BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE TRONG TRẤU ĐANG HOẠI MỤC Cán hướng dẫn Sinh viên thực PGs.Ts: NGUYỄN HỮU HIỆP NGUYỄN THỊ DIỆU HIỀN ThS VÕ VĂN SONG TOÀN Lớp: KH0566A1 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học Năm 2009 LỜI BẢN QUYỀN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu thân hai thầy hướng dẫn thầy PGs Ts Nguyễn Hữu Hiệp ThS Võ Văn Song Toàn Các số liệu, kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố luận văn trước Cán hướng dẫn Tác giả luận văn PGs Ts Nguyễn Hữu Hiệp Nguyễn Thị Diệu Hiền Cán đồng hướng dẫn ThS Võ Văn Song Toàn TRANG HỘI ĐỒNG KÝ TÊN Luận văn đính kèm theo đây, với tên đề tài: “Phân lập số dòng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose trấu hoại mục” Nguyễn Thị Diệu Hiền thực báo cáo hội đồng chấm luận văn thông qua Ủy viên Phản biện (ký tên) (ký tên) Cần Thơ, ngày tháng năm 2009 Chủ tịch hội đồng (ký tên) LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận văn Tốt Nghiệp Đại Học này, cố gắng thân tôi, có giúp đỡ, quan tâm nhiều quý thầy cô, bạn bè người Xin kính gửi: Lời cảm ơn sâu sắc đến Cha, Mẹ, người nuôi dưỡng, dạy bảo cho học ngày Lời cảm tạ chân thành đến thầy Nguyễn Hữu Hiệp thầy Võ Văn Song Toàn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện cung cấp tài liệu thiết thực hữu ích cho trình nghiên cứu, thực đề tài cách thuận lợi, để hoàn thành luận văn tốt nghiệp theo thời gian qui định Lời biết ơn đến Ban Giám Đốc quý thầy cô Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Cần Thơ tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu suốt trình thực đề tài Lời chân thành cảm ơn đến cán phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật, phòng Sinh Hóa, phòng Công nghệ Enzyme phòng Vi Sinh Thực Phẩm, đặc biệt chị Nguyễn Thị Phương Tâm chị Nguyễn Thị Xuân Dung truyền đạt kinh nghiệm, tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình thực đề tài Lời chân thành biết ơn đến quý thầy cô tham gia giảng dạy lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 31 truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt thời gian học trường Lời cảm ơn đến bạn lớp giúp đỡ, đóng góp ý kiến, giúp suốt thời gian học Đại học vừa qua Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2009 Sinh viên Nguyễn Thị Diệu Hiền TÓM LƯỢC Chúng phân lập 28 dòng vi khuẩn có đất trấu họai mục, có 14 dòng phát triển điều kiện hiếu khí 14 dòng phát triển điều kiện kỵ khí Đa số dòng phát triển nhanh môi trường có agar, dòng hiếu khí phát triển nhanh dòng kỵ khí sau 24 Trong số 28 dòng phân lập có 18 dòng vi khuẩn có nguồn gốc từ đất (đất trấu) 10 dòng vi khuẩn phân lập từ trấu hoại mục Trong 14 dòng vi khuẩn hiếu khí có 10 dòng có khả phân hủy cellulose kiểm tra phản ứng sinh hóa Có dòng vi khuẩn kỵ khí không tạo vùng sáng trắng xung quanh khuẩn lạc sau ngày nuôi cấy thử nghiệm môi trường có bổ sung Congo red Kết điện di mẫu protein từ dịch trích enzim thô dòng vi khuẩn hiếu khí có họat tính cellulase cho thấy có band protein 2H5, 8H2 10H1 khoảng trọng lượng từ 53,15KDa đến 64,89 KDa Ngoài ra, có nhiều band protein mờ vị trí khác, cần tiến hành nghiên cứu tiếp qui trình trích ly điện di thời gian tới Chúng chọn dòng vi khuẩn (2H5, 4H6, 8H2, 10H1 10H2) có họat tính cellulase mạnh 14 dòng vi khuẩn hiếu khí Trong đó, dòng 10H1(có nguồn gốc từ đất) dòng có hoạt tính cellulase mạnh (0,35U) có tiềm ứng dụng sản xuất chế phẩm enzyme, góp phần vào sử lý rác thải nông nghiệp đặc biệt trấu, giải tình trạng ô nhiễm môi trường Từ khóa: Trấu, vi khuẩn phân hủy cellulose, vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn kỵ khí, hoạt tính cellulase MỤC LỤC LỜI BẢN QUYỀN TRANG HỘI ĐỒNG KÝ TÊN LỜI CẢM TẠ TÓM LƯỢC BẢNG KÍ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỤC LỤC Phần I: ĐẶT VẤN ĐỀ Phần II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU I Tổng quan trấu enzim cellulase Tổng quan trấu 2 Giới thiệu cellulose enzim cellulase Cơ chế trình phân hủy cellulose .3 a Cơ chế trình oxy hóa cellulose (phân hủy hiếu khí) b Cơ chế trình phân hủy cellulose điều kiện kỵ khí 4 Vi sinh vật phân hủy cellulose a Các vi sinh vật phân hủy cellulose điều kiện hiếu khí b Những vi sinh vật phân hủy cellulose điều kiện kỵ khí Sơ lược số phương pháp sinh hóa a Định lượng hàm lượng protein phương pháp Bradford (1976) b Định lượng đường khử phương pháp Nelson (1994) .5 c Phương pháp điện di gel SDS-PAGE II Tình hình nghiên cứu nước giới Tình hình nghiên cứu nước .6 Tình hình nghiên cứu giới Phần III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I Phương tiện thí nghiệm Thời gian địa điểm tiến hành thí nghiệm Phương tiện thí nghiệm a Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm b Vật liệu thí nghiệm c Hóa chất II Phương pháp nghiên cứu .9 Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn 10 a Phân lập vi khuẩn 10 b Nhuộm Gram vi khuẩn .13 c Quan sát mô tả hình dạng khả chuyển động vi khuẩn 14 Thí nghiệm 2: Khảo sát thủy phân vi khuẩn hiếu khí đường kính thuỷ phân 15 a Khảo sát thủy phân cellulose vi khuẩn môi trường có Congo red 15 b Đếm mật số tế bào vi khuẩn 16 Thí nghiệm 3: Khảo sát hàm lượng protein dịch nuôi vi khuẩn phương pháp Bradford (1976) 16 Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính enzim cellulase phương pháp Nelson (1994) 19 Thí nghiệm 5: Khảo sát trọng lượng phân tử protein dịch nuôi vi khuẩn phương pháp điện di SDS – PAGE 21 Phần IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 I Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn 23 Phân lập vi khuẩn 23 Nhuộm Gram vi khuẩn 24 Mô tả vi khuẩn, khuẩn lạc 25 II Thí nghiệm 2: Khảo sát thủy vi khuẩn hiếu khí đường kính thuỷ phân 28 III Thí nghiệm 3: Khảo sát hàm lượng protein dịch nuôi vi khuẩn phương pháp Bradford (1976) .32 IV Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính cellulase phương pháp Nelson (1994) 34 V Thí nghiệm 5: Khảo sát trọng lượng phân tử protein dịch nuôi vi khuẩn phương pháp điện di SDS-PAGE 37 Phần V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 I Kết luận .39 II Đề nghị .39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC 1: HÓA CHẨT THÍ NGHIỆM i PHỤ LỤC 2: SỐ LIỆU THỐNG KÊ ii BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT APS: Amonium persulphat BSA: Bovine serum albumin CBB: Coomassie Brilliant Blue G250 Cellulase C1 : có hoạt tính exocellulase , cắt thể cellulose thành dạng Cellulase Cx : có hoạt tính endocellulase exocellulase , thủy phân bên cellulose thành cellobiose CFU: Colony forming unit CMC: Carboxymethyl-cellulose CMCase : Enzyme carboxymethyl cellulase CNT: carbon nanotubes DS: Degree of substitution HL protein: Hàm lượng protein KDa: Kilodalton Na-CMC : Sodium carboxymethyl cellulose OD: Optical density PI: Isoelectric points Rpm: Revolutions per minute SDS: Sodium dodecyl sulfat SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TEMED: Tetramehtylethyenediamine DANH MỤC BẢNG Bảng số Tựa bảng Trang Bảng Thành phần môi trường CMC phân lập vi khuẩn Bảng Thành phần môi trường CMC trích ly enzyme cellulase Bảng Bảng tóm tắt trình nhuộm Gram 14 Bảng Nguồn gốc mẫu 23 Bảng Kết nhuộm Gram 14 dòng vi khuẩn hiếu khí 25 Bảng Kết nhuộm Gram 14 dòng vi khuẩn kỵ khí 25 Bảng Mô tả hình dạng khuẩn lạc 26 Bảng Kết đo đường kính vòng thuỷ phân vi khuẩn hiếu khí 29 Bảng Đường kính thuỷ phân sau ngày ủ vi khuẩn hiếu khí 29 Bảng 10 Kết đo đường kính vòng thuỷ phân vi khuẩn kỵ khí 30 Bảng 11 Đường kính thuỷ phân sau ngày ủ vi khuẩn kỵ khí 30 Bảng 12 Kết đo OD 595nm mẫu protein chuẩn 32 Bảng 13 Kết đo OD 595nm mẫu protein 33 Bảng 14 Kết thống kê số hàm lượng protein dòng vi khuẩn hiếu khí 33 Bảng 15 Kết đo mật số vi khuẩn 33 Bảng 16 Kết đo OD bước sóng 520nm đường chuẩn glucose 35 Bảng 17 Hàm lượng đường khử dịch nuôi vi khuẩn hiếu khí sau ngày 36 Bảng 18 Hoạt tính cellulase dịch nuôi vi khuẩn sau ngày 36 Bảng 19 Số liệu vẽ đường biểu diễn log protein chuẩn 37 Bảng 20 Trọng lượng phân tử protein dịch trích enzim vi khuẩn hiếu khí 38 Luận văn tốt nghiệp- 2009 Công nghệ sinh hoc K31 Bảng 13: Kết đo OD 595nm mẫu protein Dòng VK 1H5 2H5 3H2 4H6 8H2 10H1 10H2 ODLần 0,369 0,432 0,359 0,500 0,487 0,519 0,602 ODLần 0,414 0,462 0,354 0,455 0,441 0,515 0,648 ODLần 0,462 0,492 0,373 0,542 0,530 0,507 0,676 ODTB 0,415 0,462 0,362 0,499 0,486 0,514 0,642 Bảng 14: Kết thống kê hàm lượng protein dòng vi khuẩn hiếu khí Dòng VK HL 1H5 2H5 3H2 4H6 8H2 10H1 10H2 protein (µg/ml) 29,423cd 33,244bc 25,114 d 36,252b 35,195b 37,472 b 47,878a Ghi chú: Các giá trị có chữ khác biệt không ý nghĩa, mức độ ý nghĩa 5% Số liệu bảng giá trị trung bình hai lần lặp lại Bảng 15: Kết đo mật số vi khuẩn Mật số VK ban đầu (CFU Mật số VK sau ngày ủ (CFU /µl) /µl) 1H5 4,55 x 10 2,5x10 2H6 3,33x10 1,87x10 2H5 1,67x10 4,33x10 2H6 4,7x107 2,95x10 3H1 4,69x10 6,02x10 3H2 4,63x10 8,71x10 3H3 5,45x10 5,35x10 4H5 3,82x10 1,39x10 4H6 2,4x107 3,8x10 4H7 5,4x108 1,06x10 8H2 3,33x10 7,33x10 8H3 6,12x10 4,67x10 10H1 2,4x107 7,1x10 10H2 1,9x106 9,4x10 Dòng Vi khuẩn SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền 33 MSSV: 3052824 Luận văn tốt nghiệp- 2009 Công nghệ sinh hoc K31 Kết nhuộm màu protein với CBB cho thấy mức độ màu khác mẫu Khi hàm lượng protein mẫu cao mẫu có màu nhuộm với CBB đậm (hình 15) 3H2 3H2 4H6 8H2 10H1 ĐC 1H5 1H5 2H52H5 4H6 8H210H2 Hình15: 14: Hình kết đo nồng độ protein Hình III Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính enzim cellulase phương pháp Nelson (1944) Qua thí nghiệm ta thấy, 14 dòng vi khuẩn có hoạt tính khác biệt có ý nghĩa không nhiều mức ý nghĩa 5% (bảng 18) Kết bảng 17 cho thấy ngọai trừ dòng vi khuẩn 10H1 có họat tính enzim mạnh đạt 0,014 U/ml ứng với mật số 3,67x106 CFU /µl hoạt tính enzim thấp dòng 1H5 0,006 U/ml ứng với mật số 2,5 x109 CFU /µl Kết khảo sát hoạt tính enzim phù hợp với kết khảo sát hàm lượng protein hàm lượng protein cao (47,878 µg/ml) hoạt tính enzim cao SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền 34 MSSV: 3052824 Luận văn tốt nghiệp- 2009 Công nghệ sinh hoc K31 Bảng 16: Kết đo OD bước sóng 520 nm Nồng độ glucose (mM) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 ODLần 0,067 0,11 0,238 0,357 0,536 0,621 ODLần 0,067 0,099 0,234 0,389 0,495 0,608 ODLần 0,067 0,097 0,229 0,352 0,491 0,618 ODTB 0,067 0,102 0,234 0,366 0,507 0,616 OD 520 nm BIỂU ĐỒ ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSE y = 1.1691x + 0.023 0.7 R = 0.9824 Độ hấp thụ OD 520nm 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 Nồng độ Glucose (mM) 0.5 0.6 Hình 16: Biểu đồ đường chuẩn glucose SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền 35 MSSV: 3052824 Luận văn tốt nghiệp- 2009 Công nghệ sinh hoc K31 Bảng 17: Hàm lượng đường khử dịch nuôi vi khuẩn hiếu khí sau ngày STT Mẫu Vmẫu (ml) Hệ số pha ODLần ODLần ODLần ODTB loãng Hoạt HL Hoạt glucose tính (mM) (U/ml) tính tổng (U) 1H5 25 0,222 0,098 0,156 0,159 0,116 0,006 0,150 2H5 25 0,163 0,166 0,203 0,177 0,132 0,007 0,175 3H2 25 0,189 0,189 0,178 0,185 0,139 0,008 0,020 4H6 25 0,260 0,197 0,125 0,194 0,146 0,008 0,020 8H2 25 0,233 0,256 0,121 0,203 0,154 0,009 0,225 10H1 25 0,199 0,351 0,405 0,318 0,252 0,014 0,350 10H2 25 0,277 0,209 0,200 0,229 0,176 0,010 0,250 Bảng 18 : Hoạt tính enzim cellulase dịch nuôi vi khuẩn sau ngày Dòng 1H5 2H5 3H2 4H6 8H2 10H1 10H2 0,006b 0,007b 0,008 b 0,008b 0,009b 0,014 b 0,010a Hoạt tính enzim (U/ml) ĐC 1H5 2H5 3H2 4H6 8H2 10H1 10H2 Hình 17: Kết đo nồng độ glucose SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền 36 MSSV: 3052824 Luận văn tốt nghiệp- 2009 Công nghệ sinh hoc K31 IV Thí nghiệm 5: Khảo sát trọng lượng phân tử cellulase dịch trích thô Dựa vào kết bảng 19 xây dựng đồ thị logM protein chuẩn (hình 18) Đồ thị thể tương quan tuyến tính trọng lượng phân tử protein Rf, đường chuẩn dựng có độ tin cậy R2= 0,9748 Bảng19: Số liệu vẽ đương log protein chuẩn Protein M Rp RB Rf logM chuẩn (KDa) 1,27 2,12 3,39 4,34 5,61 7,02 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 0,176 0,294 0,471 0,603 0,779 0,975 1,000 116,0 66,2 45,0 35,0 25,0 18,4 14,4 2,064 1,821 1,653 1,544 1,398 1,265 1,158 Trong đó: Rp: Khoảng cách từ gel phân tích đến protein chuẩn RB: Khoảng cách từ gel phân tích đến protein chuẩn cuối Rf = Rp/RB M: Trọng lượng phân tử protein 2.5 y = -0.975x + 2.1562 R2 = 0.9748 logM 1.5 0.5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 Rf Hình 18: Đồ thị đường logM protein chuẩn SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền 37 MSSV: 3052824 Luận văn tốt nghiệp- 2009 Công nghệ sinh hoc K31 Dựa vào đồ thị logM protein chuẩn (hình 18) khoảng cách di chuyển band protein gel điện di (hình 19) tính trọng lượng phân tử band protein gel điện di (bảng 20) Hình 19: Kết điện di SDS-PAGE Bảng 20: Trọng lượng phân tử protein dịch trích enzim vi khuẩn hiếu khí Protein chuẩn Rp RB Rf M (KDa) logM 2H5 8H2 10H1 2,93 2,54 2,96 7,2 7,2 7,2 0,4069 0,3528 0,4111 57,47 64,89 56,93 1,75947 1,81222 1,75538 10H1 3,18 7,2 0,4417 53,15 1,72554 Chúng tiến hành điện di mẫu protein từ dịch trích enzim thô dòng vi khuẩn hiếu khí có họat tính cellulase Kết điện di cho thấy có band protein 2H5, 8H2 10H1 khoảng trọng lượng từ 53,15KDa đến 64,89 KDa Ngoài ra, có nhiều band protein mờ vị trí khác, cần tiến hành nghiên cứu tiếp qui trình trích ly điện di thời gian tới SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền 38 MSSV: 3052824 Luận văn tốt nghiệp- 2009 Công nghệ sinh hoc K31 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I KẾT LUẬN Trong hai mươi tám (28) dòng vi khuẩn phân lập có 10 dòng từ trấu hoại mục 18 dòng từ đất số nhà máy xay xát thuộc tỉnh Đồng Tháp, Hậu Giang Vĩnh Long Trong 28 dòng vi khuẩn có 14 dòng vi khuẩn hiếu khí 14 dòng vi khuẩn kỵ khí Các dòng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose với mức độ mạnh yếu khác biểu qua đường kính thủy phân kiểm tra môi trường agar có bổ sung Congo Red Kết kiểm tra thấy 23 dòng vi khuẩn (11 dòng vi khuẩn kỵ khí 10 dòng vi khuẩn hiếu khí) có tạo đường kính thủy phân môi trường Từ dịch trích enzim 10 dòng vi khuẩn hiếu khí thấy có dòng có hàm lượng protein hoạt tính enzim chưa cao Hàm lượng protein mẫu 10H2 (47,878µg/ml) cao nhất, mẫu 10H1 lại có hoạt tính cellulase cao dòng (0,014U/ml) Hàm lượng protein hoạt tính cellulase thấp 25,114 (µg/ml) 0,006 (U/ml) hai mẫu 3H2 1H5 Kết điện di phát bốn band protein dòng 2H5, 8H2 10H1 có trọng lượng phân tử khoảng từ 53,15KDa đến 64,89 KDa phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Đức Lượng (2004) Sau tiến hành phân lập kiểm tra hoạt tính, tuyển chọn dòng vi khuẩn hiếu khí 2H5, 4H6, 10H1 10H2 (đều có nguồn đất từ đất) dòng 8H2 (phân lập từ trấu) có hoạt tính enzim cao cho nghiên cứu để ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học, phân bón vi sinh II ĐỀ NGHỊ Vì thời gian thực đề tài có hạn nên chưa tìm phương pháp tối ưu cho việc thu chế phẩm enzim thô Vì cần có nghiên cứu để trích ly enzim từ dòng vi khuẩn hiếu khí đạt hiệu cao Tiếp tục nghiên cứu qui trình điện di SDS-PAGE để protein dịch trích nuôi vi khuẩn hiếu khí biểu rõ nét Đồng thời, tiến hành khảo sát họat tính dòng vi khuẩn kỵ khí thời gian nuôi tăng sinh khối lâu SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền 39 MSSV: 3052824 Luận văn tốt nghiệp- 2009 Công nghệ sinh hoc K31 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần Tiếng Anh Hatsumi Shiratori, Hironori Ikeno, Shohei Ayame, Naoaki Kataoka, Akiko Miya, Kuniaki Hosono, Teruhiko Beppu, and Kenji Ueda 2006 That performs Effective cellulosic waste Digestion on a thermophilic methanogenic bioactor; Isolation and Characterization of a New Clostridium sp Applied and Environmental Jiraporn Sukhumavasi, Kunio Ohmiya, Shoichi Shimizu and Kazue Ueno 1988 Clostridium josui sp Nov.,a Cellullolytic, Moderate Thermophilic Species from Thai Compost Society for General Microbiology J Ryckeboer, J Meraert, J Coosemans, K.Deprins and J Swings 2002 Microbiological aspects of biowaste during composing in a monitored compost bin Lee, B.H and Blackburn T H 1974 Cellulase production by a thermophilic Clostridium species Applied Microbiology 30: 346-353 Yung-Chung Lo, Ming-Der Bai, Wen-Ming Chen and Jo-Shu Chang 2008 Cellulosic hydrogen production with a sequencing bacterial hydrolysis and dark fermentation strategy Taiwan Yung-Chung Lo, Ganesh D Saratale, Wen-Ming Chen, Ming-Der Bai and JoShu Chang 2009 Isolation of cellulose-hydrolytic bacteria and applications of the cellulolytic enzymes for cellulosic biohydrogen production Phần Tiếng Việt Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp 2002 Giáo trình vi sinh vật chuyên sâu Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp 2002 Bài giảng Thực tập Vi Sinh Vật Đại Cương Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần thơ Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp 2002 Bài giảng Thực tập Vi Sinh Môi Trường Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần thơ Công ty TNHH Nguyên Anh 2004 Định lượng đường khử theo phương pháp BERTRAND Website: www nguyenanhvn.com SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền 40 MSSV: 3052824 Luận văn tốt nghiệp- 2009 Công nghệ sinh hoc K31 Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài Nguyễn Văn Tố 2006 Cải tạo môi trường chế phẩm sinh học Nhà xuất lao động Dương Thị Hương Giang 2007 Bài giảng protein Học, Viện nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Hồ Sĩ Tráng 2005 Cơ sở hóa học gỗ Xenluloza, tập 1, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Hồ Sĩ Tráng 2004 Cơ sở hóa học gỗ Xenluloza, tập 2, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Hương Cát TPHCM: 30.000 USD cho xây dựng mô hình nông nghiệp xanh Biomass www.sinhhocvietnam.com 04/2005 Lâm Thị Kim Châu, Nguyễn Thượng Lệnh, Nguyễn Thị Huyên Nguyễn Thị Đức Trinh 1995 Thực tập lớn sinh hóa Tủ sách đại học tổng hợp TP Hồ Chí Minh Lê Thị Vu Lan Phạm Thanh Nhật 2008 Giáo trình Thực tập Vi Sinh Đại Cương.Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TP HCM Nguyễn Thị Xuân Dung 2008 Giáo trình thực tập Protein Enzim Viện NC& PT CNSH, trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Lân Dũng 1976 Thực tập Vi sinh vật học NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Ty 2007 Vi sinh vật học NXB Giáo Dục Phạm Văn Ty Vũ Nguyên Thành 2006 Công nghệ Sinh học, T5 Công Nghệ Vi sinh môi Trường NXB Giáo Dục Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền Nguyễn Ánh Tuyết 2003 Thí nghiệm Công nghệ Sinh học T2, Thí nghiệm Vi sinh vật học NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng 2004 Công nghệ Vi Sinh Vật T1- Cơ sở Vi sinh vật công nghiệp NXB Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh ) Nguyễn Đức Lượng 2004 Công nghệ enzim NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền 41 MSSV: 3052824 Luận văn tốt nghiệp- 2009 Công nghệ sinh hoc K31 Nguyễn Văn Mùi 2001 Thực hành hóa sinh học NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Thu Phướng 2008 Phân lập, tuyển chọn số dòng vi khuẩn có khả phân huỷ cellulose hai nhiệt độ 30oC 55oC ứng dụng xử lý rác hữu Luận văn tốt nghiệp Đại học, Khoa Khoa Học, trường Đại Học Cần Thơ Nguyễn Xuân Thành (chủ biên), Nguyễn Đường, Hoàn Hải Vũ Thị Hoàn 2007 Giáo trình Sinh Học Đất NXB Giáo Dục Nguyễn Khắc Tuấn 1996 Vi sinh vật học NXB Nông Nghiệp Hà Nội Phạm Thu Cúc 1996 Giáo trình Sinh Hóa, Phần I Tủ sách Đại Học Cần Thơ Phạm Thị Trân Châu Phan Tuấn Nghĩa 2007 Công Nghệ Sinh Học tập 3, Enzim Ứng dụng NXB Giáo dục Phạm Thị Ánh Hồng 2003 Kỹ thuật Sinh hóa NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Trần Thanh Thủy 1998 Hướng dẫn thực hành Vi Sinh Vật Học.NXB Giáo Dục Trần Cẩm Vân 2005 Giáo trình Vi Sinh Vật Học Môi Trường NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội Các website: google.com.vn sinhhocvietnam.com.vn vi.wikipedia.org, kulkul.xahoihoctap.net SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền 42 MSSV: 3052824 Luận văn tốt nghiệp- 2009 Công nghệ sinh hoc K31 PHỤ LỤC 1: HÓA CHẤT THÍ NGHIỆM Chuẩn bị thuốc nhuộm Gram Vi khuẩn Thuốc nhuộm Crystal violet (Nguyễn Đức Lượng ctv, 2003) Crystal violet (chất nhuộm 90%) 2gram Cồn 95% 20ml Nước cất 80ml Thuốc nhuộm Iodine Iodine 1gram KI 2gram Nước cất 300ml Cho KI vào cối, thêm iodine nghiền chày – 10giây Thêm 1ml nước nghiền, thêm 5ml nước nghiền Cho dung dịch vào lọ, rửa cối chày vói lượng nước đủ để đạt thể tích 300ml (Nguyễn Đức Lượng ctv, 2003) Thuốc nhuộm Fuchsin gồm dung dich A trộn với dung dịch B pha loãng lần Dung dịch A gồm: cồn 96% 10ml Fuchsin kiềm 0.3gram Dung dịch B gồm: 5gram (Lê Thị Vu Lan, 2008) phenol SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền i MSSV: 3052824 Luận văn tốt nghiệp- 2009 Công nghệ sinh hoc K31 PHỤ LỤC 2: SỐ LIỆU THỐNG KÊ Bảng 1: Thống kê đường kính thuỷ phân sau ngày ủ 14 dòng vi khuẩn hiếu khí Ghi chú: dấu chấm (.) ngăn cách thay cho dấu phẩy (,) SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền ii MSSV: 3052824 Luận văn tốt nghiệp- 2009 Công nghệ sinh hoc K31 Bảng 2: Thống kê đường kính thủy phân sau ngày ủ 14 dòng vi khuẩn kỵ khí Variance Check Cochran's C test: 0.391304 P-Value = 0.477661 Bartlett's test: 1.47118 P-Value = 0.960054 Hartley's test: 9.0 The StatAdvisor The three statistics displayed in this table test the null hypothesis that the standard deviations of Duong Kinh within each of the 14 levels of dong Vk ki is the same Of particular interest are the two P-values Since the smaller of the P-values is greater than or equal to 0.05, there is not a statistically significant difference amongst the standard deviations at the 95.0% confidence level Ghi : dấu chấm (.) ngăn cách thay cho dấu phẩy (,) SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền iii MSSV: 3052824 Luận văn tốt nghiệp- 2009 Công nghệ sinh hoc K31 Bảng 3: Kết phân tích thống kê hàm lượng protein dịch trích enzim Bảng : Kết phân tích thống kê hàm lượng đường khử Dấu chấm (.) phần hiểu dấu phẩy ngăn cách (,) SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền iv MSSV: 3052824 LÝ LỊCH KHOA HỌC I LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: Nguyễn Thị Diệu Hiền Ngày, tháng, năm sinh: 01/02/1987 Nơi sinh: Huyện Cao Lãnh, Tỉnh Đồng Tháp Chỗ nay: số nhà 018, tổ 1, ấp 4, xã Mỹ Long, huyện Cao Lãnh, Đồng Tháp Điện thoại di động: 01662.853405 Điện thoại nhà riêng: 0673.912666 II QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO Đại học Hệ đào tạo: Chính quy Ngành đào tạo: Công Nghệ Sinh Học Nơi đào tạo: Trường Đại học Cần Thơ Trình độ ngoại ngữ Chứng B Anh văn [...]... I Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn 1 Phân lập vi khuẩn Hai mươi tám (28) dòng vi khuẩn được phân lập, trong đó có 10 dòng từ trấu đang hoại mục và 18 dòng từ đất ở một số nhà máy xay xát thuộc tỉnh Đồng Tháp, Hậu Giang và Vĩnh Long (bảng 4) Trong 28 dòng vi khuẩn có 14 dòng vi khuẩn hiếu khí và 14 dòng vi khuẩn kỵ khí Đa số các dòng vi khuẩn hiếu khí phát triển nhanh trên môi trường có agar sau 24 giờ,... sao cho trong mẫu vật không có bọt khí Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần để thấy được các hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn (Nguyễn Hữu Hiệp và Cao Ngọc Điệp, 2002) 2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự thủy phân cellulose của vi khuẩn hiếu khí bằng đường kính thủy phân a Khảo sát khả năng thủy phân cellulose của vi khuẩn trên môi trường có Congo Red Ind Vi khuẩn. .. là vi khuẩn tạo bào tử hình tròn được tìm thấy trong phân Dòng này thủy phân cellulose nguyên thủy, trấu, và những nguyên liệu có chứa cellulose khác Đây là dòng vi khuẩn sản xuất ethanol, acetate, butyrate, hydrogen, CO2 trong suốt quá trình phát triển trên môi trường cellulose và cellobiose (Jiraporn Sukhumavasi et al, 1988) Chín dòng vi khuẩn phân hủy cellulose được phân lập từ trong nguồn đất, trong. .. ellipsopora (có màu nâu) Chúng đều là những vi khuẩn phân hủy cellulose mạnh Nguyễn Lân Dũng (1976) cho rằng, ngoài niêm vi khuẩn, trong đất còn thường thấy các loại vi khuẩn phân hủy cellulose thuộc giống Cellvibrio gần gũi với nhóm Pseudomonas Khuẩn lạc của Cellvibrio có một số loài vô màu, có một số khác màu vàng – lục b Những vi sinh vật phân hủy cellulose trong điều kiện kỵ khí SVTH: Nguyễn Thị Diệu... lượng cellulose còn theo kiểu hydro thì khi tạo ra bằng 1/3 (Nguyễn Đức Lượng, 2004) 4 Vi sinh vật phân hủy cellulose a Các vi sinh vật phân hủy cellulose trong điều kiện hiếu khí Trong điều kiện hiếu khí các vi sinh vật tham gia vào vi c thủy phân cellullose gồm các niêm vi khuẩn, một số đại diện của các vi khuẩn không sinh bào tử và sinh bào tử, xạ khuẩn và nấm Trong số này thì các loài niêm vi khuẩn. .. Han (1969) đã phân lập được 2 giống có khả năng cộng sinh là Cellulomonas và Alcaligenes Trong môi trường cellulose sự kết hợp hai loài này sẽ phát triển nhanh hơn so với môi trường cấy riêng lẻ (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996) Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch có thể thủy phân CMC (Carbomethyl cellulose) , trấu, bã mía, và giấy vụn, trong đó CMC cho kết quả thủy phân tốt hơn Hiệu suất thủy phân CMC tăng... 3,7 triệu tấn trấu làm ô nhiễm môi trường nghiêm trọng (www.ecsme.com.vn) Chính vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài Phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose trong trấu đang hoai mục SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền 1 MSSV: 3052824 Luận văn tốt nghiệp- 2009 Công nghệ sinh hoc K31 PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU I TỔNG QUAN VỀ TRẤU VÀ ENZIM CELLULASE 1 Tổng quan về trấu Là một trong những nước... được khử trùng nhiệt ướt được phân phối vào các bình tam giác 100ml SVTH: Nguyễn Thị Diệu Hiền 9 MSSV: 3052824 Luận văn tốt nghiệp- 2009 Công nghệ sinh hoc K31 Bố trí thí nghiệm 1 Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn a Phân lập vi khuẩn Mục đích: tách riêng từng tế bào vi sinh vật trong đất và trấu đang hoại mục để thu nhận được giống ở dạng thuần khiết (ròng) Hình 2: Hình thu mẫu trấu và đất Các bước tiến... 30 oC trong 24 giờ Đối với vi khuẩn hiếu khí: Mẫu được ủ trong tủ ủ ở 30oC trong tủ ủ Đối với vi khuẩn kỵ khí: Các đĩa petri mới chuyển được chuyển vào bình thủy tinh có nắp đậy Dùng đèn cầy để tạo môi trường không có oxy trong bình Sau đó mẫu được ủ trong tủ ủ ở 30oC trong tủ ủ vi sinh - Cấy truyền: sau khi ủ theo dõi thấy xuất hiện khuẩn lạc thì tiếp tục chọn các dạng khuẩn lạc khác nhau, mỗi khuẩn. .. Nguyên tắc: Vi khuẩn có cấu tạo đơn bào, đa số chúng có đường kính từ 0,2 - 2 µm, chiều dài từ 2 - 8 µm Hình dang tế bào có thể là hình cầu, hình que, hình xoắn hay hình dấu phẩy; các tế bào có thể tồn tại đơn lẻ, hay có thể kết đôi, kết chuỗi và kết chùm Chúng sinh sản chủ yếu bằng hình thức phân đôi tế bào Một số lòai vi khuẩn có khả năng tạo bào tử; một số loài có khả năng di động nhờ chúng có tiên ... trường có agar, dòng hiếu khí phát triển nhanh dòng kỵ khí sau 24 Trong số 28 dòng phân lập có 18 dòng vi khuẩn có nguồn gốc từ đất (đất trấu) 10 dòng vi khuẩn phân lập từ trấu hoại mục Trong. .. dòng vi khuẩn kỵ khí phân hủy cellulose mạnh dòng vi khuẩn hiếu khí Trong ngày đầu thủy phân 14 dòng vi khuẩn hiếu khí, ta thấy dòng vi khuẩn 1H5 4H6 tạo đường kính thủy phân lớn (2,75 mm) có khác... PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN I Thí nghiệm 1: Phân lập vi khuẩn Phân lập vi khuẩn Hai mươi tám (28) dòng vi khuẩn phân lập, có 10 dòng từ trấu hoại mục 18 dòng từ đất số nhà máy xay xát thuộc tỉnh