TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN I MỞ ĐẦU Sử dụng thực phẩm chế biến sẵn, ăn hải sản tươi sống, dần trở thành thói quen người tiêu dùng Các mặt hàng thực phẩm từ tươi sống, sơ chế đến chế biến sẵn có mặt ngày đa dạng quầy hàng, siêu thị Công việc bếp núc ngày nhẹ nhàng, tiện lợi Tuy nhiên, điều đặt cho nhà sản xuất, nhà quản lý trách nhiệm, để sản phẩm thực phẩm phải thật an toàn, vệ sinh Nhiễm khuẩn Salmonella sản phẩm thực phẩm, đặc biệt sản phẩm thủy sản nguyên nhân chính, đứng thứ hai sau tác nhân Campylobacter, gây vụ ngộ độc thực phẩm vi sinh Sự nhiễm khuẩn Salmonella xảy công đoạn trình chế biến thực phẩm Quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT ban hành ngày 31/8/2001 Bộ Y Tế giới hạn ô nhiễm vi sinh thực phẩm qui định không cho phép có Salmonella 25g (ml) loại thực phẩm Trước đây, khâu kiểm nghiệm vi sinh mẫu tốn nhiều thời gian Phương pháp định tính Salmonella truyền thống nuôi cấy định danh từ 4-6 ngày, nhiều ảnh hưởng đến hoạt động sản xuất kinh doanh doanh nghiệp, ảnh hưởng đến vấn đề tầm soát an toàn vệ sinh thực phẩm Ngày nay, với tiến khoa học, công nghệ sinh học ứng dụng rộng rãi, kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) áp dụng để chẩn đoán nhanh Salmonella thực phẩm cho kết vòng 24 Các kít PCR có khả giúp người thi hành công vụ giám sát vệ sinh an toàn thực phẩm mà không tốn nhiều thời gian, việc kiểm tra chất lượng vi sinh qua khâu sản xuất trở nên dễ dàng, thuận lợi TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN II TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan Salmonella 2.2.1 Lịch sử phát - Năm 1885 Slamon Smith (Mỹ) tìm Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả gọi tên Bacilus cholerasuis, gọi Salmonella Nhưng sau Schweinittz Dorset 1903 chứng minh bệnh dịch tả loại vi rút gây nên xác định S.choleraesuis vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn - Năm 1888, A.Gartner phân lập mầm bệnh từ thịt bò lách người bệnh, ông gọi vi khuẩn Bacillus enteritidis ngày vi khuẩn gọi S.enteritidis Vi khuẩn gọi nhiều tên khác như: Bacterium enteritidis, Bacillus gartner… - Năm 1889, Klein phân lập S.gallinarum Rettger phân lập S.pullorum năm 1909 Trước người ta cho hai loại vi khuẩn gây hai bệnh khác lên gọi chung bệnh phó thương hàn gà (Typhus avium) bệnh có tên chung S.gallinarum –pullorum - Năm 1896, C.Archard Rbensauded phân lập vi khuẩn S.paratyphi equi S.paratyphi bacilus Ngày vi khuẩn gọi tên S.paratyphi B đến năm 1898, S.paratyphi A tìm N.Guyn H Keyser 2.2.2 Phân loại - Về phân loại khoa học Salmonella xếp vào:  Giới : Bacteria  Ngành: Proteobacteria  Lớp: Gramma Proteobacteria  Bộ: Enterobacteriales  Họ: Enterobacteriaceae  Giống: Salmonella lignieres 1900 - Lúc đầu, loài Salmonella đặt tên theo hội chứng lâm sàng chúng S.typhi hay S.paratyphi A, B, C (typhoid = bệnh thương hàn, para = phó), theo vật chủ S.typhimurium gây bệnh chuột (murine = chuột), sau người ta TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN thấy loài Salmonella gây nhiều hội chứng phân lập nhiều loài khác Vì lý mà chủng Salmonella phát đặt tên theo nơi mà phân lập S.teheran, S.congo, S.london - Salmonella chia thành chi phụ nhiều loài, loài lại có khả có chi phụ Ví dụ loài Salmonella enterica chia thành loài phụ gồm S.enterica, S.salamae, S.arizonae, S.diarizonae, S.houtenae S.indica - Bằng kỹ thuật sinh học phân tử đại, nghiên cứu sau cho phép xếp tất loại Salmonella vào loài Mặc dù ý kiến nêu cách truyền thống sử dụng quen có ý nghĩa riêng nên không chấp nhận - Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, chủ yếu kháng nguyên thân O kháng nguyên lông H, Salmonella chia thành nhóm type huyết Hiện xác định gồm 2500 type huyết Salmonella 2.2.3 Đặc điểm 2.2.3.1 Đặc điểm chung đặc điểm nuôi cấy - Salmonella trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình từ – x 0,5 – µm, di chuyển tiên mao trừ S gallimarum S pullorum, không tạo bào tử, chúng phát triển tốt ở nhiệt độ 0C – 420C, thích hợp nhất ở 35 0C – 370C, pH từ – và thích hợp nhất ở pH = 7,2 Ở nhiệt độ từ 180C – 400C vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày - Salmonella vi khuẩn kỵ khí tùy nghi phát triển môi trường nuôi cấy thông thường Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn phát triển sau 24 Có thể mọc môi trường có chất ức chế chọn lọc DCA (deoxycholate citrate agar) XLD (xylose lysine deoxycholate), môi trường XLD chất ức chế nên thường dùng để phân lập Salmonella Khẩn lạc đặc trưng Salmonella môi trường tròn, lồi, suốt, có tâm đen, tâm đen lớn bao trùm khẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN Hình 1: Vi khẩn Salmonella hóa sinh Salmonella không lên 2.2.3.2 Tính chất - men lactose, lên men đường glucose sinh Thường không lên men sucrose, salicin inositol, sử dụng citrate môn trường Simmons - Tuy nhiên loài Salmonella có tính chất trên, ngoại lệ xác định S.typhi lên men đường glucose không sinh hơi, không sử dụng citrate môi trường Simmon, hầu hết chủng S.paratyphi S.Cholerasuis không sinh H2S, khoảng 5% chủng Salmonella sinh độc tố sinh bacteriocin chống lại E.Coli, Shigella số chủng Salmonella khác 2.2.4 Cấu trúc Salmonella - Salmonella có ba loại kháng nguyên, chất xuất thể tạo kích thích đáp ứng miễn dịch kết hợp đặc hiệu với sản phẩm kích thích đó, gồm: kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H kháng nguyên vỏ K Vi khuẩn thương hàn (S.typhi) có kháng nguyên V (Virulence) yếu tố chống thực bào giúp cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên tế bào bạch cầu - Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân O) + Thành phân vách tế bào có cấu trúc phức tạp gồm lớp Trong lớp peptidoglycan mỏng, cách lớp không gian chu chất tới lớp màng (outer membrane) phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein lipopolysaccharide + Bao bên lớp peptidoglycan lớp phospholipid A B (quyết định độc tố Nội độc tố), sau hai lớp polysaccharide không mang tính đặc hiệu Kháng nguyên nội độc tố có chất hóa học lypopolysaccharide (LPS) Tính đặc hiệu TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN kháng nguyên O LPS một, tính miễn dịch khác : kháng nguyên O LPS bao gồm lớp peptidoglycan nên tính sinh miễn dịch mạnh LPS Màng có cấu trúc gần giống tế bào chất phospholipid gặp lớp trong, lớp lipopolysaccharide dày khoảng 8- 10 nm gồm thành phần : Lipid A, polysaccharide lõi, kháng nguyên O Màng có thêm protein: Protein chất: porin vi khuẩn gọi protein lỗ xuyên màng với chức cho phép số loại phân tử qua chúng dipeptide, disaccharide, ion vô Protein màng ngoài: chức vận chuyển số phân tử riêng biệt đưa qua màng Lipoprotein: đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên với lớp màng - Kháng nguyên lông (kháng nguyên H) + Kháng nguyên H: Chỉ có Salmonella có lông Hầu hết Salmonella có lông trừ S.galilarum, S.pulorum gây bệnh cho gia cầm Kháng nguyên H loại kháng nguyên có chất protit, bền kháng nguyên O Kháng nguyên H dễ bị phá huỷ nhiệt độ cao xử lý cồn, axit yếu + Kháng nguyên H chia làm phase :  Phase 1: Có tính chất đặc hiệu gồm có 28 loại kháng nguyên lông biểu thị chữa số La tinh thường: a, b, c…  Phase 2: Không có tính chất đặc hiệu, loại ngưng kết với loại khác thành phần gặp E.coli Pha gồm có loại biểu thị chữa số Ả Rập 1-6 hay chữa số La Tinh e, n, x… - Kháng nguyên vỏ K + Kháng nguyên K: Không phức tạp, có kháng nguyên vỏ kháng nguyên Vi có type huyết S.typhi S.paratyphi Kháng nguyên Vi – angtigen Felix cộng phát năm 1935 Kháng nguyên Vi gây tượng ngưng kết chậm xuất hạt vỏ, kháng nguyên Vi kháng nguyên vỏ bao bọc bên kháng nguyên O, khánh nguyên Vi không tham gia vào trình gây bệnh TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN 2.2.5 Yếu tố độc lực - Vi khuẩn Salmonella tiết loại độc tố: Ngoại độc tố nội độc tố + Nội độc tố Salmonella mạnh gồm loại: Gây xung huyết mụn loét, độc tố ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật + Ngoại độc tố phát lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion đặt vào ổ bụng chuột lang để nuôi, sau ngày lấy ra, lại cấy truyền từ đến 10 lần, sau đem lọc, nước lọc có khả gây bệnh cho động vật thí nghiệm Ngoại độc tố hình thành điều kiện invivo nuôi cấy kỵ khí Ngoại độc tố tác động vào thần kinh ruột 2.2.6 Nguồn gốc lây nhiễm - Các sản phẩm thịt nói chung, thịt gia cầm thịt lợn Tất thức ăn tươi sống có nguồn gốc động vật nguồn vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn sống tự ruột động vật có lông Gia cầm có nhiều Salmonella nhất, động vật nuôi nhà động vật hoang (vẹt, rùa, chó, ếch, chim mông biển, loài gặm nhấm, rắn) Vi khuẩn có thành phần dẫn xuất chất từ động vật gelatin nước bọt động vật, côn trùng, loài gặm nhấm, chim sản phẩm thịt nhiễm khuẩn gây nhiễm vào thực phẩm Ngoài bị nhiễm từ người khỏe mạnh có mang vi khuẩn Thực phẩm có nguồn gốc thực vật ít có nguy nhiễm khuẩn Vì lí bị ức chế pH < có mặt vi khuẩn lactic nên sản phẩm lên men bị nhiễm Trứng sản phẩm trứng ví dụ bột nhào, nước sốt mayonnaise, protit đông tụ tách từ sữa, gia cầm nguồn mang nhiều Salmonella, nên trứng bị nhiễm vi khuẩn xuyên qua vỏ trứng sinh sản lòng đỏ trứng - Các sản phẩm sữa sữa không trùng, phomát từ sữa tươi, kem chất béo sữa, sản phẩm từ sữa nói chung chế biến từ nông trại, thiết bị gây nhiễm vào nguyên liệu, tạo môi trường thuận lợi choSalmonella, từ gây nhiễm độc cho sản phẩm sữa Nếu tiến hành axit hóa chậm vi khuẩn dễ dàng sinh sản phomát bị phá hủy với pH < 4,5 Những sản phẩm có sữa phải TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN giám sát chặt chẽ chúng không trùng nữa, có Salmonella sữa bột chúng sinh sản chúng có khả tồn điều kiện khô hạn lây nhiễm sang sản phẩm khác 2.2 Phương pháp định tính Salmonella nuôi cấy truyền thống Phương pháp dùng để định tính kết luận phát hay không phát Salmonella lượng mẫu lấy Qui trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải trải qua bốn giai đoạn: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập khẳng định; phải sử dụng chủng chứng toàn trình phân tích Với tổng thời gian thực trình từ 4- ngày - Tiền tăng sinh: Mẫu tiền tăng sinh môi trường tăng sinh không chọn lọc (peptone đệm) Nguyên tắc trộn phần mẫu với phần nước pepton đệm Nếu dùng 25g mẫu cần làm dập hòa lượng mẫu với 225ml nước pepton đệm, đồng mẫu máy dập mẫu từ 15-30 giây Ủ 37oC 18- 24 - Tăng sinh: Mẫu sau tiền tăng sinh chuyển qua tăng sinh môi trường tăng sinh chọn lọc Cấy chuyền 0,1ml dịch tiền tăng sinh sang môi trường Rapparport Vassiliadis soy pepton Ủ 42oC khoảng 24 ± - Phân lập: cấy ria dịch mẫu từ môi trường tăng sinh chọn lọc sang hai môi trường rắn chọn lọc (XLD BPLS) cho tạo khuẩn lạc tách rời Lật ngược đĩa ủ 370C khoảng 24 ± + Trên môi trường XLD: khuẩn lạc Salmonella điển hình trong, nhuốm đỏ thay đổi chất thị môi trường, phần lớn có tâm đen Bao nhận thấy vùng môi trường đỏ lớn nhỏ (đặc biệt salmonella mọc dày) quanh khuẩn lạc + Trên môi trường BPLS: khuẩn lạc Salmonella điển hình suốt đỏ môi trường, có màu đỏ hồng xung quanh khuẩn lạc TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN Kinh nghiệm quan trọng việc nhận biết khuẩn lạc Salmonella Hình thái chúng nhiều có biến động, không theo kiểu kháng huyết mà theo khác biệt lô môi trường sử dụng - Khẳng định: Cấy chuyền khuẩn lạc nghi Salmonella sang môi trường thích hợp, thẩm tra thử nghiệm sinh hóa kháng huyết Chọn khuẩn lạc điển hình hay nghi ngờ đĩa cấy chuyển sang môi trường rắn không chọn lọc (TSA), ủ 370C khoảng 18-24 + Thử nghiệm sinh hóa: Cần tiến hành kiểm tra khẳng định thử nghiệm sinh hóa phù hợp Có thể kết luận mẫu có Salmonella có chứa trực khuẩn gram âm tạo khuẩn lạc đặc trưng môi trường phân lập cho kết sinh hóa sau: Lactose (-), sucrose (+), urease (-), Indol (-), VP (-), TDA (-), Mannitol (+) Để bổ sung dùng thêm số thử nghiệm LDC, ODC amygdaline + Khẳng định huyết kháng: Thử nghiệm huyết kháng nên dùng song song với nước muối sinh lý; huyết kháng dùng Salmonella polyvalent Oantiserum Salmonella polyvalent H-antiserum Kết quả: Phát (hay không phát hiện) Salmonella 25g mẫu 2.3 Giới thiệu kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.3.1 Lịch sử hình thành PCR - Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) Đây kỹ thuật sinh học phân tử cho phép nhân đoạn DNA mong muốn từ hệ gen DNA thể sinh vật thành nhiều sao, kỹ thuật nhà khoa học người Mỹ – Kary Mullis cộng phát minh năm 1985 công ty Cetus; nguyên tắc mô tả chi tiết trước thập niên Khorana ctv., (Kleppe ctv., 1971; Panet ctv., 1974), giới thiệu lần Hội thảo TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN lần thứ 51 Cold Spring Harbor vào năm 1986 ông nhận giải thưởng Nobel Hoá sinh học vào năm 1993 Kể từ tạo nên tác động to lớn nghiên cứu sinh học toàn giới 2.3.2 Nguyên lý Nguyên lý nhân gen tế bào: DNA vật chất di truyền thể sống quy định lên đặc tính thể (ngoại trừ số loại virus có vật chất di truyền RNA) Đối với sinh vật có cấu trúc tế bào nhân chuẩn, phân tử DNA tồn dạng kết hợp với protein thành nhiễm sắc thể nhân tế bào Ngoài ra, quan ty thể lạp thể (ở thực vật) chứa DNA dạng plasmid Các phân tử DNA tế bào hoạt động bình thường nhân lên trình phân bào nguyên nhiễm Để thực trình này, đòi hỏi phải có mặt enzym DNA polymerase, tham gia đoạn mồi có trình tự bổ sung gắn vào vào sợi DNA khuôn dNTPs làm nguồn cung cấp nucleotit Trong trình phân bào nguyên nhiễm, sợi DNA kép mở xuắn tách thành sợi DNA sợi đơn Dưới tác dụng enzim DNA polymerase, trình tổng hợp DNA xảy theo cách gắn nucleotit vào đoạn mồi để kéo dài chuỗi theo nguyên tắc bổ sung với DNA khuôn Nguyên lý kỹ thuật PCR Kỹ thuật tổng hợp DNA thể tuân thủ nguyên tắc chép DNA thể có khác biệt: + Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzim helicase + Kết hợp với enzim DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp DNA môi trường thích hợp TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN + Hệ thống điều nhiệt thích hợp với đoạn mồi thiết kế chuyên biệt, chủ động Phương pháp PCR cho phép tổng hợp nhanh xác đoạn DNA riêng biệt Ðây thực phương pháp đại thuận tiện cho việc xác định có mặt gen tế bào với độ xác cao Phương pháp dựa khám phá hoạt tính sinh học nhiệt độ cao DNA polymerase tìm thấy sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống suối nước nóng) Phần lớn DNA polymerase làm việc nhiệt độ thấp Nhưng nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt DNA polymerase nhiều khả làm biến tính phần lớn phần phân tử Nhưng polymerase chịu nhiệt hoạt động nhiệt độ cao, lên đến 1000C Ở nhiệt độ DNA bị biến tính (DNA dạng xoắn duỗi dạng thẳng) Một phản ứng PCR chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp Chu kỳ phản ứng PCR: gồm ba giai đoạn - Giai đoạn biến tính: Trong giai đoạn phân tử DNA mẫu bị biến t1inh nhiệt độ cao (thường từ 94-950C, lớn nhiệt độ nóng chảy phân tử) vòng 30 giây đến phút, tất liên kết hydro hai mạch phân tử bị bẻ gãy tạo thành DNA sợi đơn - Giai đoạn lai: nhiệt độ hạ thấp (thường 40-700C, thấp nhiệt độ nóng chảy mồi sử dụng khoảng từ 3-50C) cho phép mồi bám vào phân tử DNA sợi đơn, đánh dấu phần DNA cần khuyếch đại Giai đoạn kéo dài từ 30 giây đến phút Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ tăng lên 720C giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt Công việc DNA polymerase di chuyển dọc theo DNA sợi đơn sử dụng làm khuôn để tổng hợp sợi DNA bổ sung với DNA mẫu 10 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN cách kéo dài phần đánh dấu mồi Thời gian giai đoạn phụ thuộc vào kích thước DNA mẫu, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút Các thành phần phản ứng PCR: - Primer (mồi): + Mồi đoạn DNA sợi đơn ngắn cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA Chúng bắt cặp bổ sung với đầu DNA mẫu tạo vị trí bắt đầu tái Các mồi có chiều ngược nhau, bao gồm mồi xuôi (forward primer) mồi ngược (reserse primer) 11 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN + Mồi tiêu quan trọng phản ứng PCR để định tính đặc trưng hiệu phản ứng Do việc thiết kế mồi cần tuân thủ số nguyên tắc định: dài khoảng 8-24base; nhiệt độ gắn mồi mồi gần nhau; thành phần nucleotic mồi cần trách cặp GC lặp lặp lại nhiều lần; mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuyếch đại; không hình thành primer dimer, trình tự lặp lại - DNA mẫu (DNA template): hàm lượng đủ không cao, tinh sạch, không chứa chất ức chế phản ứng (SDS), chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, heparin …) PCR cho kết tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ tế bào hay mẫu DNA không bảo quản tốt - Nồng độ MgCl2: cần cho hoạt động Tag polymerase, hàm lượng cao tạo nhiều sản phẩm ký sinh, thấp giảm hiệu nhân enzym, Nồng độ tối ưu phải xác định cho phản ứng qua nhiều lần thử nghiệm - dNTP (deoxy nucleoside triphosphate): thành phần loại dNTP phải cân bằng, cân làm tăng lỗi chép polymerase Hàm lượng thường không đổi thay đổi tùy điều kiện thực tế - Enzym polymerase chịu nhiệt: Là enzim xúc tác cho trình lắp ráp nucleotide A, T, G, C vào mạch DNA tổng hợp, phải men polymerase chịu nhiệt độ cao Taq polymerase DNA polymerase chịu nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR lần bán thị trường Taq polymerase nhà vi sinh vật học Thomas Brock phát Thermus aquaticus loài vi khuẩn phát triển mạnh nhiệt độ cao Enzym chịu nhiệt giúp giải vấn đề enzym biến tính sau chu kỳ Từ đến nay, số vi sinh vật chịu nhiệt khác khám phá người ta tách chiết thêmđược DNA polymerase chịu nhiệt để sử dụng cho phản ứng PCR Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus litoralis), Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus), Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus), UITma DNA polymerase (Thermotoga maritima) … 12 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN - Số lượng chu kỳ phản ứng: tùy thuộc vào số lượng mẫu ban đầu, thông thường số lượng chu kỳ nhỏ 40 cho phản ứng PCR Thời gian chu kỳ phụ thuộc thiết bị kích thước sản phẩm - Thiết bị dụng cụ cho phản ứng PCR: cần đáp ứng nhu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh xác Những cải tiến máy luân nhiệt quan tâm đến microtiler plate 96 giếng, block nhiệt riêng biệt máy, block dùng cho lam kính để tiến hành in situ PCR 2.3.3 Các ứng dụng Kỹ thuật PCR ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác nhau, từ nghiên cứu khoa học đến sản xuất đời sống xã hội Những ứng dụng kỹ thuật PCR là: - Xác định đoạn trình tự cần nghiên cứu - Phát đột biến - Nghiên cứu trình tiến hoá phân tử - Phục hồi gen tồn hàng triệu năm - Chọn giống vật nuôi, trồng - Lựa chọn cặp cha mẹ chủng thời gian ngắn - Xác định loài mới, loài đặc hữu phương pháp di truyền phân tử - Chuẩn đoán xác bệnh nhiễm trùng từ vi khuẩn, nấm, virus - Chuẩn đoán sớm bệnh gây ung thư, bệnh di truyền - Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm - Là kỹ thuật cho kỹ thuật khác như: RAPD, SSR… 13 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN 2.3.4 PCR Real time PCR Hiện có nhiều phương pháp PCR cải tiến dựa phương pháp PCR truyền thống nhằm mục đích để rút ngắn thời gian thực nâng cao hiệu tính xác kỹ thuật PCR lĩnh vực ứng dụng khác Real time PCR (RTPCR) phương pháp PCR cải tiến phương pháp cho phép hiển thị theo dõi trực tiếp trình nhân DNA diễn theo chu trình nhiệt nhờ vào sử dụng thiết bị huỳnh quang cách gắn thêm phận kích thích phận cảm nhận phát huỳnh quang Do RT-PCR có khả định lượng đối tượng nghiên cứu So với phương pháp PCR truyền thống phương pháp RT-PCR có ưu điểm vượt trội hơn: độ nhạy độ đặc hiệu cao hơn, định lượng nhiều loại gene lúc dùng giản đồ ghi nhận điểm nóng chảy để xác địn đặc tính gene khác nhau, giảm nguy ngoại nhiễm rút ngắn thời gian thực hiện, hạn chế nhiễm chéo không cần điện di sau PCR 2.3.5 Một số đề tài nghiên cứu ứng dụng PCR phát Salmonella Có nhiều nghiên cứu ứng dụng phương pháp PCR khác nhằm mục đích phát nhanh hiệu Salmonella thực phẩm: - Chen cộng tác viên (1997) ứng dụng thành công kỹ thuật PCR để phát Salmonella số thịt sống siêu thị mà ông đồng nghiệp thu thập trình làm thí nghiệm Trong thí nghiệm nầy, PCR phát Salmonella sữa mật độ cfu/25ml sữa; 1,5 cfu/25g thịt bò cfu/25g thịt lợn - Năm 2001 Luciana Ruschel dos SANTOS cộng ứng dụng PCR vào phát Salmonella thịt gà sống bị ô nhiễm - Ảnh hưởng pre-enrichment protocol đến độ nhậy tính đặc hiệu phương pháp PCR việc phát Salmonella thị gia cầm tươi M.S Myint công tác viên nghiên cứu công bố vào năm 2005 14 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN - Năm 2006, Myint cộng tác viên báo cáo việc tăng cường mật số Salmonella thực phẩm 12h phát 100% mẫu có nhiễm Salmonella thí nghiệm ông ta Kết PCR tăng cường Salmonella mẫu khác biệt cách có ý nghĩa (p< 0.001) so với việc không tăng cường - Năm 2008, Trina Chua cộng tác viên công bố phương pháp ly trích DNA nhanh chóng đơn giản để phát Salmonella phương pháp Real time PCR… Ngoài kỹ thuật PCR ứng dụng đa dạng có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng như: - Xác định giới tính heo kỹ thuật PCR Nguyễn Thị Thu Lan, Nguyễn Hoàng Chương, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, Huỳnh Thị Lệ Duyên, Phan Kim Ngọc nghiên cứu công bố Tạp chí di truyền & ứng dụng, số - Tang cộng tác viên năm 2000 dùng kỹ thuật PCR competitive để định lượng WSSV (White Spot Syndrome Virus) nhiễm Penaeus monodon Fabricius để phân loại giai đoạn nhiễm WSSV thành mức độ nhẹ, trung bình nặng, từ có cách xử lý thích hợp làm giảm thiệt hại nghề nuôi tôm - Phẩm Minh Thu, Phan Thu Dòng, Trương Xuân Liên cộng Viện Pasteur Tp.HCM nghiên cứu phát nhanh Salmonella spp thực phẩm - Áp dụng kỹ thuật PCR sản xuất Bộ KIT chuẩn đoán bệnh đốm trắng tôm, bệnh vàng gân xanh Viện NC&PT Công nghệ Sinh học- Đại học Cần Thơ 15 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN III ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR KIỂM ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN 3.1 Thiết bị, dụng cụ: - Tủ ấm 37oC - Máy luân nhiệt - Máy ly tâm dùng cho ống eppendorf 1,5 ml - Máy lắc ống nghiệm - Thiết bị điện di ngang nguồn điện di có điện hoạt động từ 80 đế 150 volt - Hộp đèn soi UV có kính lọc 302mm - Bộ chụp ảnh đèn UV - Ống Eppendorf 0,2 0,5 ml; 1,5 ml chuyên dùng cho PCR 3.2 Hoá chất, môi trường 3.2.1 Mồi Gồm hai mồi invA1 invA2 thiết lập cách 520 bp gen invA có vai trò trình xâm nhiễm Salmonellavào thành ruột động vật người Trình tự hai mồi sau : invA1 : 5' - TTGTTACGGCTATTTTGACCA -3' invA2 : 5' - CTGACTGCTACCTTGGCTGATG - 3' Nồng độ mồi sử dụng phân tích pha loãng thành pM đệm TE Ðệm TE có thành phần sau : 10 mM Tris-HCl (pH = 8), mM EDTA 3.2.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật loại hoá chất khác 16 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN Khuyến khích sử dụng môi trường nuôi cấy dạng bột khô vật liệu dùng cho phản ứng khuếch đại PCR tổng hợp thành kit lưu hành thị trường có thành phần phù hợp Quá trình pha chế, bảo quản, sử dụng phải tuân thủ theo hướng dẫn nhà sản xuất Trong trường hợp sử dụng vật liệu hoá chất riêng lẻ, độ tinh khiết thành phần nước pha chế phải đảm bảo chất lượng dùng cho vi sinh sinh học phân tử * Dung dịch đệm pepton Pepton (C5H10O5): 10,0g Natri clorua (NaCl): 5,0g Ðinatri hyđro phôt phat (Na2HPO4): 3,6 g Kali đihyđro phôt phat (KH2PO4): 1,5g Nước cất: 1000 ml Hoà tan thành phần nước cất, đun tan, phân phối vào bình chứa phù hợp Hấp khử trùng nhiệt độ 121oC 15 phú pH sau khử trùng 7,0 0,2 25oC * Hỗn hợp dùng khuếch đại PCR 1,1x Taq polymerase: 0,025 U/ml (1,25 U/50 ml) Tris - HCl (pH = 8,8 nhiệt độ 25oC): 75 mM Sunphat amon (NH4)2ư SO4: 20 nM Tween 20: 0,01% (v/v) dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP): 200 mM (mỗi loại) Magiê clorua (MgCl2) 1,5 mM Tất thành phần pha chế nước cất lần bảo quản nhiệt độ oC tháng Có thể bảo quản nhiệt độ - 20 oC năm Không nên rã đông tái đông dung dịch pha chế nhiều lần 17 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN * Thang ADN Nên sử dụng thang đo phù hợp ước lượng đoạn khuếch đại 520 bp Có thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 520 bp biết trước làm thang đo phương pháp * Agarose Sử dụng kỹ thuật loại dùng để điện di ADN có kích thước nhỏ 1000 bp * Ðệm điện di TAE 1x Tris: 4,84 g Na2EDTA 0,5M, pH = 8,0: ml Axit axetic băng: 1,14 ml Nước cất cho đủ: 1000 ml Nên pha chế thành dung dịch 10x (đậm đặc 10 lần), sử dụng pha loãng với nước thành dung dịch 1x * Ðệm tải mẫu 6x Glyxerol: 30 % Xanh bromphenon: 0,25 % Tris: 200 mM Na2EDTA: 20 mM Các thành phần pha nước cất, bảo quản nhiệt độ 4oC * Thuốc nhuộm AND: dung dịch etyl bromua nồng độ 10 mg/ml 3.3 Qui trình thực 3.3 Thu nhận tăng sinh mẫu Thu thập mẫu thủy sản nơi khác siêu thị, hàng bán thủy sản thủy sản chợ Mẫu thu thập lưu trữ vào túi nylon hay khay nhựa dụng cụ khác tuyệt trùng để tránh lẫn nhiễm trình thu mẫu 18 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN Vì phân bố Salmonella thủy sản không đồng Để phát xác mật số Salmonella thịt mẫu thịt thu thập chia nhiều mẫu nhỏ Mỗi mẫu chứa khoảng 25g thịt Để phát Salmonella mẫu thịt, 25g mẫu thu thập dùng để tăng cường mật độ Salmonella cách nuôi 225ml buffered peptone water (BPW) tủ hấp, lắc điều, qua đêm Mẫu tăng cường Salmonella dùng cho phản ứng PCR (Gouws et al., 1998) phương pháp nuôi cấy truyền thống (Andrew et al., 2003) 3.3.2 Qui trình ly trích DNA Salmonella Chuyển 1ml BPW qua đêm với mẫu thịt sang 1.5ml 2.0ml tube ly tâm Ly tâm phút với vận tốc 16000 vòng/phút để thu thập pellet (phần cặn đóng lại đáy tube ly tâm) DNA ly trích sử dụng phương pháp sau Phương pháp Rữa pellet với 1ml nước tuyệt trùng sau hoà tan pellet với 200µl InstaGene Matrix (BioRad) Hỗn hợp dung dịch ủ 56 oC 20 phút, lắc (vortex) 10 giây sau ủ water bath 10 phút Chuyển hỗn hợp sang nước đá 10 phút sau ly tâm phút với tốc độ 16,000 vòng/phút DNA sau hoà tan với nước tuyệt trùng Phương pháp Rữa pellet với 1ml nước tuyệt trùng phương pháp Pellet sau hoà tan với 200µl DNA extraction reagent TE buffer (1:4), đem hỗn hợp ủ water bath phút Hỗn hợp sau ly tâm phút với tốc độ 16,000 vòng/phút DNA sau hoà tan với nước tuyệt trùng Phương pháp Phương pháp nầy phát triển theo phương pháp EnviroAmpm Legionellu Sample Preparation Kit (Perkin-Elmer) Pellet không cần rữa với nước tuyệt trùng phương pháp mà hoà tan với 500µl EnviroAmp DNA Extraction Reagent ủ water bath 20 phút Ly tâm 30 giây tốc độ 16000vòng/phút để loại mãnh vỡ thực phẩm tế bào Chuyển hỗn hợp sang tube kết tủa với 400µl 100% isopropanol Sau 19 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN ly tâm phút tôc độ 16000 vòng/phút Rữa tube 1-2 lần với 75% isopropanol DNA sau hoà tan với nước tuyệt trùng Phương pháp Phương pháp dựa phương pháp Nucleon I (ScotLab) Mẫu pellet hoà tan 340µl reagent B 100µl sodium perchlorate ủ 37oC 20 phút sau 65oC 20 phút Thêm 580µl chloroform lắc ly tâm 16000 vòng/phút phút để loại mãnh vỡ thực phẩm tế bào Chuyển 400µl sang tube tủa với 800µl 100% ethanol, ly tâm lại rữa lần với 75% ethanol DNA thu thập hoà tan với nước tuyệt trùng 3.3.3 Phản ứng PCR DNA chuẩn bị sẵn phần qui trình ly trích DNA Các sản phẩm DNA phải có nồng độ để phân tích cho kết giống Mỗi phản ứng PCR cần 2µl DNA từ sản phẩm DNA Pipette 2µl DNA vào hỗn hợp phản ứng PCR (48µl) bao gồm Taq polimerase 0.25µl (Ex Taq, Takara Bio Inc TM, Shiga, Japan), 10 X Taq buffer 5µl, hỗn hợp dNTP (2.5mM mỗi), 4µl (Ex Taq buffer and hỗn hợp dNTP; TAKARA BIO INCTM, Shiga, Japan) với vài primer Bảng 3.2 Phản ứng PCR tóm tắt Bảng 3.1 Bảng 3.1: Tóm tắt phản ứng PCR Bước Mục đích Nhiệt độ Thời gian Bước Khởi đầu 95oC 5’ Bước Biến tính 95oC 30” Bước Gắn mồi 55-60oC 30” Bước Kéo dài 72oC 1’ Lập lại từ bước đến bước 30-35 chu kỳ Bước 4oC Kết thúc ∞ Bảng 3.2: Danh sách số primer thường dùng cho phản ứng PCR để phát Salmonella thực phẩm 20 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN Primer Trình tự Sản phẩm Tham khảo ST11 AGCCAACCATTGCTAAATTGGCGCA 429bp Aabo et al., 1993 ST15 GGTAGAAATTCCCAGCGGGTACTG 429bp Aabo et al., 1993 302 TTGGCGATAGCCTGGCGGTG NA Hadjinicolaou et al (2009) 347 TGTTTACCGGGCATACCATCCAGAG NA Hadjinicolaou et al (2009) mdh F;5΄-TGCCAACGGAAGTTGAAGTG-3΄ R;5΄-CGCATTCCACCACGCCCTTC-3΄ 216 Amavisit et al., 2005 MLVNTR sequences TR1 F;5΄-AGAACCAGCAATGCGCCAACGA-3΄ R;5΄-CAAGAAGTGCGCATACTACACC-3΄ 200 Lindstedt et al., 2003 TR2 F;5΄-CCCTGTTTTTCGTGCTGATACG-3΄ R; 5΄-CAGAGGATATCGCAACAATCGG-3΄ 300 Lindstedt et al., 2003 TR4 F;5΄-AAAAGCCCGTCTAGTCTTGCAG-3΄ R;5΄-ATCCTTCGGTATCGGGGTATCC-3΄ 400 Lindstedt et al., 2003 TR5 F;5΄-TGAAAACCGGCTCGTAGCAGTG-3΄ R;5΄-CATACGGTTACTGCGGGATTGG-3’ 200 Lindstedt et al., 2003 DT 104 F;5΄-GTCAGCAGTGTATGGAGCGA-3΄ R5΄-AGTAGCGCCAGGACTCGTTA-3΄ 261-262 Amavisit et al., 2005 sefA sef 167 5'-AGGTTCAGGCAGCGGTTACT-3' sef 478 5'-GGGACATTTAGCGTTTCTTG-3' 312 Liu et al., 2003 3.3.4 Ðiện di sản phẩm khuếch đại Gel agarose % pha đệm TAE 1x đun chảy hoàn toàn đổ vào khay điện di có sẵn lược để tạo giếng Gel điện di phải có độ dày khoảng - mm Gel sau chuẩn bị ngâm chìm hoàn toàn đệm TAE 21 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN Chuẩn bị dịch điện di, mẫu sau khuếch đại nhuộm với 10 ml đệm tải mẫu 6x trộn thật Ðiện di: Một giếng gel điện di sử dụng cho thang ADN chuẩn hay mẫu đối chứng dương Nạp 10 ml dịch điện di chuẩn bị vào gel agarose Tiến hành điện di 60 phút hiệu điện 100 vôn 3.3.5 Nhuộm ADN, quan sát sản phẩm khuếch đại Pha dung dịch nhuộm ADN sau: cho 0,2 ml etyl bromua 10 mg/ml vào 0,5 lít nước, pha vào khay chứa có miệng rộng gel điện di Nhuộm gel: Ngâm gel điện di vào dung dịch nhuộm 10 phút Rửa gel nước khoảng - phút để loại bỏ phần etyl bromua dư Quan sát, chụp hình: Cho gel nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng kính bảo vệ, bật đèn quan sát vạch sáng đỏ ADN xuất gel Sau đó, chụp hình để lưu trữ kết 3.3.6 Ðọc giải thích kết Kết phân tích xem xét kết luận mẫu đối chứng dương tính có sản phẩm khuếch đại ADN với kích tước 520 bp mẫu đối chứng âm sản phẩm Mẫu kết luạn dương tính Salmonella có sản phẩm khuếch đại 520 bp gel Mẫu kết luận âm tính sản phẩm khuếch đại, hay sản phẩm khuếch đại có kích thước khác 520 bp 3.3.7 Qui định đảm bảo an toàn Trong trình tiến hành thao tác phải thực qui định sau đây: - Thuốc nhuộm etyl bromua chất độc gây ung thư cho người động vật Do đó, sử dụng hoá chất phải có găng tay kính bảo hộ Dung dịch sau sử dụng phải cho chảy qua than hoạt tính trước đổ bỏ 22 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN - Chỉ bật đèn UV để quan sát ADN sau đóng kính bảo vệ - Nghiêm cấm sử dụng dụng cụ liên quan đến sản phẩm sau khuếch đại cho việc tăng sinh hay chuẩn bị mẫu - Phòng thí nghiệm phải bố trí riêng biệt khu chuẩn bị mẫu trước khuếch đại khu xử lý sản phẩm sau khuếch tránh tượng nhiễm chéo gây kết dương tính giả 23 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN TÀI LIỆU THAM KHẢO Aabo, S., Ramussen, O.F., Rossen, L., Serenson, P.D., Olsen, J.E., 1993 Salmonella identification by the polymerase chain reaction Mol Cell Probe 7: 171–178 Amavisit P, Boonyawiwat W, Bangtrakulnont A 2005 Characterization of Salmonella enterica serovar typhimurium and Monophasic Salmonella Serovar 1, 4, [5], and 12: i: - Isolates in Thailand J Clin Microbio 43: 2736–2740 Andrews, W.H., Hammack, T.S 2003 Bacteriological Analytical Manual online Chapter 5: Salmonella Food and Drug Administration Chen Shu, Arlene Yee, Manse1 Griffiths, Carolyn Larkin, Carl T Yamashiro, Richa Behari, Christine Paszko-Kolva, Kris Rahn, Stephanie A De Grandis 1997 The evaluation of a fluorogenic polymerase chain reaction assay for the detection of Salmonella species in food commodities International Journal of Food Micrbiology 35: 239:250 Gouws, P.A., Visser, M., Brozel, V.S 1998 A Polymerase Chain Reaction procedure for the detection of Salmonella spp within 24 h J Food Prot 61: 1039– 1042 Lindstedt B, Even Heir, Traute Vardund, and George K 2003 DNA Fingerprinting of Salmonella enterica subsp Enterica serovar Typhimurium with emphasis on phage type DT 104 based on Variable Number of Tandem Repeat Loci J Clin Microbiol 14: 11469-1479 Liu Y, Lee M, Ooi E, Mavis Y, Tan A, Quek H 2003 Molecular Typing of Salmonella enterica Serovar Typhi Isolates from Various Countries in Asia by a Multiplex PCR Assay on Variable-Number Tandem Repeats J Clin Microbiol 41: 4388-4394 Myint M.S Y.J Johnsona, N.L Tablante, R.A Heckert 2006 The effect of preenrichment protocol on the sensitivity and specificity of PCR for detection of naturally contaminated Salmonella in raw poultry compared to conventional culture Food Microbiology 23: 599–604 Tang, K F J., Lightner D V.,2000 Quantification of white spot syndrome virus DNA throught a competitive polymerase chain reaction Aquaculture, 189:11-21) 24 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN 10 Nguyễn Thị Thu Lan, Nguyễn Hoàng Chương, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, Huỳnh Thị Lệ Duyên, Phan Kim Ngọc 2003 Xác định giới tính heo kỹ thuật PCR Tạp chí di truyền & ứng dụng ,Số 11 Phẩm Minh Thu, Phan Thu Dòng, Trương Xuân Liên cộng Phát nhanh Salmonella spp thực phẩm Viện Pasteur TP.HCM http://www.impe-qn.org.vn/impe-qn/vn/portal/InfoDetail.jsp? area=58&cat=1101&ID=2761 25 [...]... LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN Vì sự phân bố của Salmonella trong thủy sản không đồng đều Để phát hiện chính xác mật số của Salmonella trong thịt thì các mẫu thịt được thu thập sẽ được chia ra 2 hoặc nhiều mẫu nhỏ Mỗi mẫu chứa khoảng 25g thịt Để phát hiện Salmonella trong các mẫu thịt, mỗi 25g mẫu đã được thu thập được dùng để tăng cường mật độ Salmonella bằng cách nuôi trong. .. phát hiện nhanh Salmonella spp trong thực phẩm - Áp dụng kỹ thuật PCR sản xuất Bộ KIT chuẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm, bệnh vàng lá gân xanh của Viện NC&PT Công nghệ Sinh học- Đại học Cần Thơ 15 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN III ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR KIỂM ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN 3.1 Thiết bị, dụng cụ: - Tủ ấm 37oC - Máy luân nhiệt - Máy ly tâm dùng cho ống... sau PCR 2.3.5 Một số đề tài nghiên cứu ứng dụng PCR phát hiện Salmonella Có rất nhiều nghiên cứu về ứng dụng phương pháp PCR khác nhau nhằm mục đích phát hiện nhanh và hiệu quả Salmonella trong thực phẩm: - Chen và cộng tác viên (1997) đã ứng dụng thành công kỹ thuật PCR để phát hiện Salmonella trong một số thịt sống tại các siêu thị mà ông và đồng nghiệp thu thập trong quá trình làm thí nghiệm Trong. .. công tác viên nghiên cứu và công bố vào năm 2005 14 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN - Năm 2006, Myint và cộng tác viên báo cáo rằng việc tăng cường mật số của Salmonella trong thực phẩm ít nhất 12h sẽ phát hiện 100% mẫu có nhiễm Salmonella trong thí nghiệm của ông ta Kết quả PCR của sự tăng cường Salmonella trong mẫu khác biệt một cách có ý nghĩa (p< 0.001) so với việc... đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng từ vi khuẩn, nấm, virus - Chuẩn đoán sớm các bệnh gây ra do ung thư, các bệnh di truyền - Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm - Là kỹ thuật nền cho các kỹ thuật khác như: RAPD, SSR… 13 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN 2.3.4 PCR và Real time PCR Hiện nay có rất nhiều phương pháp PCR cải tiến dựa trên phương pháp PCR truyền... hoá chất khác 16 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN Khuyến khích sử dụng môi trường nuôi cấy dạng bột khô và các vật liệu dùng cho phản ứng khuếch đại PCR được tổng hợp thành kit đang được lưu hành trên thị trường có thành phần phù hợp như dưới đây Quá trình pha chế, bảo quản, sử dụng phải tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất Trong trường hợp sử dụng các vật liệu hoá chất... phản ứng PCR Thời gian của từng chu kỳ phụ thuộc thiết bị và kích thước sản phẩm - Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR: cần đáp ứng được nhu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác Những cải tiến máy luân nhiệt quan tâm đến microtiler plate 96 giếng, các block nhiệt riêng biệt trong 1 máy, block dùng cho lam kính để tiến hành in situ PCR 2.3.3 Các ứng dụng Kỹ thuật PCR được ứng dụng rộng rãi trong. .. Aquaculture, 189:11-21) 24 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN 10 Nguyễn Thị Thu Lan, Nguyễn Hoàng Chương, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, Huỳnh Thị Lệ Duyên, Phan Kim Ngọc 2003 Xác định giới tính ở heo bằng kỹ thuật PCR Tạp chí di truyền & ứng dụng ,Số 4 11 Phẩm Minh Thu, Phan Thu Dòng, Trương Xuân Liên và cộng sự Phát hiện nhanh Salmonella spp trong thực phẩm Viện Pasteur TP.HCM http://www.impe-qn.org.vn/impe-qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?... nhau, bao gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reserse primer) 11 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN + Mồi là một chỉ tiêu quan trọng của phản ứng PCR để quyết định tính đặc trưng và hiệu quả của phản ứng Do đó việc thiết kế mồi cần được tuân thủ một số nguyên tắc nhất định: dài khoảng 8-24base; nhiệt độ gắn mồi của 2 mồi gần nhau; thành phần nucleotic của các... thể gây ung thư cho người và động vật Do đó, khi sử dụng hoá chất này phải có găng tay và kính bảo hộ Dung dịch sau khi sử dụng phải cho chảy qua than hoạt tính trước khi đổ bỏ 22 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN - Chỉ được bật đèn UV để quan sát ADN sau khi đã đóng kính bảo vệ - Nghiêm cấm sử dụng các dụng cụ liên quan đến sản phẩm sau khuếch đại cho việc tăng sinh hay chuẩn ... TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN + Mồi tiêu quan trọng phản ứng PCR để định tính đặc trưng hiệu phản ứng Do việc thiết kế mồi cần tuân thủ số nguyên tắc định: dài... SSR… 13 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN 2.3.4 PCR Real time PCR Hiện có nhiều phương pháp PCR cải tiến dựa phương pháp PCR truyền thống nhằm mục đích để rút ngắn thời... Cần Thơ 15 TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN III ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR KIỂM ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỦY SẢN 3.1 Thiết bị, dụng cụ: - Tủ ấm 37oC - Máy luân nhiệt