 - 7:03 5.9745 7.6221 4:06 - 8:02 *7.966 7.6221 4:06 - buoi *-7.966 7.6221 4:06 - tao *11.949 7.6221 5:05 - 6:04 1.9915 7.6221 5:05 - 7:03 3.983 7.6221 5:05 - 8:02 5.9745 7.6221 5:05 - buoi *-9.9575 7.6221 5:05 - tao *9.9575 7.6221 6:04 - 7:03 1.9915 7.6221 6:04 - 8:02 3.983 7.6221 6:04 - buoi *-11.949 7.6221 6:04 - tao *7.966 7.6221 7:03 - 8:02 1.9915 7.6221 7:03 - buoi *-13.9405 7.6221 7:03 - tao 5.9745 7.6221 8:02 - buoi *-15.932 7.6221 8:02 - tao 3.983 7.6221 buoi - tao *19.915 7.6221 -* denotes a statistically significant difference Hoạt tính PME theo tỷ lệ phối trộn bã táo vỏ cam Analysis Summary Dependent variable: Hoat tinh enzyme Factor: Ti le phoi tron Number of observations: 21 Number of levels: ANOVA Table for Hoat tinh enzyme by Ti le phoi tron Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 3397.05 566.175 Within groups 45.5165 14 3.25118 174.14 0.0000 Total (Corr.) 3442.57 20 Table of Means for Hoat tinh enzyme by Ti le phoi tron with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error Ti le phoi tron Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Trang xv Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Trường Đại học Cần Thơ 4:6 20.5667 1.04102 18.9879 22.1455 5:5 41.1433 1.04102 39.5645 42.7221 6:4 29.7333 1.04102 28.1545 31.3121 7:3 25.6667 1.04102 24.0879 27.2455 8:2 22.5 1.04102 20.9212 24.0788 buoi 1.9 1.04102 0.32119 3.47881 tao 4.83333 1.04102 3.25452 6.41214 -Total 21 20.9062 Multiple Range Tests for Hoat tinh enzyme by Ti le phoi tron -Method: 95.0 percent LSD Ti le phoi tronCount Mean Homogeneous Groups -buoi 1.9 X tao 4.83333 X 4:6 20.5667 X 8:2 22.5 X 7:3 25.6667 6:4 29.7333 5:5 41.1433 X X X -Contrast Difference +/- Limits -4:6 - 5:5 *-20.5767 3.15762 4:6 - 6:4 *-9.16667 3.15762 4:6 - 7:3 *-5.1 3.15762 4:6 - 8:2 -1.93333 3.15762 4:6 - buoi *18.6667 3.15762 4:6 - tao *15.7333 3.15762 5:5 - 6:4 *11.41 3.15762 5:5 - 7:3 *15.4767 3.15762 5:5 - 8:2 *18.6433 3.15762 5:5 - buoi *39.2433 3.15762 5:5 - tao *36.31 3.15762 6:4 - 7:3 *4.06667 3.15762 6:4 - 8:2 *7.23333 3.15762 6:4 - buoi *27.8333 3.15762 6:4 - tao *24.9 3.15762 7:3 - 8:2 *3.16667 3.15762 7:3 - buoi *23.7667 3.15762 Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Trang xvi Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Trường Đại học Cần Thơ 7:3 - tao *20.8333 3.15762 8:2 - buoi *20.6 3.15762 8:2 - tao *17.6667 3.15762 buoi - tao -2.93333 3.15762 -* denotes a statistically significant difference Sự thay đổi DE theo thời gian ủ Analysis Summary Dependent variable: DE Factor: Ngay Number of observations: 15 Number of levels: ANOVA Table for DE by Ngay Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1014.99 253.747 Within groups 2.65027 10 0.265027 957.44 0.0000 Total (Corr.) 1017.64 14 Table of Means for DE by Ngay with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error Ngay Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -0 74.8167 0.297224 74.3484 75.285 73.5833 0.297224 73.115 74.0516 3 70.4633 0.297224 69.995 70.9316 57.63 0.297224 57.1617 58.0983 55.3333 0.297224 54.865 55.8016 -Total 15 66.3653 Multiple Range Tests for DE by Ngay Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Trang xvii Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Trường Đại học Cần Thơ -Method: 95.0 percent LSD Ngay Count Mean Homogeneous Groups -5 55.3333 57.63 3 70.4633 73.5833 74.8167 X X X X X -Contrast Difference +/- Limits -0 - *1.23333 0.936575 - *4.35333 0.936575 - *17.1867 0.936575 - *19.4833 0.936575 - *3.12 0.936575 - *15.9533 0.936575 - *18.25 0.936575 - *12.8333 0.936575 - *15.13 0.936575 - *2.29667 0.936575 -* denotes a statistically significant difference Sự thay đổi pectin theo thời gian ủ Analysis Summary Dependent variable: Pectin Factor: Ngay Number of observations: 15 Number of levels: ANOVA Table for Pectin by Ngay Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 588.483 147.121 Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD 3012.30 0.0000 Trang xviii Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Within groups 0.4884 Trường Đại học Cần Thơ 10 0.04884 Total (Corr.) 588.972 14 Table of Means for Pectin by Ngay with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error Ngay Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -0 17.6867 0.127593 17.4856 17.8877 3 5.61333 0.127593 5.41231 5.81436 3.78333 0.127593 3.58231 3.98436 1.66 0.127593 1.45897 1.86103 0.0 0.127593 -0.201027 0.201027 -Total 15 5.74867 Multiple Range Tests for Pectin by Ngay -Method: 95.0 percent LSD Ngay Count Mean Homogeneous Groups -5 0.0 1.66 3 3.78333 5.61333 17.6867 X X X X X -Contrast Difference +/- Limits -0 - *12.0733 0.402055 - *13.9033 0.402055 - *16.0267 0.402055 - *17.6867 0.402055 - *1.83 0.402055 - *3.95333 0.402055 - *5.61333 0.402055 - *2.12333 0.402055 - *3.78333 0.402055 - *1.66 0.402055 Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Trang xix Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Trường Đại học Cần Thơ * denotes a statistically significant difference Sự thay đổi pH theo thời gian ủ Analysis Summary Dependent variable: pH Factor: Ngay Number of observations: 15 Number of levels: ANOVA Table for pH by Ngay Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups Within groups 3.51863 0.879657 0.276667 10 0.0276667 31.79 0.0000 Total (Corr.) 3.79529 14 Table of Means for pH by Ngay with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error Ngay Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -0 4.16333 0.0960324 4.01203 4.31464 3.28333 0.0960324 3.13203 3.43464 3 2.96 0.0960324 2.8087 3.1113 2.92667 0.0960324 2.77536 3.07797 2.86333 0.0960324 2.71203 3.01464 -Total 15 3.23933 Multiple Range Tests for pH by Ngay -Method: 95.0 percent LSD Ngay Count Mean Homogeneous Groups Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Trang xx Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Trường Đại học Cần Thơ 2.86333 X 2.92667 X 3 2.96 X 3.28333 4.16333 X X -Contrast Difference +/- Limits -0 - *0.88 0.302605 - *1.20333 0.302605 - *1.23667 0.302605 - *1.3 0.302605 - *0.323333 0.302605 - *0.356667 0.302605 - *0.42 0.302605 - 0.0333333 0.302605 - 0.0966667 0.302605 - 0.0633333 0.302605 -* denotes a statistically significant difference Sự thay đổi độ ẩm theo thời gian ủ Analysis Summary Dependent variable: am Factor: Number of observations: 15 Number of levels: ANOVA Table for am by Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 192.86 48.215 Within groups 6.43247 10 0.643247 74.96 0.0000 Total (Corr.) 199.292 14 Table of Means for am by Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Trang xxi Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 2010 Trường Đại học Cần Thơ with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -0 60.0667 0.46305 59.3371 60.7962 65.1467 0.46305 64.4171 65.8762 3 68.5367 0.46305 67.8071 69.2662 69.3 0.46305 68.5704 70.0296 69.5133 0.46305 68.7838 70.2429 -Total 15 66.5127 Multiple Range Tests for am by -Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -0 60.0667 X 65.1467 3 68.5367 X 69.3 X 69.5133 X X -Contrast Difference +/- Limits -0 - *-5.08 1.4591 - *-8.47 1.4591 - *-9.23333 1.4591 - *-9.44667 1.4591 - *-3.39 1.4591 - *-4.15333 1.4591 - *-4.36667 1.4591 - -0.763333 1.4591 - -0.976667 1.4591 - -0.213333 1.4591 -* denotes a statistically significant difference Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp SHUD Trang xxii [...]... chất và điều kiện lên men là những nhân tố thiết yếu, có ảnh hưởng sâu sắc đến hiệu quả của quá trình nuôi cấy, sinh tổng hợp enzyme mong muốn (Rao, 2005) 2.5 Các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp PME từ A .niger 2.5.1 Vai trò của cơ chất trong quá trình lên men sinh enzyme PME Thành phần môi trường là yếu tố cơ bản nhất quyết định khả năng sinh PME cũng như các enzyme khác từ vi sinh vật,... từng cơ chất chuyên biệt và điều kiện nuôi cấy cụ thể 2.5.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hiệu quả sinh tổng hợp PME Bên cạnh ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy, các điều kiện môi trường như độ ẩm, pH, nhiệt độ… Tùy thuộc vào đặc điểm của chủng vi sinh vật nuôi cấy, phương thức lên men và tính chất enzyme mà điều kiện tối thích cho quá trình lên men sinh tổng hợp enzyme có thay đổi khác... cho sự phát triển của A niger sinh PME đồng thời các nghiên cứu của ông về việc sản xuất pectin methylesterase (PME) từ Aspergillus niger trên cơ chất bã táo cho thấy, nhiệt độ ủ 25oC, điều kiện pH phản ứng 4,0 và thời gian ủ là 96 giờ là điều kiện tối ưu cho việc lên men sinh PME ở môi trường rắn (SSF) Gần đây, ảnh hưởng của loại môi trường lên men khác nhau đến hiệu quả sinh PME từ nấm mốc cũng được... thủy phân từ A.awamori sử dụng cơ chất lên men là hỗn hợp tỉ lệ 1:1 (w/v) của bã nho và vỏ cam Dựa trên các nghiên cứu có liên quan đã được khảo sát và điều kiện thực tế, việc đánh giá ảnh hưởng của điều kiện lên men ( thông qua hàm lượng pectin, DE, đường hòa tan, khoáng dinh dưỡng, ẩm, loại dung dịch đệm, pH, thời gian ủ) của quá trình nuôi cấy đến hiệu quả sinh enzyme pectin methylesterase từ Aspergillus. .. thành phần cơ chất giàu pectin và điều kiện môi trường là yếu tố chi phối mạnh đến hiệu quả lên men sinh PME từ vi sinh vật Với thành phần pectin trong hạt hướng dương là 21,36%, Patil và Dayanand (2006) đã xác nhận tính khả thi của việc sử dụng hạt hướng dương trong sản xuất PME từ Aspergillus niger cho cả hai trường hợp lên men rắn và lên men chìm Joshi et al., (2006) sử dụng bã táo (apple pomace)... ra, A .niger còn được Viện nghiên cứu thực phẩm và thuốc của Mỹ (FDA) đã chứng nhận sản phẩm an toàn (GRAS) Chính vì thế quá trình sinh tổng hợp enzyme PME từ nguồn nấm mốc Aspergillus niger được ưu tiên chọn lựa Hiệu quả của quá trình lên men sinh PME còn phụ thuộc vào rất nhiều thông số khác như thành phần cơ chất, các vi chất dinh dưỡng và điều kiện lên men Khi đã tuyển chọn được chủng vi sinh vật... 2006) có hàm lượng pectin cao (15 ÷ 25%) được biết đến như nguồn cơ chất thích hợp cho việc sản xuất pectinase cũng như PME nguồn gốc vi sinh vật Ngoài ra, độ methoxyl hóa cao (65 – 75% DE) của pectin trong phụ phẩm nông nghiệp chính là điều kiện thuận lợi cho hoạt động của PME (Jayani et al., 2005) Một ưu điểm khác của việc sử dụng phụ phẩm nông nghiệp làm cơ chất cho quá trình nuôi cấy sinh enzyme PME... DE và hàm lượng pectin của cơ chất này cao Đây chính là thông tin hữu hiệu cho quá trình sinh PME từ nấm mốc A .niger Kết quả cho phép nghĩ đến sự kết hợp của bã táo và vỏ bưởi nhằm cải thiện thành phần môi trường lên men 4.2 Ảnh của tỷ lệ phối trộn của bã táo và vỏ bưởi đến khả năng sinh tổng hợp PME từ nấm mốc A .niger Thành phần môi trường là yếu tố cơ bản nhất quyết định khả năng sinh PME cũng như... ứng thích hợp nhất cho A .niger phát triển và sinh tổng hợp PME Việc gia tăng nồng độ cơ chất pectin có hiệu quả rất tích cực trong việc đẩy nhanh tốc độ lên men và gia tăng hoạt tính enzyme pectin esterase (Maldonad & Callieri, 2005) Bên cạnh việc gia tăng hàm lượng pectin, mức độ este hóa cao của pectin cũng là một chỉ số rất quan trọng ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt động sinh tổng hợp PME của A .niger (Grebechova,... năng sinh PME 4.3 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp PME từ A .niger Quá trình sinh tổng hợp enzyme phụ thuộc rất lớn vào sự phát triển của tế bào nấm mốc nên thời gian nuôi cấy hay thời điểm thu nhận chế phẩm enzyme là một trong những nhân tố quan trọng quyết định hoạt tính của enzyme cao hay thấp Do đó, thí nghiệm được tiến hành để khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy nấm mốc A.niger ... thích hợp thời gian lên men yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả sinh PME 4.3 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả sinh tổng hợp PME từ A .niger Quá trình sinh tổng hợp enzyme phụ thuộc lớn vào phát... sau lên men Xác định ảnh hưởng yếu tố khác pH môi trường lên men, dung dịch trích ly thích hợp cho hiệu sinh enzyme đạt cao Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp pectin methylesterase từ Aspergillus. .. luận Việc sử dụng chất từ phụ phẩm nông nghiệp bã táo vỏ bưởi làm chất lên men điều kiện thuận lợi cho việc sinh enzyme PME từ Aspergillus niger Trong trình lên men sinh PME, hàm lượng pectin DE