TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM HUỲNH NGỌC DUY MSSV: 2071800 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TINH SẠCH SƠ BỘ VÀ BẢO QUẢN LẠNH ĐÔNG ENZYME CELLULASE TỪ TRICHODERMA SP Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Cần Thơ, 2011 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TINH SẠCH SƠ BỘ VÀ BẢO QUẢN LẠNH ĐÔNG ENZYME CELLULASE TỪ TRICHODERMA SP Giáo viên hướng dẫn Ths Nguyễn Thị Thu Thủy Sinh viên thực Huỳnh Ngọc Duy MSSV: 2071800 Lớp: CNTP 33 Cần Thơ, 2011 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM TẠ Quá trình thực luận văn tốt nghiệp hội giúp cho sinh viên vận dụng kiến thức học để thực nghiên cứu khoa học cho riêng Đây đồng thời thách thức lớn cho sinh viên để rèn luyện kĩ làm việc cách độc lập khoa học Sau ba tháng thực đề tài luận văn tốt nghiệp, gặp khó khăn, cố gắng thân giúp đỡ động viên kịp thời thầy cô, gia đình bạn bè giúp em hoàn thành trình nghiên cứu đạt kết mong muốn Em xin chân thành gởi lời cảm ơn đến: Cô Nguyễn Thị Thu Thủy, người nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức chuyên môn động viên em suốt trình thực luận văn Em xin cảm ơn tất thầy cô môn Công nghệ thực phẩm truyền đạt kiến thức quý báu thời gian em học trường Con xin cảm ơn ba, mẹ tạo điều kiện để học tập nghiên cứu động viên lúc khó khăn Tôi xin cảm ơn bạn chị phòng thí nghiệm giúp đỡ trình thực luận văn Cần Thơ, ngày tháng năm 2011 Sinh viên thực Huỳnh Ngọc Duy Ngành Công nghệ thực phẩm Trang i Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Các chể phẩm enzyme thô thu thường lẫn nhiều tạp chất nên hiệu sử dụng không cao Vì đề tài tiến hành nhằm tinh sơ phần chế phẩm enzymen cellulase thô từ Trichoderma sp nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho việc cho việc sử dụng bước Ngoài ra, đề tài khảo sát khả bảo quản lạnh đông chế phẩm enzyme sau tinh sơ Kết thí nghiệm cho thấy, kết tủa enzyme celulase thô từ Trichoderma sp ethanol với tỷ lệ ethanol dịch chiết enzyme thô 3:1 (w/v) tốt nhất, thể hoạt tính riêng 0,110 U/mgprotein,hiệu suất thu hồi đạt 46,414% độ tinh tăng gấp 4,593 lần so với mẫu enzyme thô Sau tinh sơ bộ, enzyme bảo quản lạnh đông nhiệt độ -20oC Ở nhiệt độ này, sau tuần bảo quản, hoạt tính enzyme gây tủa muối (NH4)2SO4 có giảm hoạt tính nhẹ so với hoạt tính enzyme gây tủa ethanol (hoạt tính riêng giảm từ 0,065 U/mgprotein xuống 0,046 U/mgprotein , giảm khoảng 1,4 lần), phần enzyme tinh sơ ethanol hoạt tính riêng thay đổi không đáng kể sau tuần (hoạt tính riêng giảm từ 0,070 U/mgprotein xuống 0,055 U/mgprotein , giảm khoảng 1,27 lần) Ngành Công nghệ thực phẩm Trang ii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ ii TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược enzyme cellulase 2.1.1 Phân loại enzyme cellulase 2.1.2 Một số đặc tính cellulase từ vi khuẩn 2.1.3 Cơ chế tác dụng enzyme cellulase 2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme 2.1.5 Trung tâm hoạt động enzyme 10 2.1.6 Ứng dụng enzyme cellulase 10 2.2 Sản xuất enzyme cellulase từ vi sinh vật 11 2.3 Tinh chế enzyme cellulase 13 2.3.1 Kết tủa muối ammonium sulfate 13 2.3.2 Kết tủa dung môi hữu 14 2.4 Ly tâm 14 2.5 Một số nghiên cứu có liên quan 14 2.5.1 Nước 14 2.5.2 Trong nước 15 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Phương tiện 16 3.1.1 Thời gian địa điểm 16 3.1.2 Nguyên liệu 16 3.1.3 Thiết bị hóa chất 16 3.2 Phương pháp nghiên cứu 17 3.3 Nội dung bố trí thí nghiệm 17 3.3.1 Thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng loại hóa chất tỷ lệ sử dụng đến khả kết tủa enzyme cellulase từ Trichoderma sp 17 Ngành Công nghệ thực phẩm Trang iii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ 3.3.2 Thí nghiệm Khảo sát biến đổi hoạt tính hàm lượng protein theo thời gian bảo quản nhiệt độ lạnh đông 18 3.3 Phương pháp thu thập xử lý số liệu 18 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 19 4.1 Ảnh hưởng loại hóa chất tỷ lệ sử dụng đến khả kết tủa enzyme cellulase từ Trichoderma sp 19 4.1.1 Đánh giá khả tinh enzyme cellulase thô từ Trichoderma sp ammonium sulfate 19 4.1.2 Đánh giá khả tinh enzyme cellulase thô từ Trichoderma sp ethanol 21 4.3 So sánh hiệu tinh enzyme cellulase thô theo hai phương pháp kết tủa protein khác 22 4.4 Ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản đến ổn định enzyme cellulase sau bước tinh sơ 23 4.4.1 Sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase tinh sơ phương pháp kết tủa với ammonium sulfate theo thời gian bảo quản 23 4.4.2 Sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase tinh sơ phương pháp kết tủa với ethanol theo thời gian bảo quản 23 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 25 5.1 Kết luận 25 5.2 Đề nghị 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO 26 PHỤ LỤC vii Ngành Công nghệ thực phẩm Trang iv Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Một số loại vi sinh vật để sản xuất enzyme cellulase 12 Bảng 2: Hiệu tinh enzyme cellulase phương pháp kết tủa với (NH4)2SO4 20 Bảng 3: Hiệu tinh enzyme cellulase phương pháp kết tủa với ethanol 21 Bảng 4: Kết so sánh hai phương pháp kết tủa khác 22 Bảng 5: Sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase tinh sơ phương pháp kết tủa với ammonium sulfate theo thời gian bảo quản 23 Bảng 6: Sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase tinh sơ phương pháp kết tủa với ethanol theo thời gian bảo quản 24 Ngành Công nghệ thực phẩm Trang v Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Trang Hình Sơ đồ chế tác dụng phức hệ cellulase lên mạch cellulose Hình Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến vận tốc phản ứng Hình Ảnh hưởng nồng độ chất đến vận tốc phản ứng enzyme Hình Ảnh hưởng nhiệt độ đến tốc độ phản ứng enzyme Hình Ảnh hưởng pH đến tốc độ phản ứng enzyme Ngành Công nghệ thực phẩm Trang vi Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, công nghệ enzyme phát triển nhanh sử dụng rộng rãi ngành công nghiệp khác Bởi chất xúc tác đặc hiệu, có tính ưu việt chất xúc tác khác Ngành công nghiệp enzyme khai thác enzyme từ động vật, thực vật mà tiến thêm bước xa khai thác chúng từ nhiều nguồn vi sinh vật khác Bên cạnh đó, vi sinh vật sinh vật sử dụng nguồn sản xuất enzyme quy mô công nghiệp, vi sinh vật có tốc độ sinh sản nhanh, cho enzyme có hoạt tính cao, nguồn nguyên liệu ban đầu rẻ tiền dễ tìm Nguồn enzyme từ động vật thực vật khó triển khai quy mô công nghiệp hạn chế sinh lí, kĩ thuật, giá thành… Trong ngành công nghiệp nay, enzyme sử dụng nhiều như: amylase, pectinase, protease, cellulase, polyphenoloxydase,…Trong đó, enzyme cellulase sử dụng rộng rãi trong: công nghiệp thực phẩm, sản xuất thức ăn gia súc, sản xuất giấy, xử lí môi trường,… Enzyme sản xuất từ nhiều nguồn vi sinh vật khác như: nấm mốc (Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Penicillium spp,…), vi khuẩn (Acetobacter, Bacillus,…), xạ khuẩn (Actinomyces spp, Thermomonospora,…) (Nguyễn Đức Lượng Nguyễn Hữu Phúc, 1996) Và enzyme nghiên cứu ứng dụng chậm nhiều so với enzyme amylase protease (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Các ngành công nghiệp nước ta phát triển nhanh nên nhu cầu sử dụng enzyme cao Nhưng công nghệ sản xuất nước chưa đáp ứng nhu cầu nên phải nhập nguồn enzyme từ nước với giá thành cao gây không khó khăn cho việc sử dụng rộng rãi Trên sở đó, tiến hành nghiên cứu khả tinh sơ enzyme cellulase tổng hợp từ Trichoderma sp muối ammonium sulfate cồn nhằm loại bỏ tạp chất có lẫn chế phẩm enzyme thô để tăng hoạt tính, hiệu sử dụng tính kinh tế 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu đề tài nghiên cứu vấn đề sau: - Khảo sát nồng độ muối ammonium sulfate bão hòa tỉ lệ ethanol thích hợp cho việc tinh sơ enzyme cellulase với hoạt tính cao - Xác định thay đổi hoạt tính, hàm lượng protein enzyme cellulase điều kiện bảo quản lạnh đông theo thời gian Ngành Công nghệ thực phẩm Trang Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược enzyme cellulase 2.1.1 Phân loại enzyme cellulase Enzyme cellulase tham gia phản ứng phân hủy cellulose Phức hệ enzyme nhà khoa học phân thành ba nhóm chủ yếu sau: - Endoglucanase (EG), tên theo hệ thống danh pháp dành cho enzyme là: Endo-1,4β -D-glucan-4 glucanohyrolase, EC 3.2.14 Enzyme tham gia phân giải liên kết β -1,4 glucoside cellulose, lichenin β -D-glucan Sản phẩm qua trình phân giải là: cellodextrin, cellobiose, glucose Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình, tác động yếu đến cellulose kết tinh Enzyme có số tên khác như: endocelulase, endo 1,4- β -glucanase, CMC-ase Cxcellulase - Cellobiohydrolase (CBH), tên theo hệ thống danh pháp dành cho enzyme là:1,4β -D-glucan cellobiohydrolase, EC 3.2.1.91 Enzyme phân cắt liên kết β -1,4glucoside đầu khử đầu không khử chuỗi cellulose cellodextrin để giải phóng cellobiose Enzyme khả phân hủy cellulose dạng kết tinh mà làm thay đổi tính chất hóa lí chúng, giúp cho endocellulase bị phân hủy Enzyme có số tên khác như: exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase - β -glucosidase (BGL), tên theo hệ thống danh pháp dành cho enzyme là: β -Dglucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.21 Enzyme tham gia phản ứng phân hủy cellobiose cellodextrin phân tử thấp tạo thành glucose, chúng khả phân hủy cellulose nguyên thủy Nó có tên cellobiase (Nguyễn Đức Lượng, 2004) 2.1.2 Một số đặc tính cellulase từ vi khuẩn (i) Endoglucanase (EG): EG tổng hợp Trichoderma reesei Các nhà khoa học chia chúng thành hai loại EG EG - EG chứa 459 amino acid, có trọng lượng phân tử 48,212 kD - EG chứa 418 amino acid, có trọng lượng phân tử 42,2 kD Các enzyme hoạt động nhiệt độ cao Ngoài endoglucanase tìm thấy Clostridium thermocellum, Cellulomonas fimi vi sinh vật Ngành Công nghệ thực phẩm Trang Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ 1.4 Xây dựng đường chuẩn glucose Cân xác g glucose (dạng khô không ngậm nước) hòa tan với 200ml nước cất Sử dụng bình định mức Hút 0, 2, 4, 6, 8, 10 ml dung dịch vào bình định mức 50 ml, thêm nước vạch định mức Các dung dịch pha có nồng độ glucose là: 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; mg/ml Thực phản ứng Vẽ đồ thị biểu thị biến thiên nồng độ đường độ hấp thu OD bước sóng 575 nm Dựa vào đường chuẩn glucose xác định hàm lượng đường khử sinh hoạt tính enzyme 1.5 Tính toán kết Đơn vị hoạt tính enzyme ml enzyme tính theo công thức:  X * Vhh  1000  * U =   T * VE  180 Trong đó: U: hoạt tính enzyme (U/ml) X: hàm lượng glucose dung dịch đo (mg/ml) Vhh: thể tích hỗn hợp ( enzyme, CMC, đệm natri acetate, ml) T: thời gian phản ứng (30 phút) VE: thể tích enzyme (1 ml) 1000: đổi từ mM µM đường khử 180: khối lượng phân tử glucose Đường chuẩn đường khử Nồng độ glucose 0,2 0,4 0,6 0,8 OD 0,245 0,464 0,689 0,928 1,147 Ngành Công nghệ thực phẩm Trang viii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ ĐƯỜNG CHUẨN ĐƯỜNG KHỬ 1.4 y = 1.1534x 1.2 R = 0.9997 OD 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 Nồng độ glucose mg/ml Định lượng protein phương pháp Biuret 2.1 Nguyên tắc Trong môi trường kiềm, hợp chất có chứa nhóm –CO-NH-, -CS-NH-, C(NH)NH2 có phản ứng với Cu2+ tạo hợp chất phức màu tím Trong phương pháp này, protein cho phản ứng với Cu2+ môi trường kiềm để tạo phức màu tím; cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein dung dịch Do ta định lượng protein theo phương pháp so màu bước sóng 550nm 2.2 Chuẩn bị mẫu Dung dịch protein chuẩn Dung dịch albumin huyết bò (BSA – bovine serum albumin) 20 mg/ml pha dung dịch NaCl 0,9% Dung dịch thuốc thử Biuret Hòa tan 1,5g CuSO4.5H2O 6g K, Na tartrate với nước cất cốc thủy tinh 50 mL Riêng cốc có K, Na tartrate ta ngâm nước nóng, kết hợp với khuấy trộn K, Na tartrate tan nhanh so với nước nhiệt độ phòng Hòa tan 30g NaOH với nước cất cốc 200 ml NaOH tan hết Tiếp theo ta để nguội đến nhiệt độ phòng Sau đó, cho tất vào bình định mức 1000 ml, thêm nước vạch định mức Ngành Công nghệ thực phẩm Trang ix Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ 2.3 Tiến hành Chuẩn bị dãy dung dịch protein chuẩn Chuẩn bị dãy dung dịch protein chuẩn có nồng độ tăng dần từ – 20 mg/ml từ dung dịch protein gốc (BSA 20 mg/ml) Ống nghiệm Nồng độ dung dịch (mg/ml) 12 16 20 Thể tích dung dịch protein chuẩn ( µ l) 100 200 300 400 500 500 400 300 200 100 Thể tích nước cất (ml) 1 1 1 Thuốc thử Biuret (ml) 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 Thể tích dung dịch NaCl 0,9% ( µ l) Chuẩn bị dung dịch phân tích Cho vào ống nghiệm: 500 µ l dung dịch phân tích (dung dịch enzyme) ml nước cất 3,5 ml thuốc thử Biret Sau chuẩn bị dung dịch trên, lắc đều, để yên 20 phút Quan sát dãy dung dịch đo độ hấp thụ bước sóng 550 nm Vẽ đồ thị biểu diễn phụ thuộc độ hấp thụ A vào nồng độ dung dịch protein chuẩn Từ giá trị độ hấp thụ dung dịch phân tích, suy nồng độ protein dung dịch mẫu dựa vào đường chuẩn 2.4 Tính toán kết Từ kết đọc máy, ta xác định nồng độ protein dung dịch enzyme dung dịch phân tích dựa vào đường chuẩn: X mg/ml Ngành Công nghệ thực phẩm Trang x Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ Đường chuẩn protein Hàm lượng protein 12 16 20 OD 0,09 0,193 0,281 0,363 0,445 ĐƯỜNG CHUẨN PROTEIN y = 0.0227x 0.5 R = 0.998 0.45 0.4 0.35 OD 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 10 15 20 25 Hàm lượng protein mg/ml Ngành Công nghệ thực phẩm Trang xi Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ Phụ lục Phương pháp pha dung dịch đệm Natri acetate Enzyme sau kết tủa hòa tan dung dịch đệm Natri acetate 50 mM (pH 5) Cách pha: Cân 6,8 g natri acetate khan cho vào bình định mức 1000 ml, cho nước đến đủ 1000 ml, khuấy cho tan hết Sau lấy 352 ml Hút 2,857 ml dung dịch acid acetic đậm đặc vào bình định mức 1000 ml, dẫn nước vào cho đủ 1000 ml, khuấy cho tan hết Sau lấy 148 ml Cho 352 ml dung dịch natri acetate 148 ml dung dịch acid acetic vào bình định mức 1000 ml, cho nước đến vạch 1000 ml Ta dung dịch đệm natri acetate 50 mM (pH 5) Phụ lục Các công thức tính toán Chỉ tiêu Hoạt tính cellulase (U/mL) Hàm lượng protein tổng (mg/mL) Hiệu suất thu hồi cellulase Y% Phương pháp Phương pháp Miller , sử dụng DNS làm thuốc thử đo độ hấp thụ bước sóng 575nm Phương pháp Biuret, sử dụng bovine serum albumin (BSA) làm đường chuẩn đo bước sóng 550 nm TA Y (%) = × 100 TA0 Hoạt tính riêng S (U/mg) TA0: tổng hoạt tính cellulase có mẫu thô (U) TA1: tổng hoạt tính cellulase có mẫu sau trích ly (U) A S= C protein Độ tinh P A: hoạt tính cellulase (U/mL) Cprotein: nồng độ protein mẫu tương ứng (mg/ml) S P = S0 S1: hoạt tính riêng cellulase sau tinh (U/mg) S0: hoạt tính riêng cellulase mẫu thô (U/mg) Ngành Công nghệ thực phẩm Trang xii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ Phụ lục Kết phân tích thống kê Tinh muối (NH4)2SO4 Hoạt tính riêng Bảng phân tích phương sai ANOVA Table for Hoat tinh rieng by Nong Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.0115739 10 0.00115739 161.16 0.0000 Within groups 0.000158 220.00000718182 Total (Corr.) 0.0117319 32 Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Hoat tinh rieng by Nong -Method: 95.0 percent LSD Nong Count Mean Homogeneous Groups -0 0.0236667 X 30 0.04 X 35 0.0506667 X 75 0.0593333 X 40 0.0606667 XX 70 0.061 XX 65 0.065 XX 45 0.066 X 50 0.073 X 60 0.0763333 X 55 0.0996667 X -Contrast Difference +/- Limits -0 - 30 *-0.0163333 0.0045379 - 35 *-0.027 0.0045379 - 40 *-0.037 0.0045379 - 45 *-0.0423333 0.0045379 - 50 *-0.0493333 0.0045379 - 55 *-0.076 0.0045379 - 60 *-0.0526667 0.0045379 - 65 *-0.0413333 0.0045379 - 70 *-0.0373333 0.0045379 - 75 *-0.0356667 0.0045379 30 - 35 *-0.0106667 0.0045379 30 - 40 *-0.0206667 0.0045379 30 - 45 *-0.026 0.0045379 30 - 50 *-0.033 0.0045379 30 - 55 *-0.0596667 0.0045379 30 - 60 *-0.0363333 0.0045379 30 - 65 *-0.025 0.0045379 30 - 70 *-0.021 0.0045379 30 - 75 *-0.0193333 0.0045379 35 - 40 *-0.01 0.0045379 35 - 45 *-0.0153333 0.0045379 35 - 50 *-0.0223333 0.0045379 35 - 55 *-0.049 0.0045379 35 - 60 *-0.0256667 0.0045379 35 - 65 *-0.0143333 0.0045379 35 - 70 *-0.0103333 0.0045379 35 - 75 *-0.00866667 0.0045379 40 - 45 *-0.00533333 0.0045379 40 - 50 *-0.0123333 0.0045379 40 - 55 *-0.039 0.0045379 40 - 60 *-0.0156667 0.0045379 40 - 65 -0.00433333 0.0045379 40 - 70 -0.000333333 0.0045379 40 - 75 0.00133333 0.0045379 Ngành Công nghệ thực phẩm Trang xiii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ 45 - 50 *-0.007 0.0045379 45 - 55 *-0.0336667 0.0045379 45 - 60 *-0.0103333 0.0045379 45 - 65 0.001 0.0045379 45 - 70 *0.005 0.0045379 45 - 75 *0.00666667 0.0045379 50 - 55 *-0.0266667 0.0045379 50 - 60 -0.00333333 0.0045379 50 - 65 *0.008 0.0045379 50 - 70 *0.012 0.0045379 50 - 75 *0.0136667 0.0045379 55 - 60 *0.0233333 0.0045379 55 - 65 *0.0346667 0.0045379 55 - 70 *0.0386667 0.0045379 55 - 75 *0.0403333 0.0045379 60 - 65 *0.0113333 0.0045379 60 - 70 *0.0153333 0.0045379 60 - 75 *0.017 0.0045379 65 - 70 0.004 0.0045379 65 - 75 *0.00566667 0.0045379 70 - 75 0.00166667 0.0045379 -* denotes a statistically significant difference Hiệu suất thu hồi ANOVA Table for Hieu suat thu hoi by Nong Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 15940.7 10 1594.07 60296.15 0.0000 Within groups 0.581622 22 0.0264374 Total (Corr.) 15941.3 32 Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Hieu suat thu hoi by Nong -Method: 95.0 percent LSD Nong Count Mean Homogeneous Groups -75 17.8017 X 30 20.5123 X 70 20.6513 X 65 23.4643 X 35 25.1533 X 40 27.5937 X 45 29.0673 X 60 29.7627 X 50 30.8407 X 55 41.596 X 100.0 X -Contrast Difference +/- Limits -0 - 30 *79.4877 0.275326 - 35 *74.8467 0.275326 - 40 *72.4063 0.275326 - 45 *70.9327 0.275326 - 50 *69.1593 0.275326 - 55 *58.404 0.275326 - 60 *70.2373 0.275326 - 65 *76.5357 0.275326 - 70 *79.3487 0.275326 - 75 *82.1983 0.275326 Ngành Công nghệ thực phẩm Trang xiv Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ 30 - 35 *-4.641 0.275326 30 - 40 *-7.08133 0.275326 30 - 45 *-8.555 0.275326 30 - 50 *-10.3283 0.275326 30 - 55 *-21.0837 0.275326 30 - 60 *-9.25033 0.275326 30 - 65 *-2.952 0.275326 30 - 70 -0.139 0.275326 30 - 75 *2.71067 0.275326 35 - 40 *-2.44033 0.275326 35 - 45 *-3.914 0.275326 35 - 50 *-5.68733 0.275326 35 - 55 *-16.4427 0.275326 35 - 60 *-4.60933 0.275326 35 - 65 *1.689 0.275326 35 - 70 *4.502 0.275326 35 - 75 *7.35167 0.275326 40 - 45 *-1.47367 0.275326 40 - 50 *-3.247 0.275326 40 - 55 *-14.0023 0.275326 40 - 60 *-2.169 0.275326 40 - 65 *4.12933 0.275326 40 - 70 *6.94233 0.275326 40 - 75 *9.792 0.275326 45 - 50 *-1.77333 0.275326 45 - 55 *-12.5287 0.275326 45 - 60 *-0.695333 0.275326 45 - 65 *5.603 0.275326 45 - 70 *8.416 0.275326 45 - 75 *11.2657 0.275326 50 - 55 *-10.7553 0.275326 50 - 60 *1.078 0.275326 50 - 65 *7.37633 0.275326 50 - 70 *10.1893 0.275326 50 - 75 *13.039 0.275326 55 - 60 *11.8333 0.275326 55 - 65 *18.1317 0.275326 55 - 70 *20.9447 0.275326 55 - 75 *23.7943 0.275326 60 - 65 *6.29833 0.275326 60 - 70 *9.11133 0.275326 60 - 75 *11.961 0.275326 65 - 70 *2.813 0.275326 65 - 75 *5.66267 0.275326 70 - 75 *2.84967 0.275326 -* denotes a statistically significant difference Độ tinh ANOVA Table for Do tinh sach by Nong Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 20.2225 10 2.02225 227.76 0.0000 Within groups 0.195338 22 0.008879 Total (Corr.) 20.4178 32 Bảng kiểm định LSD Ngành Công nghệ thực phẩm Trang xv Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ Multiple Range Tests for Do tinh sach by Nong -Method: 95.0 percent LSD Nong Count Mean Homogeneous Groups -0 1.0 X 30 1.66367 X 35 2.11967 X 75 2.47 X 40 2.51433 X 70 2.545 XX 65 2.702 XX 45 2.73633 X 50 3.04467 X 60 3.18367 X 55 4.18 X -Contrast Difference +/- Limits -0 - 30 *-0.663667 0.159558 - 35 *-1.11967 0.159558 - 40 *-1.51433 0.159558 - 45 *-1.73633 0.159558 - 50 *-2.04467 0.159558 - 55 *-3.18 0.159558 - 60 *-2.18367 0.159558 - 65 *-1.702 0.159558 - 70 *-1.545 0.159558 - 75 *-1.47 0.159558 30 - 35 *-0.456 0.159558 30 - 40 *-0.850667 0.159558 30 - 45 *-1.07267 0.159558 30 - 50 *-1.381 0.159558 30 - 55 *-2.51633 0.159558 30 - 60 *-1.52 0.159558 30 - 65 *-1.03833 0.159558 30 - 70 *-0.881333 0.159558 30 - 75 *-0.806333 0.159558 35 - 40 *-0.394667 0.159558 35 - 45 *-0.616667 0.159558 35 - 50 *-0.925 0.159558 35 - 55 *-2.06033 0.159558 35 - 60 *-1.064 0.159558 35 - 65 *-0.582333 0.159558 35 - 70 *-0.425333 0.159558 35 - 75 *-0.350333 0.159558 40 - 45 *-0.222 0.159558 40 - 50 *-0.530333 0.159558 40 - 55 *-1.66567 0.159558 40 - 60 *-0.669333 0.159558 40 - 65 *-0.187667 0.159558 40 - 70 -0.0306667 0.159558 40 - 75 0.0443333 0.159558 45 - 50 *-0.308333 0.159558 45 - 55 *-1.44367 0.159558 45 - 60 *-0.447333 0.159558 45 - 65 0.0343333 0.159558 45 - 70 *0.191333 0.159558 45 - 75 *0.266333 0.159558 50 - 55 *-1.13533 0.159558 50 - 60 -0.139 0.159558 50 - 65 *0.342667 0.159558 50 - 70 *0.499667 0.159558 50 - 75 *0.574667 0.159558 55 - 60 *0.996333 0.159558 55 - 65 *1.478 0.159558 55 - 70 *1.635 0.159558 55 - 75 *1.71 0.159558 60 - 65 *0.481667 0.159558 60 - 70 *0.638667 0.159558 60 - 75 *0.713667 0.159558 65 - 70 0.157 0.159558 65 - 75 *0.232 0.159558 70 - 75 0.075 0.159558 -* denotes a statistically significant difference Ngành Công nghệ thực phẩm Trang xvi Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ Tinh ethanol Hoạt tính riêng Bảng phân tích phương sai ANOVA Table for Hoat tinh rieng by Ty le Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.0152776 0.00218252 918.95 0.0000 Within groups 0.000038 16 0.000002375 Total (Corr.) 0.0153156 23 Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Hoat tinh rieng by Ty le -Method: 95.0 percent LSD Ty le Count Mean Homogeneous Groups -0 0.0236667 X 1.5 0.037 X 0.0516667 X 4.5 0.0636667 X 0.069 X 2.5 0.0703333 X 3.5 0.0833333 X 3 0.110333 X -Contrast Difference +/- Limits -0 - 1.5 *-0.0133333 0.00266749 - *-0.028 0.00266749 - 2.5 *-0.0466667 0.00266749 - *-0.0866667 0.00266749 - 3.5 *-0.0596667 0.00266749 - *-0.0453333 0.00266749 - 4.5 *-0.04 0.00266749 1.5 - *-0.0146667 0.00266749 1.5 - 2.5 *-0.0333333 0.00266749 1.5 - *-0.0733333 0.00266749 1.5 - 3.5 *-0.0463333 0.00266749 1.5 - *-0.032 0.00266749 1.5 - 4.5 *-0.0266667 0.00266749 - 2.5 *-0.0186667 0.00266749 - *-0.0586667 0.00266749 - 3.5 *-0.0316667 0.00266749 - *-0.0173333 0.00266749 - 4.5 *-0.012 0.00266749 2.5 - *-0.04 0.00266749 2.5 - 3.5 *-0.013 0.00266749 2.5 - 0.00133333 0.00266749 2.5 - 4.5 *0.00666667 0.00266749 - 3.5 *0.027 0.00266749 - *0.0413333 0.00266749 - 4.5 *0.0466667 0.00266749 3.5 - *0.0143333 0.00266749 3.5 - 4.5 *0.0196667 0.00266749 - 4.5 *0.00533333 0.00266749 -* denotes a statistically significant difference Hiệu suất thu hồi Ngành Công nghệ thực phẩm Trang xvii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ ANOVA Table for Hieu suat thu hoi by Ty le Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 14324.1 2046.31 102338.75 0.0000 Within groups 0.319927 16 0.0199954 Total (Corr.) 14324.5 23 Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Hieu suat thu hoi by Ty le -Method: 95.0 percent LSD Ty le Count Mean Homogeneous Groups -1.5 18.8737 X 4.5 24.6737 X 25.4427 X 27.1633 X 2.5 32.3733 X 3.5 34.3613 X 3 46.4143 X 100.0 X -Contrast Difference +/- Limits -0 - 1.5 *81.1263 0.244758 - *74.5573 0.244758 - 2.5 *67.6267 0.244758 - *53.5857 0.244758 - 3.5 *65.6387 0.244758 - *72.8367 0.244758 - 4.5 *75.3263 0.244758 1.5 - *-6.569 0.244758 1.5 - 2.5 *-13.4997 0.244758 1.5 - *-27.5407 0.244758 1.5 - 3.5 *-15.4877 0.244758 1.5 - *-8.28967 0.244758 1.5 - 4.5 *-5.8 0.244758 - 2.5 *-6.93067 0.244758 - *-20.9717 0.244758 - 3.5 *-8.91867 0.244758 - *-1.72067 0.244758 - 4.5 *0.769 0.244758 2.5 - *-14.041 0.244758 2.5 - 3.5 *-1.988 0.244758 2.5 - *5.21 0.244758 2.5 - 4.5 *7.69967 0.244758 - 3.5 *12.053 0.244758 - *19.251 0.244758 - 4.5 *21.7407 0.244758 3.5 - *7.198 0.244758 3.5 - 4.5 *9.68767 0.244758 - 4.5 *2.48967 0.244758 -* denotes a statistically significant difference Độ tinh Ngành Công nghệ thực phẩm Trang xviii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ ANOVA Table for Do tinh sach by Ty le Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 26.3702 3.76717 1416.70 0.0000 Within groups 0.042546 16 0.00265913 Total (Corr.) 26.4128 23 Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Do tinh sach by Ty le -Method: 95.0 percent LSD Ty le Count Mean Homogeneous Groups -0 1.0 X 1.5 1.54167 X 2.161 X 4.5 2.65833 X 2.862 X 2.5 2.937 X 3.5 3.486 X 3 4.59267 X -Contrast Difference +/- Limits -0 - 1.5 *-0.541667 0.0892568 - *-1.161 0.0892568 - 2.5 *-1.937 0.0892568 - *-3.59267 0.0892568 - 3.5 *-2.486 0.0892568 - *-1.862 0.0892568 - 4.5 *-1.65833 0.0892568 1.5 - *-0.619333 0.0892568 1.5 - 2.5 *-1.39533 0.0892568 1.5 - *-3.051 0.0892568 1.5 - 3.5 *-1.94433 0.0892568 1.5 - *-1.32033 0.0892568 1.5 - 4.5 *-1.11667 0.0892568 - 2.5 *-0.776 0.0892568 - *-2.43167 0.0892568 - 3.5 *-1.325 0.0892568 - *-0.701 0.0892568 - 4.5 *-0.497333 0.0892568 2.5 - *-1.65567 0.0892568 2.5 - 3.5 *-0.549 0.0892568 2.5 - 0.075 0.0892568 2.5 - 4.5 *0.278667 0.0892568 - 3.5 *1.10667 0.0892568 - *1.73067 0.0892568 - 4.5 *1.93433 0.0892568 3.5 - *0.624 0.0892568 3.5 - 4.5 *0.827667 0.0892568 - 4.5 *0.203667 0.0892568 -* denotes a statistically significant difference So sánh hiệu tinh muối (NH4)2SO4 ethanol Ngành Công nghệ thực phẩm Trang xix Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ Hoạt tính riêng Bảng phân tích phương sai ANOVA Table for Hoat tinh rieng by Nong hoac ty le hoa chat Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.0134009 0.00670044 1435.81 0.0000 Within groups 0.000028 60.00000466667 Total (Corr.) 0.0134289 Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Hoat tinh rieng by Nong hoac ty le hoa chat -Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups -0 0.0236667 X 55 0.0996667 X 3 0.110333 X -Contrast Difference +/- Limits -0 - *-0.0866667 0.00431596 - 55 *-0.076 0.00431596 - 55 *0.0106667 0.00431596 -* denotes a statistically significant difference Hiệu suất thu hồi ANOVA Table for Hieu suat thu hoi by Nong hoac ty le hoa chat Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 6305.67 3152.83 133439.47 0.0000 Within groups 0.141765 0.0236274 Total (Corr.) 6305.81 Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Hieu suat thu hoi by Nong hoac ty le hoa chat -Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups -55 41.596 X 3 46.4143 X 100.0 X -Contrast Difference +/- Limits -0 - *53.5857 0.307102 - 55 *58.404 0.307102 - 55 *4.81833 0.307102 -* denotes a statistically significant difference Ngành Công nghệ thực phẩm Trang xx Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ Độ tinh ANOVA Table for Do tinh sach by Nong hoac ty le hoa chat Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 23.1899 11.595 1229.66 0.0000 Within groups 0.0565767 0.00942944 Total (Corr.) 23.2465 Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Do tinh sach by Nong hoac ty le hoa chat -Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Homogeneous Groups -0 1.0 X 55 4.18 X 3 4.59267 X -Contrast Difference +/- Limits -0 - *-3.59267 0.194007 - 55 *-3.18 0.194007 - 55 *0.412667 0.194007 -* denotes a statistically significant difference Bảo quản lạnh đông enzyme sau tinh muối (NH4)2SO4 Hoạt tính riêng Bảng phân tích phương sai ANOVA Table for Muc thay doi hoat tinh by Tuan Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.00655791 0.00163948 6.58 0.0001 Within groups 0.0361165 145 0.000249079 Total (Corr.) 0.0426744 149 Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Muc thay doi hoat tinh by Tuan -Method: 95.0 percent LSD Tuan Count Mean Homogeneous Groups -4 30 0.0459667 X 30 0.0516 XX 30 0.0553333 XX 30 0.0598667 XX 30 0.0651667 X Contrast Ngành Công nghệ thực phẩm Difference +/- Limits Trang xxi Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ -0 - 0.0053 0.008054 - *0.00983333 0.008054 - *0.0135667 0.008054 - *0.0192 0.008054 - 0.00453333 0.008054 - *0.00826667 0.008054 - *0.0139 0.008054 - 0.00373333 0.008054 - *0.00936667 0.008054 - 0.00563333 0.008054 -* denotes a statistically significant difference Bảo quản lạnh đông enzyme sau tinh ethanol Hoạt tính riêng Bảng phân tích phương sai ANOVA Table for Hoat tinh rieng by Tuan Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.00260689 0.000651722 1.23 0.3020 Within groups 0.0528821 100 0.000528821 Total (Corr.) 0.055489 104 Bảng kiểm định LSD Multiple Range Tests for Hoat tinh rieng by Tuan -Method: 95.0 percent LSD Tuan Count Mean Homogeneous Groups -4 21 0.0551905 X 21 0.0599524 XX 21 0.0613524 XX 21 0.066 XX 21 0.069619 X -Contrast Difference +/- Limits -0 - 0.00361905 0.0140798 - 0.00826667 0.0140798 - 0.00966667 0.0140798 - *0.0144286 0.0140798 - 0.00464762 0.0140798 - 0.00604762 0.0140798 - 0.0108095 0.0140798 - 0.0014 0.0140798 - 0.0061619 0.0140798 - 0.0047619 0.0140798 -* denotes a statistically significant difference Ngành Công nghệ thực phẩm Trang xxii [...]... định của enzyme cellulase sau khi tinh sạch sơ bộ 4.4.1 Sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase đã tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết tủa với ammonium sulfate theo thời gian bảo quản Việc nghiên cứu khả năng bảo quản của enzyme sau khi tinh sạch đóng vai trò quan trọng cho các bước tinh sạch cao hơn và sử dụng tiếp theo Giống như các enzyme khác, enzyme cellulase cũng dễ bị mất hoạt tính khi bảo quản. .. cứu về khả năng tinh sạch sơ bộ và bảo quản enzyme sau khi tinh sạch sơ bộ có ý nghĩa rất quan trọng cho các các quá trình tinh sạch và sử dụng tiếp theo Enzyme cellulase rất nhạy cảm với các yếu tố môi trường bên ngoài lẫn bên trong, việc nghiên cứu cần phải đảm bảo chính xác các yếu tố như: nhiệt độ, hóa chất, dụng cụ, thao tác, Kết quả khảo sát cho thấy: Qua so sánh hai biện pháp tinh sạch sơ bộ. .. ngoài Tinh sạch enzyme cellulase từ các nguồn thực vật và nấm mốc, vi khuẩn đã được thực hiện và đưa vào áp dụng ở nhiều nơi trên thế giới - Jamil et al (2005) đã nghiên cứu khả năng tinh sạch và xác định tính chất của enzyme cellulase (EG, CBH) từ Trichoderma harzianum Theo đó, độ tinh sạch của enzyme EG tăng gấp 4,219 lần ban đầu, hoạt tính riêng tăng từ 0,087 U/mg lên 0,37 U/mg, độ tinh sạch của enzyme. .. lần) So với trường hợp bảo quản lạnh đông enzyme cellulase sau khi tinh sạch sơ bộ bằng (NH4)2SO4 thì trường hợp bảo quản lạnh đông enzyme cellulase sau khi tinh sạch sơ bộ bằng ethanol có hoạt tính riêng thay đổi ít hơn Nhưng sự thay đổi này là không đáng kể, từ tuần đầu tiên đến tuần thứ 3 sau khi bảo quản, sự thay đổi không có ý nghĩa về mặt thống kê, đến tuần thứ tư, hoạt tính enzyme giảm có sự khác... QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Ảnh hưởng của loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng đến khả năng kết tủa enzyme cellulase từ Trichoderma sp 4.1.1 Đánh giá khả năng tinh sạch enzyme cellulase thô từ Trichoderma sp bằng ammonium sulfate Chế phẩm enzyme cellulase thô ngoài thành phần chính là enzyme cellulase thì còn chứa một số enzyme khác với các hàm lượng khác nhau Mỗi loại enzyme đều có tác dụng xúc tác khác nhau, thậm... pháp nghiên cứu Khảo sát các nồng độ ammonium sulfate và các tỉ lệ ethanol thích hợp cho việc tinh sạch sơ bộ enzyme cellulase Mục đích: tìm ra loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng phù hợp nhằm đạt hiệu quả kết tủa cellulase tốt nhất mà không làm biến tính enzyme này Enzyme sẽ được đo hoạt tính và hàm lượng protein trước và sau khi tinh sạch để xác định khả năng tinh sạch của hai chất trên Hoạt tính của enzyme. .. nên việc bảo quản các loại enzyme thường tiến hành ở nhiệt độ thấp Các mẫu enzyme sau khi kết tủa, cân khối lượng sẽ được cho vào bảo quản ở nhiệt độ -20oC và được đo hoạt tính sau mỗi 7 ngày Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 5 Bảng 5: Sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase đã tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết tủa với ammonium sulfate theo thời gian bảo quản Điều kiện bảo quản Lạnh đông (-200C)... hoạt tính enzyme cellulase đã tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết tủa với ethanol theo thời gian bảo quản Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính của enzyme cellulase sau khi được tinh sạch sơ bộ bằng ethanol được trình bày ở bảng 6 Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 23 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 33 - 2011 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 6: Sự thay đổi hoạt tính enzyme cellulase đã tinh sạch sơ bộ bằng... ethanol : enzyme là 3 : 1 Tuy nhiên, kết quả thu được giữa 2 biện pháp tinh sạch sơ bộ cũng không khác nhau nhiều về hoạt tính riêng và độ tinh sạch khi tủa với muối ammonium sulfate là 0,100 U/mgprotein và 4,18 lần còn hoạt tính riêng và độ tinh sạch khi tủa bằng ethanol là 0,110 U/mgprotein và 4,593 lần Bên cạnh đó, ta thấy được hoạt tính riêng và độ tinh sạch của enzyme sau khi tinh sạch sơ bộ thu... và độ tinh sạch (4,18 lần) cao nhất là ở nồng độ 55% Lượng kết tủa protein thu được, hoạt tính riêng và độ tinh sạch của cellulase khi xử lý dịch enzyme thô ở các nồng độ muối khác chưa cao lắm Ngoài biện pháp gây tủa enzyme với muối ammonium sulfate, thì phương pháp gây tủa với ethanol cũng được áp dụng khi tinh sạch sơ bộ hỗn hợp enzyme thô 4.1.2 Đánh giá khả năng tinh sạch enzyme cellulase thô từ ... HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TINH SẠCH SƠ BỘ VÀ BẢO QUẢN LẠNH ĐÔNG ENZYME CELLULASE TỪ TRICHODERMA SP Giáo viên hướng... đến khả kết tủa enzyme cellulase từ Trichoderma sp 19 4.1.1 Đánh giá khả tinh enzyme cellulase thô từ Trichoderma sp ammonium sulfate 19 4.1.2 Đánh giá khả tinh enzyme cellulase. .. dụng đến khả kết tủa enzyme cellulase từ Trichoderma sp 4.1.1 Đánh giá khả tinh enzyme cellulase thô từ Trichoderma sp ammonium sulfate Chế phẩm enzyme cellulase thô thành phần enzyme cellulase