MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TÓM TẮT Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích, yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung quýt 2.2 Giới thiệu chung công nghệ chuyển gen thực vật 2.2.1 Các phương pháp chuyển gen 2.2.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 2.2.3 Các phương pháp đánh giá chuyển gen 2.3 Các nghiên cứu nước giới tạo không hạt 2.3.1 Các nghiên cứu tạo không hạt giới 2.3.2 Các nghiên cứu nước 2.4 Các nghiên cứu chuyển gen cam quýt vi khuẩn A tumefaciens Phần VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu 3.2 Phương pháp 3.3 Nội dung nghiên cứu 3.4 Các tiêu theo dõi xử lý số liệu Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến hiệu biến nạp vi khuẩn 4.2 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến khả chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 4.3 Ảnh hưởng Acetosyringone (AS) đến biến nạp vi khuẩn 4.4 Ảnh hưởng môi trường đồng nuôi cấy đến khả tái sinh chồi 4.5 Ảnh hưởng môi trường tái sinh đến khả tái sinh hiệu chuyển gen Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1.Kết luận 5.2 Đề nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến tỷ lệ mọc khuẩn thời gian đồng nuôi cấy Bảng Tỷ lệ mẫu sống sau rửa khuẩn Bảng Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến tái sinh chồi hiệu chuyển gen Bảng Tỷ lệ mọc khuẩn thời gian đồng nuôi cấy Bảng Tỷ lệ mẫu sống sau hai lần rửa khuẩn Bảng Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu tái sinh chồi hiệu chuyển gen vi khuẩn Bảng Ảnh hưởng nồng độ AS đến tái sinh chồi hiệu chuyển gen Bảng Ảnh hưởng môi trường đồng nuôi cấy đến khả tái sinh hiệu biến nạp vi khuẩn Bảng Ảnh hưởng BAP IAA đến khả tái sinh chồi quýt Đường canh DANH MỤC HÌNH Hình Cơ chế chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Hình Phản ứng sinh màu hóa chất X-gluc Hình Chiến lược tạo không hạt Hình Sơ đồ sinh mẫn cảm auxin/GA bầu nhụy Hình Cây tuần tuổi Hình Cấu trúc vector pDU04.4522 Hình Sơ đồ trình thực đề tài Hình Ảnh mẫu cấy môi trường đồng nuôi cấy lây nhiễm thời gian khác Hình Chồi tái sinh thời gian lây nhiễm khác Hình Vi khuẩn mọc thời gian đồng nuôi cấy Hình Chồi tái sinh đồng nuôi cấy môi trường khác Hình 10 Hình ảnh kết nhuộm gen gus Hình 11 Chồi tái sinh môi trường có nồng độ BAP IAA khác DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BA: 6-Benzyl Adenine BAP: 6-Benzyl Adenopurine IAA: indol-3-acetic acid 2-ip: 2-isopentenyl-adenine NAA: Napthaleneacetic acid 2,4-D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid Ki: Kinetin MS: Murashige and Skoog, 1962 LB: Luria-Bertani medium AS: Acetosyringone CT: Công thức ĐC: Đối chứng X-gluc: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide TÓM TẮT Từ lâu chọn tạo giống không hat giới nước ta tiến hành thu sản phẩm không hạt đáp ứng nhu cầu thị trường Tuy nhiên chuyển gen thông qua Agrobacterium tạo không hạt cam quýt nghiên cứu nước ngoài, thu không hạt ổn định không làm ảnh hưởng đến chất lượng Vì mục tiêu đề tài bước đầu tìm hiểu xây dựng quy trình chuyển gen tạo không hạt cho quýt Đường canh Đoạn trụ mầm (epicotyl) dùng làm mẫu cấy lây nhiễm với dung dịch vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 mang plasmid chứa gen mẫn cảm auxin rolB kết hợp với promotor hoạt động đặc thù bầu nhụy Kết thu từ thí nghiệm cho thấy yếu tố ảnh hưởng đến biến nạp vi khuẩn thời gian lây nhiễm, thời gian đồng nuôi cấy, ảnh hưởng hợp chất Acetosyringone (AS) bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy, ảnh hưởng môi trường đồng nuôi cấy; ảnh hưởng hormon đến khả tái sinh mẫu cấy Kết thu sau: thời gian lây nhiễm 20 phút, thời gian đồng nuôi cấy ngày, nồng độ AS không, môi trường đồng nuôi cấy MS + mg/L BAP + 0.5 mg/L Ki + mg/L NAA + g/L agar + 30 g/L Sucrose pH 5.7 điều kiện tốt cho phát triển mẫu cấy tạo chồi Sự tái sinh thành chồi chuyển gen cao áp dụng mg/L BAP 0.2 mg/L IAA môi trường MS Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây ăn chi Citrus có giá trị cao mặt dinh dưỡng đứng thứ sau chuối tầm quan trọng có ý nghĩa kinh tế Việt Nam Nhưng hạt có múi đặc điểm không mong muốn, làm giảm chất lượng thương phẩm tính tiện lợi cho người tiêu dùng tươi công nghiệp chế biến Vì chọn tạo không hạt có múi thông qua chuyển gen giới nghiên cứu từ lâu Tuy nhiên vấn đề đề cập đến Việt Nam từ vài năm vấn đề cấp thiết nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường Tạo không hạt phương pháp chọn tạo giống truyền thống có phương pháp khác lai xa, tạo tam bội không hạt, xử lý đột biến colchicine, dùng chất kích thích sinh trưởng, chọn lọc đột biến tự nhiên… Tuy nhiên phương pháp thường tốn nhiều thời gian, không định hướng đột biến nên kết thấp không ổn định Bình thường sau thụ phấn thụ tinh tạo hợp tử, hợp tử sinh auxin kích thích tế bào bầu nhụy phân chia, bầu nhụy lớn lên tạo thành Như có thụ tinh có Tuy nhiên số giống vô phối tạo không qua thụ tinh, thường bị thui non cần phải phun bổ sung auxin ngoại sinh để tạo nuôi Nhờ phát triển công nghệ chuyển gen, người ta tách nhiều gen từ loại sinh vật khác Trong có gen mẫn cảm auxin rolB từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, gen gắn với promoter INO từ thực vật hoạt động đặc thù bầu nhụy Khi tổ hợp gen rolB-INO hoạt động, cần lượng auxin nhỏ sản xuất kích thích để bầu nhụy phân chia lớn lên thành Công nghệ thành công đối tượng cà chua, cà, thuốc họ cam quýt giới Nhưng Việt Nam chưa có nghiên cứu tiến hành, liệu tiếp bước thành tựu tạo không hạt nước không? Vì thực đề tài: “Xây dựng quy trình chuyển gen mẫn cảm auxin hoạt động đặc thù bầu nhụy vào giống quýt Đường Canh (Citrus reticulata) thông qua Agrobacterium tumefaciens tạo không hạt” 1.2 Mục đích, yêu cầu 1.2.1 Mục đích Chuyển gen rolB mẫn cảm auxin tạo không hạt giống quýt Đường canh 1.2.2 Yêu cầu • Xây dựng quy trình chuyển gen vào quýt Đường canh • Xác định thời gian đồng nuôi cấy thích hợp • Xác định thời gian lây nhiễm mẫu thích hợp • Ảnh hưởng Acetosyringone tới khả biến nạp vi khuẩn • Xác định môi trường đồng nuôi cấy cho vi khuẩn chuyển gen tốt • Xác định nồng độ chất kích thích sinh trưởng thích hợp cho tái sinh chồi • Sử dụng chất X-gluc để phát nhanh vật liệu chuyển gen có chứa gen gus Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung quýt Quýt loại chứa nhiều khoáng chất, vitamin, cần cho sức khỏe người, giúp chống lão hóa, kéo dài tuổi thọ, tăng sức đề kháng chống chịu bệnh tật Theo Hoàng Ngọc Thuận, (2000) loại cam quýt nói chung thành phần thịt có chứa 6-12% đường (chủ yếu đường saccaroza), hàm lượng vitamin C có từ 40-90 mg/100g tươi, axit hữu từ 0.4-1.2%, có nhiều chất có hoạt tính sinh học cao với chất khoáng dầu thơm Quả quýt dùng để ăn tươi, làm mứt, chế nước giải khát chữa bệnh Tinh dầu cất từ vỏ quả, lá, hoa dùng nhiều công nghiệp thực phẩm mỹ phẩm Các loại thuộc chi Citrus dùng nhiều y học dân tộc nhiều quốc gia giới Theo Lê Quý Đôn viết “Vân đài loại ngữ”: “Quýt vàng thượng phẩm, quýt đỏ, quýt vá, quýt cát hạ phẩm, vỏ quýt có tính khoan trung, hạ khí, hạ đờm tiêu ích…” Hải Thượng Lãn Ông sử dụng nhiều quýt non phơi khô thuốc Từ kỷ thứ XVI, thầy thuốc Trung Quốc, Ấn Độ tìm thấy tác dụng phòng ngừa bệnh dịch hạch, trị bệnh phổi chảy máu da loại cam quýt Ở Mỹ, năm 1938 nhà khoa học sử dụng kết hợp cam quýt với insulin chữa bệnh đái tháo đường Ở nước Nga việc sử dụng loại có múi y học dân gian kỷ XI Quýt ăn lâu năm, tương đối dễ trồng, kén chọn đất, loại ăn có suất ổn định Trên giới quýt trồng 100 nước, chủ yếu nước nhiệt đới nhiệt đới, năm 2001 sản suất khoảng 100 triệu diện tích chiếm 7,2 triệu Các nước xuất cam quýt bao Bảng Ảnh hưởng BAP IAA đến khả tái sinh chồi quýt Đường canh CT BAP IAA (mg/l) (mg/l) Thời gian theo dõi Tỷ lệ Tỷ lệ mẫu chồi (%) sống (%) Số chồi/ mẫu (chồi) Ghi tuần tuần tuần tuần tuần tuần ĐC 0 86.1 8.3 11.1 11.1 - 1 83.3 11.1 16.6 19.5 1.5 + 2 86.1 8.3 16.6 19.5 1.5 + 3 83.3 22.2 30.6 30.6 1.6 +++ 0.2 80.6 11.1 22.2 27.7 1.3 ++ 0.2 89.0 16.6 30.6 38.9 2.1 +++ 0.2 80.6 8.3 16.6 25.0 1.6 ++ Môi trường sử dụng : MS + g/L agar + 30g/L sucrose, pH 5.7 Chú thích : - : Chồi nhỏ, yếu, mẫu cấy chuyển màu vàng nhạt + : Chồi nhỏ, yếu, mẫu cấy xanh nhạt + + : Chồi sinh trưởng chậm, nhỏ, mẫu cấy xanh + + + : Chồi xanh, sinh trưởng tốt, hình thái bình thường, mẫu cấy xanh Kết bảng cho thấy : • Nếu môi trường có ổ sung hormon sinh trưởng cho tỷ lệ sống 80%, mẫu cấy xanh Còn công thức đối chứng không bổ sung hormon sinh trưởng tỷ lệ mẫu sống 86.1%, chồi nhỏ yếu, mẫu cấy vàng nhạt Nồng độ 2mg/L BAP 0.2 mg/L IAA cho tỷ lệ mẫu sống cao (89%) • Trong môi trường nuôi cấy không bổ sung 0.2 mg/L IAA, sử dụng nồng độ BAP khác cho tỷ lệ tái sinh chồi khác Khi không bổ sung với lượng nhỏ BAP từ – mg/L tỷ lệ mẫu chồi thấp (11.1 - 19.5%) Với nồng độ BAP mg/L cho kết chồi tái sinh cao chiếm 30.6%, chồi xanh, sinh trưởng tốt, hình thái bình thường Như BAP có tác dụng kích thích phân hóa chồi nồng thích hợp 3mg/L • Khi kết hợp BAP nồng độ khác với nồng độ nhỏ 0.2 mg/L IAA, kết cho thấy tái sinh chồi khác Nồng độ BAP thấp (1mg/L) cao (3mg/L) cho khả tái sinh chồi (27.7 25.0 %) kết hợp với mg/L BAP cho hiệu tái sinh chồi cao nhiều 38.9% • Kết hợp hai nồng độ BAP 2mg/L IAA 0.2 mg/L cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao mà số chồi trung bình mẫu (2.1 chồi) lớn nồng độ nghiên cứu khác, cho chồi xanh, sinh trưởng bình thường Mẫu công thức đối chứng không bổ sung hormon công thức mg/L BAP; mg/L BAP; mg/L BAP + 0.2 mg/L IAA cho tỷ lệ chồi thấp mà số chồi trung bình mẫu thấp (1 – 1.5 chồi), chồi nhỏ yếu Như kết hợp 2mg/L BAP 0.2 mg/L IAA môi trường MS cho hiệu tái sinh chồi cao Khi kết hợp BAP nồng độ cao thấp với 0.2 mg/L IAA ức chế hình thành phát triển chồi Vì môi trường tái sinh chọn lọc môi trường MS bổ sung 2mg/L BAP 0.2 mg/L IAA tốt quýt Đường Canh mg/L BAP mg/L BAP + 0.2 mg/L IAA mg/L BAP + 0.2 mg/L IAA mg/L BAP + 0.2 mg/L IAA mg/L BAP mg/L BAP Hình 11 Chồi tái sinh môi trường có nồng độ BAP IAA khác Qua kết nghiên cứu thí nghiệm trên, đưa quy trình chuyển gen mẫn cảm auxin nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo không hạt quýt Đuờng canh sau : Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1.Kết luận Từ kết thu trình thực đề tài này, rút số kết luận sau đối tượng quýt Đường canh: • Thời gian thích hợp để lây nhiễm vi khuẩn với mẫu cấy 20 phút • Thời gian đồng nuôi cấy tốt ngày • Không cần phải bổ sung hợp chất Acetosyringone môi trường đồng nuôi cấy dung dịch lây nhiễm • Môi trường đồng nuôi cấy thích hợp MS + mg/L BAP + 0.5 mg/L Ki + mg/L NAA + g/L agar + 30g/L Sucrose pH 5.7 • Môi trường tái sinh thích hợp cho tạo chồi đạt hiệu cao MS + mg/L BAP + 0.2 mg/L IAA + g/L agar + 30g/L sucrose, pH 5.7 Bổ sung 30mg/L gentamycin, 300 mg/L cefotaxim • Đã kiểm tra chuyển gen vi khuẩn hợp chất X-GLUC không thấy biểu gen gus Tuy nhiên điều chưa thể khẳng định chuyển gen hay chưa có khả gen chuyển không biểu • Đã đưa quy trình chuyển gen đối tượng quýt Đường canh thông qua Agrobacterium tumefaciens 5.2 Đề nghị • Tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện quy trình chuyển gen • Đây kết bước đầu để xây dựng quy trình tạo chồi chuyển gen Tuy nhiên chưa tìm thấy hoạt động gen thị chồi chuyển Cần tiến hành thí nghiệm số lượng mẫu nhiều (khoảng 100 mẫu cấy / công thức) kết xác tốt • Tiếp tục phân tích mức độ phân tử: Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi xác định có mặt gen gus gen rolB, phản ứng southern blot để khẳng định chắn biểu gen • Cần tiếp tục làm theo hướng vi ghép chồi chuyển gen lên gieo từ hạt phòng thí nghiệm để thu chuyển gen hoàn chỉnh TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt • Đường Hồng Dật, “Nghề làm vườn – Cây ăn miền”, NXB Văn hóa dân tộc • GS TS Nguyễn Quang Thạch (chủ biên), TS Nguyễn Thị Lý Anh, TS Nguyễn Phương Thảo, 2005, Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp Nxb Nông nghiệp.Trang 86 – 96 • Hoàng Ngọc Thuận, “Kỹ thuật chọn tạo trồng cam quýt phẩm chất tốt, suất cao”, NXB Nông nghiệp • Trần Thế Tục, Cao Anh Long, Phạm Văn Côn, Hoàng Ngọc Thuận, Đoàn Thế Lư, 1998, Giáo trình ăn quả.Nxb Nông nghiệp Trang 108 • Đỗ Năng Vịnh cộng 2005 “Nghiên cứu chọn tạo giống hạt từ giống cam sành, cam vân du, bưởi phúc trạch, quýt chum” Báo cáo tổng kết khoa học • Đỗ Năng Vịnh, 2005 “Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng” NXB Nông nghiệp Hà Nội, 2005 Tài liệu tiếng Anh • Acciarri, N., F Restaino, G Vitelli, D Perrone, M Zottini, T Pandolfini, A Spena and G.L Rotino 2002 Genetically modified parthenocarpic eggplants: improved fruit productivity under both greenhouse and open field cultivation BMC Biotechnology 2: • Almeida Weliton Antonio Bastos, Francisco de Assis Alves Mourao Filho, Beatriz Madalena Januzzi Mendex, Alexandra Pavan, Adriana Pinherio Martinelli Rodriguez, 2003, Agrobacterium – mediated transformation of Citrus sinensis and Citrus limonia epicotyl segments Scientia Agricola, v.60, n.1, p 23 – 29, Jan./Mar.2003 • BOND, J.E.; ROOSE, M.L Agrobacterium-mediated transformation of the commercially important citrus cultivar Washington navel orange Plant Cell Reports, v.18, p.229-234, 1998 • CERVERA, M.; NAVARRO, L.; PEÑA, L Agrobacterium–mediated transformation of citrange: factors affecting transformation and regeneration Plant Cell Reports, v.18, p.271-278, 1998a • Dandekar lectures, 2009 part Agrobacterium-Mediated Plant Transformation • Deng X.X 2000 Citrus cultivars released during the past 10 years in China, Proceeding of the International Society of Citriculture, Orlando, Florida December – 7, Vol (I), pp 85 – 88 • Duan Yang – Xin, Xin Liu, Jing Fan, Ding – Li Li, Reng – Chao Wu, Wen – Wu Gou, Multiple shoot induction from seedling epicotyls and transgenic citrus plant regeneration contain the green fluorescent protein gene, Botanical Studies (2007) 48: 165 – 171 • García-Luis A, Fornes F, Guardiola JL 1986 Effects of gibberellin A3 and cytokinins on natural and post-harvest, ethylene-induced pigmentation of Satsuma mandarin peel Physiologia Plantarum 68, 271–274 • • Gillaspy, G., H Ben-David and W Gruissem 1993 Fruits: A developmental perspective Plant Cell 5:1439-1451 • Gmitter L.G, Ling X.B and Ding X.X 1990 Induction of triploid citrus plants from endosperm calli in vitro Theor Appl Genet No 80, pp 785 – 790 • Gmitter F.G 1995 Germplasm, Genetics and Biotechnology for mandarin cultivar development Symposium sur Mandarines – au 11 mars, Corse, France- INRA: 11 • Henzi1M X, Christey1M C and McNeil2D L , Factors that influence Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of broccoli (Brassica oleracea L var italica) 2000 • Khawale R N., Singh S K, Garg G., Barnwal V K., Alizadeh Ajirlo S., 2006, Agrobacterium – mediated genetic transformation of Nagpur mandarin (Citrus reticulate Blanco) Current science Vol 91 No 12, 25 December 2006 • Kobayashi S Ogawara T, Saito W., Nakamura Y., and Amura M 1997 Production of triploid somatic hybrid in citrus, J Jpn Soc Hort Sci 66, pp 453 – 458 • Li D D., Shi W., Deng X X., 2003, Factor influencing Agrobacterium – mediated embryogenic callus transformation of Valencia sweet orange (Citrus sinensis) containg the pTA29 – barnase gene Tree Physiology, 23, 1209 – 1215 November 2003 • Luth1 Diane and Moore2 Gloria, 2004 Transgenic grapefruit plants obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation • Martinelli Federico, Sandra L Uratsu, Russell L Reagan, Ying Chen, David Tricoli, Oliver Fiehn, David M Rocke, Charles S Gausser, Abhaya M Dandekar, 2009, Gen regulation in parthenocarpic tomato fruit Jounal of Experimental Botany, Vol 60, No 13, pp 3873 – 3890, 2009 • PEÑA, L.; CERVERA, M.; JUAREZ, J.; ORTEGA, C.; PINA, J.A.; DURÁN-VILA, N.; NAVARRO, L High efficiency Agrobacterium-mediated transformation and regeneration of citrus Plant Science, v.104, p.183-191, 1995a • PENA L., Cervera M., Fagoaga C., Perez R., Romero J., Juarez J., Pina J A., Navarro L (2003), Agrobacterium – meadiated transformation of citrus • Pena Leandro, Rosa M Perez, Magdalena Cervera, Jose A Juarez, Luis Navarro, 2004, Early Events in Agrobacterium – meadiated Genetic transformation of Citrus explants Annals of Botany 94: 67 – 74, 2004 • Rotino, G.L., E Perri, M Zottini, H Sommer and A Spena 1997 Genetic engineering of parthenocarpic plants Nature Biotechnology 15: 1398-1401 • Talon, M., L Zacarias and E Primo-Millo 1992 Gibberellins and parthenocarpic ability in developing ovaries of seedless mandarins Plant Physiol 99:1575-1581 • Varoquaux, F., R Blanvillain, M Delseny and P Gallois 2000 Less is better: new approaches for seedless fruit production TIBTECH 18: 233-242 • Yu, C., S Huang, C Chen, Z Deng, P Ling, and F.G Jr Gmitter 2002 Factors affecting Agrobacterium-mediated transformation of sweet orange and citrange Plant Cell Tiss Org Cult 71: 147-155 PHỤ LỤC KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ CHỒI/MẪU THÍ NGHỊEM BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOCHOI FILE CHOILY1 3/ 8/10 23:11 :PAGE VARIATE V003 SOCHOI LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 1.82000 606667 182.00 0.000 * RESIDUAL 266667E-01 333333E-02 * TOTAL (CORRECTED) 11 1.84667 167879 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE CHOILY1 3/ 8/10 23:11 :PAGE MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ DC CT1 CT2 CT3 NOS 3 3 DF SOCHOI 1.00000 1.50000 2.06667 1.30000 SE(N= 3) 0.333333E-01 5%LSD 8DF 0.108697 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE CHOILY1 3/ 8/10 23:11 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE SOCHOI GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 1.4667 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.40973 0.57735E-01 3.9 0.0000 | | | | KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ CHỒI/MẪU THÍ NGHIỆM BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI/MAU FILE TN2CHOIL 3/ 8/10 22:54 :PAGE VARIATE V004 CHOI/MAU LN SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 605625 201875 38.76 0.000 * RESIDUAL 416668E-01 520834E-02 * TOTAL (CORRECTED) 11 647292 588447E-01 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN2CHOIL 3/ 8/10 22:54 :PAGE MEANS FOR EFFECT CT$ DC CT1 CT2 CT3 SOURCE OF VARIATION CT$ NOS 3 3 DF CHOI/MAU 1.00000 1.58333 1.30000 1.50000 SE(N= 3) 0.416667E-01 5%LSD 8DF 0.135871 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN2CHOIL 3/ 8/10 22:54 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE CHOI/MAU GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 1.3458 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.24258 0.72169E-01 5.4 0.0001 | | | | KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ CHỒI/MẪU TN3 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI/MAU FILE CHOITN3 3/ 8/10 22:51 :PAGE VARIATE V004 CHOI/MAU LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 302500 100833 30.25 0.000 * RESIDUAL 266667E-01 333334E-02 * TOTAL (CORRECTED) 11 329167 299242E-01 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE CHOITN3 3/ 8/10 22:51 :PAGE MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ DC CT1 CT2 CT3 NOS 3 3 DF CHOI/MAU 1.00000 1.43333 1.30000 1.30000 SE(N= 3) 0.333334E-01 5%LSD 8DF 0.108697 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE CHOITN3 3/ 8/10 22:51 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE CHOI/MAU GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 1.2583 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.17299 0.57735E-01 4.6 0.0002 | | | | KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ CHỒI/MẪU THÍ NGHIỆM BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOCHOI FILE TN4CHOI 2/ 8/10 11:42 :PAGE VARIATE V003 SOCHOI LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 510556 255278 36.76 0.001 * RESIDUAL 416667E-01 694445E-02 * TOTAL (CORRECTED) 552222 690278E-01 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN4CHOI 2/ 8/10 11:42 :PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 DF SOCHOI 1.00000 1.30000 1.58333 SE(N= 3) 0.481125E-01 5%LSD 6DF 0.166429 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN4CHOI 2/ 8/10 11:42 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE SOCHOI GRAND MEAN (N= 9) NO OBS 1.2944 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.26273 0.83333E-01 6.4 0.0007 | | | | KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ CHÔI/MÃU THÍ NGHIỆM BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOCHOI FILE TN5LYH2 2/ 8/10 0:15 :PAGE VARIATE V003 SOCHOI LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 2.17843 363071 52.04 0.000 * RESIDUAL 14 976670E-01 697622E-02 * TOTAL (CORRECTED) 20 2.27610 113805 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN5LYH2 2/ 8/10 0:15 :PAGE MEANS FOR EFFECT CT$ DC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT$ NOS 3 3 3 DF SOCHOI 1.00000 1.55333 1.55333 1.64000 1.30333 2.13333 1.67000 SE(N= 3) 0.482225E-01 5%LSD 14DF 0.146269 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN5LYH2 2/ 8/10 0:15 :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE SOCHOI GRAND MEAN (N= 21) NO OBS 21 1.5505 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.33735 0.83524E-01 5.4 0.0000 | | | | [...]... những cố gắng để tạo ra bằng được quả không hạt, không qua quá trình thụ phấn hoặc thụ tinh tạo thành công nhiều giống dưa hấu không hạt, nho khô không hạt, cà và cà chua không hạt bằng công nghệ chuyển gen và đã chứng tỏ được khả năng của thao tác di truyền để hiện thực mong muốn này (Varoquaux và cộng sự, 2000) Vấn đề cơ bản của công nghệ chuyển gen là phải làm sao tạo được quả không hạt nhưng vẫn duy... pháp chuyển gen trực tiếp qua ống phấn • Phương pháp chuyển gen nhờ súng bắn gen • Chuyển gen trực tiếp vào protoplas • Phương pháp chuyển gen nhờ siliconcacbit • Các phương pháp chuyển gen gián tiếp: • Phương pháp chuyển gen nhờ virus • Phương pháp chhuyển gen thông qua Agrobacterium 2.2.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens có khả năng xâm... thích bầu nhuy phát triển thành quả Sơ đồ dưới đây nêu quá trình phát triển của quả hạt bình thường và các hướng chiến lược tạo quả không hạt (hình 3) Parthenocarpy Stenospermocarpy Hình 3 Chiến lược tạo quả không hạt Trong tự nhiên có hai quá trình xẩy ra có thể tạo được quả không hạt đó là: 1) hiện tượng vô phối hay trinh sản (parthenocarpy) là hiện tượng quả phát triển không cần xẩy ra quá trình. .. bội tạo dòng tam bội không hạt cũng được tác giả và cộng sự thực hiện Trường Đại học Thái nguyên do PGS.TS Ngô Xuân Bình đang thực hiện đề tài chọn tạo giống cây citrus không hạt bằng gây tạo và chọn lọc các dòng đột biến bất dục cái Việc nghiên cứu tạo giống cam chanh quýt bưởi bằng chuyển gen sản sinh và mẫn cảm auxin nhằm tạo quả không hoặc ít hạt chưa được tiến hành ở Việt Nam 2.4 Các nghiên cứu chuyển. .. làm cho quả của các giống này không hoặc có ít hạt Trong số các giống đang trồng hiện nay có một số giống có tính vô phối không hạt như Satsuma B.S (Mỹ), Cam Navel (Mỹ), giống Persian lime (Mỹ), các giống này nếu trồng cách ly thì hoàn toàn không có hạt, nếu trồng xen với giống khác thì có ít hạt đến không hạt như giống Persian lime, chúng đều có đặc điểm bất dục đực, do hạt bị teo đi hoặc không có... còn phát hiện một số giống trong điều kiện trồng cách ly và trồng xen đều có ít hạt như giống cam Hamlin có 2.0 - 2,8 hạt /quả, cam Valencia Olinda (2,0 - 3,2 hạt /quả) , cam Đường canh (2,0 – 5,96 hạt /quả) Trong điều kiện trồng xen bưởi Năm Roi có trung bình 0,4 hạt /quả, cam Sông con có 2,5 hạt /quả và quýt Chum có 6,2 hạt /quả Tuy nhiên các giống trên đều có nguồn gốc từ nước ngoài, vào Việt nam chưa thích... hạt trên cam Valencia thông qua biến nạp Agrobacterium của callus phát sinh phôi với plasmid chứa promoter pTA29-barnase hoạt động đặc thù ở tầng nuôi và sự hoạt đông kết hợp với gen barnase sẽ phá vỡ tế bào tầng nuôi trong suốt quá trình phát triển của bao phấn tạo hạt phấn bất dục hoặc thiếu hạt phấn kết quả là tạo quả không hạt 2.3.2 Các nghiên cứu trong nước Các giống cây ăn quả hiện trồng ở nước... thước và khối lượng quả Vì thế vấn đề đặt ra đối với cây họ cam quýt là làm sao tạo được quả không hạt bằng cách kích thích tạo tính vô phối mà không cần thụ phấn bổ sung và như thế sẽ không ảnh hưởng đến tỷ lệ đậu quả, kích thước và khối lượng quả Hoạt động của các chất điều tiết sinh trưởng có trong bầu nhụy đóng vai trò quan trọng làm kích thích quá trình kết quả và phát triển của quả sau thụ phấn... 1997) Những cây chuyển gen đã tạo được quả không hạt mà không cần thụ tinh thậm trí ngay cả ở điều kiện môi trường khó khăn cho quá trình kết quả so với cây không được chuyển gen Chứng tỏ có sự tăng cường việc tổng hợp auxin trong bầu nhụy xẩy ra ở giai đoạn phát triển sớm, với lượng đủ lớn để có thể thay thế được việc thụ tinh, cho phép quả phát triển tiếp tục trong khi không có quá trình thụ tinh... còn có vùng vir gồm 6 nhóm từ virA đến virG chứa các gen chịu trách nhiệm hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp và phân giải opine Cơ chế chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens: Khi tế bào thực vật bị thương tiết ra các hợp chất kích thích gen virA và virG vùng gen vir của T-plasmid hoạt động Gen virA tạo nên protein thụ cảm kết hợp hợp chất của gen virG đi đến màng tế bào nhận tín hiệu từ tế bào ... thực đề tài: Xây dựng quy trình chuyển gen mẫn cảm auxin hoạt động đặc thù bầu nhụy vào giống quýt Đường Canh (Citrus reticulata) thông qua Agrobacterium tumefaciens tạo không hạt 1.2 Mục đích,... Mục đích, yêu cầu 1.2.1 Mục đích Chuyển gen rolB mẫn cảm auxin tạo không hạt giống quýt Đường canh 1.2.2 Yêu cầu • Xây dựng quy trình chuyển gen vào quýt Đường canh • Xác định thời gian đồng nuôi... tra gen gus không thấy biểu gen Có thể xảy hai khả là: không chuyển gen vào mô tỷ lệ chuyển gen thấp mà số chồi tạo mang kiểm tra lại ít, hai khả gen chuyển vào không hoạt động hay số copy chuyển