ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Trường Đại học Bách Khoa Khoa Kỹ Thuật Hóa Học -Báo cáo Phân tích thực phẩm SẮC KÝ KHÍ (GC) GVHD: SVTH: Lê Trung Hiếu 61000953 Lê Tấn Hoàng 61001101 Võ Hoàng Yến 61004166 TP HỒ CHÍ MINH 03-2013 Sắc ký khí (GC) SẮC KÍ KHÍ I Cơ sở lý thuyết Sơ lược sắc kí khí Sắc kí khí phương pháp sắc kí mà pha động lỏng thay dòng khí mang liên tục chạy qua pha tĩnh Các chất tách khỏi hỗn hợp nhờ vào tương tác khác chúng với pha tĩnh Do khả hòa tan khí, dòng khí không đóng vai trò pha động thực sự, làm nhiệm vụ lôi chất pha chạy dọc theo pha tĩnh để chúng tương tác với pha tĩnh Vì dòng khí chạy pha tĩnh gọi khí mang Sắc kí khí chuyên dùng để phân tích chất dễ bay Một số chất dù có nhiệt độ sôi cao tạo thành cca1 dẫn xuất có nhiệt độ sôi thấp phân tích kĩ thuật sắc kí khí Kết việc phân tích sắc kí khí phụ thuộc vào việc lựa chọn cột, chọn nhiệt độ bơm mẫu vào cột, nhiệt độ lò, nhiệt độ detector, phụ thuộc vào điều chỉnh vận tốc dòng khí mang vào cột chế độ nhiệt độ cao làm cho chất có nhiệt độ sôi thấp bị đẩy khỏi cột nhiệt độ thấp gây lưu giữ mẫu pha tĩnh làm kéo dài thời gian phân tích Do đó, phân tích hỗn hợp nhiều mẫu việc cần thiết cần phải triển khai theo chế độ gradient nhiệt độ Hệ thống sắc kí khí Mẫu bơm vào theo dòng khí mang (khí mang thường N2) đưa đến cột sắc ký (pha tĩnh) Mẫu qua cột hấp phụ lên pha tĩnh Sau đó, chất tách khỏi cột theo dòng khí ghi nhận đầu dò Từ tín hiệu nhận máy tính xử lý biểu kết sắc ký đồ Các chất xác định nhờ giá trị thời gian lưu sắc ký đồ Trang Sắc ký khí (GC) Hệ thống sắc ký khí bao gồm thành phần sau: 2.1 Nguồn cung cấp khí mang: Pha động sắc ký khí hay gọi khí mang giữ vai trò vận chuyển chất phân tích dọc theo cột sắc ký tiếp nhận phân tử chất phân tích bị giữ lại trước giải hấp tới để tiếp tục tương tác với phần khác bề mặt pha tĩnh Điều kiện để khí sử dụng làm khí mang: - Phân tử lượng nhỏ - Trơ mặt hoá học chất phân tích, pha tĩnh, vật liệu làm cột - Tinh khiết - Phù hợp với detector sử dụng Khí mang sắc ký khí thường dùng khí heli, nitơ, argon, Với detector ECD vận hành với khí mang khác Khi làm việc theo kiểu dòng chiều dùng khí nitơ, vận hành theo kiểu xung dùng argon bổ sung 5% metan cho kết tốt 2.2 Lò cột: dùng để điều khiển nhiệt độ cột phân tích 2.3 Bộ phận tiêm mẫu Bộ phận tiêm mẫu dùng để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm thay đổi Khi đưa mẫu vào cột, sử dụng chế độ chia dòng (split) không chia dòng (splitless) Trang Sắc ký khí (GC) Có cách đưa mẫu vào cột: tiêm mẫu thủ công tiêm mẫu tự động (Autosamper – có phận hóa - headspace)  Phương pháp tiêm mẫu: Trong phương pháp sắc ký khí, việc lựa chọn kỹ thuật tiêm tối ưu điều kiện tiêm đóng vai trò định kết phân tích Hai kỹ thuật tiêm mẫu thường dùng sắc ký khí tiêm chia dòng không chia dòng • Tiêm chia dòng: - Mẫu tiêm vào buồng tiêm, toàn mẫu hoá hơi, đồng thời cuối buồng tiêm van xả mở phần lớn theo van ngoài, phần nhỏ giữ lại đưa vào cột - Tỉ lệ gọi tỉ lệ chia dòng Tỉ lệ chia dòng từ 20:1 đến 100:1 - Các thông số để đánh giá phương pháp tiêm chia dòng nhiệt độ buồng tiêm, tỉ số chia dòng, áp suất khí mang, - Phương pháp tiêm chia dòng cho mũi sắc ký nhọn, phù hợp mặt định tính Về mặt định lượng không tốt tỉ lệ chia dòng thay đổi tuỳ thuộc điều kiện tiêm hỗn hợp mẫu chứa chất có khả bay khác Phương pháp tiêm chia dòng phù hợp cho phân tích mẫu có hàm lượng lớn, không phù hợp cho phân tích lượng vết lượng mẫu vào cột • Tiêm không chia dòng: - Toàn mẫu chuyển thẳng vào cột, tiêm không chia dòng sử dụng buồng tiêm giống tiêm chia dòng khác chỗ trình tiêm mẫu van thoát khí đóng lại Thời gian tiêm không chia dòng từ 40-90 giây, thể tích tiêm 1-2µl - Nhiệt độ cột sắc ký lúc đầu thấp, sau tăng lên Nhiệt độ đầu thấp nhiệt độ dung môi 20-30 C, vào đầu cột gặp nhiệt độ thấp hỗn hợp đọng lại (gồm chất phân tích dung môi) giúp lôi kéo toàn thể chất phân tích buồng tiêm vào cột Khi tăng nhiệt độ dung môi trước, chất phân tích từ từ sau cho mũi tương đối nhỏ - Phương pháp thích hợp cho phân tích dạng vết, siêu vết không dùng cho chất có nhiệt độ sôi thấp dung môi 2.4 Cột phân tích Trong thực tế có nhiều dạng cột tách dùng cho mục đích nghiên cứu khác Nhìn chung cột sắc ký cần đạt yêu cầu sau đây: - Đảm bảo trao đổi chất tốt pha tĩnh pha động nhờ việc tối ưu hoá thông số phương trình Van-Deemter - Độ giảm áp suất nhỏ với tốc độ khí mang định - Vật liệu dùng chế tạo cột phải có tính bền nhiệt độ cao Cột sắc ký chia làm hai loại cột nhồi cột mao quản Trang Sắc ký khí (GC) • Cột nhồi: Vật liệu làm cột nhồi thường thủy tinh, polytetrafluoethylene, thép không gỉ, niken đồng Chiều dài cột từ 1-3m Do hạt nhồi thường làm giảm áp suất lớn nên cột thường ngắn 3m Đường kính cột khoảng 1/8 đến1/4 inches Đối với cột nhồi yếu tố quan trọng pha tĩnh cột định tính chọn lọc cột Cột nhồi thường cho hiệu tách thấp Một cột có chiều dài 1m nhồi hạt có kích thước 125-150µm không tạo 3000 đĩa lý thuyết Tuy nhiên cột nhồi có ưu điểm định hệ số lưu giữ cao, thích hợp với detector tích lớn, dung lượng mẫu cao, chịu ảnh hưởng chất bẩn mẫu nên không đòi hỏi nhiều công tinh chế mẫu • Cột mao quản: Cột mao quản loại cột tách có đường kính nhỏ 1mm thành cột tẩm pha tĩnh Nhờ cấu trúc đặc biệt cột mao quản, khí mang đưa mẫu qua cột tách dài (do suất tách cao) mà không gặp trở kháng lớn (độ chêch lệch áp suất thấp) So với cột nhồi, cột mao quản có ưu điểm là: - Các hỗn hợp phức tạp tách với hiệu suất cao hẳn - Tách chất có cấu trúc hoá học gần - Độ tin cậy cao việc nhận biết cấu tử - Độ nhạy phát cao - Giảm thời gian phân tích - Cho phép nối trực tiếp với khối phổ kế mà không cần tách 2.5 Đầu dò Detector phận ghi nhận xuất nồng độ chất dòng khí mang Detector có nhiệm vụ chuyển hoá đại lượng không điện (nồng độ chất tách khỏi cột sắc ký) thành tín hiệu điện Tính chất cần có detector: độ nhạy cao, có khả cho tính hiệu với nhiều loại hợp chất, khoảng tuyến tính rộng, cho tín hiệu nhanh, ổn định, độ ồn thấp Các loại detector thông dụng sắc ký khí: - Phổ quát: FID, TCD, MS - Chọn lọc: ECD - Bảo toàn chất phân tích: TCD - Phá huỷ chất phân tích: ECD, FPD, FID, MS.dò khối phổ (MS-Mass Spectrometry) 2.6 Bộ phận ghi nhận tín hiệu Bộ phận ghi tín hiệu đầu dò phát 2.7 In liệu Trang Sắc ký khí (GC) Sau phân tích xong, liệu in qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển Các đại lượng phương pháp sắc ký 3.1 Hệ số phân bố: Cân cấu tử hệ sắc ký mô tả phương trình đơn giản sau: Xpha động Xpha tĩnh Hằng số cân cho cân gọi tỉ lệ phân bố hay hệ số phân bố (partition coefficient), tính sau: k (1) Với • CS: nồng độ cấu tử pha tĩnh • CM: nồng độ cấu tử pha động Hệ số k phụ thuộc vào chất pha tĩnh, pha động chất phân tích 3.2 Thời gian lưu (tR): Các chất tan hỗn hợp mẫu phân tích nạp vào cột sắc ký chúng bị lưu giữ pha tĩnh theo thời gian định gọi thời gian lưu Thời gian lưu tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký lúc chất tan rửa giải hoàn toàn khỏi cột, thời điểm chất phân tích có nồng độ cực đại Với: • tR: thời gian lưu cấu tử chất phân tích (min) • t0: thời gian chất hoàn toàn lực với pha tĩnh qua cột, thời gian pha động vào cột đến khỏi cột gọi thời gian chết (min) • tR’: thời gian lưu hiệu chỉnh (min) tR’ = tR - t0 (2) Trang Sắc ký khí (GC) Hình 3.1: Thời gian lưu cấu tử phân tích sắc ký đồ 3.3 Hệ số dung lượng: Được định nghĩa theo công thức sau: (3) Với: • VS: thể tích pha tĩnh • VM: thể tích pha động • K’ đại lượng quan trọng sắc ký đo thực nghiệm, tính theo công thức: (4) • Nếu K’~ 0, tR ~t0: chất sớm nhất, cột khả giữ chất lại • K’ lớn (tR lớn) chất cột lâu, thời gian phân tích dài mũi sắc ký có khả bị tù • K’ nhỏ mũi chất nhanh khả tách Trang Sắc ký khí (GC) • Khoảng K’ lý tưởng từ 2-5 phân tích hỗn hợp phức tạp K’ chấp nhận 1- 20 3.4 Số đĩa lý thuyết cột: Số đĩa lý thuyết (N) cột đặc trưng cho khả tách mũi sắc ký cấu tử cột Hình 3.2: Mô tả cách tính số đĩa lý thuyết (5) Với : • Wb: bề rộng đáy mũi sắc ký • W 1/2: bề rộng đáy mũi sắc ký phân nửa chiều cao Số đĩa lý thuyết lớn bề rộng Wb nhỏ mũi sắc ký nhọn Khi chiều cao cột không đổi, số đĩa lý thuyết tăng hiệu tách cột cao 3.5 Độ chọn lọc: Độ chọn lọc (α) đại lượng biễu diễn khác mũi kề hệ sắc ký chọn Khi α khác tách hai chất rõ Độ chọn lọc α thay đổi theo thay đổi thành phần pha động pha tĩnh Trang Sắc ký khí (GC) (6) 3.6 Độ phân giải: Độ phân giải (RS) dùng để đánh giá khả tách hai mũi sắc ký gần (7) Với : • tR1: thời gian lưu cấu tử thứ • tR2: thời gian lưu cấu tử thứ hai • W1: bề rộng đáy mũi sắc ký thứ • W2: bề rộng đáy mũi sắc ký thứ hai • α: độ chọn lọc cột sắc ký cho hai cấu tử Trường hợp RS=1, hai mũi có độ lớn tương tự phân tách khỏi khoảng 95% Nếu RS= 1.5 phân giải coi hoàn toàn (99.7%) II Cách tiến hành Chuẩn bị mẫu Tiến hành chạy sắc kí Tính kết III Ứng dụng Khác với máy phân tích dư lượng kháng sinh sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS/MS), sắc ký khí ghép khối phổ độ phận giải cao (HRGC/HRMS), GC/MSN sắc ký ghép khối phổ có ứng dụng phân tích độc chất nước tương, nước mắm (3 MCPD ); Nghiên cứu chiết xuất xác định thành phần chất hóa học, độc chất, kháng sinh, đánh giá độ tồn lưu hóa chất diệt côn trùng khác vật liệu hợp chất khác IV Tiến hành thí nghiệm Trang Sắc ký khí (GC) Cách thức chuẩn bị mẫu Pha 400µl paraxylen 100µl alcohol Loại cột sử dụng GC-Shimadzu 2010 Plus Thông số cột: SPBS – chiều dài 30m, đường kính 0.25mm Chiều dày lớp film 0.25µm cấu tử không bị lưu giữ cột xuyên qua cột 1.5phút Thành phần pha động Diethyl ether Bài tập  Độ phân giải lý thuyết (t R ) B − (t R ) A 2∆t R = < Rs= WA + WB WA +WB 2 Trong ∆t R = 4.105 – 2.705 = 1.4 WA = 0.08 (min) WB = 0.19 (min) Vậy Rs = 10.37 >1.5 => cấu tử tách hoàn toàn  Số đĩa lý thuyết cột N1 = 5,54 ( t RA ) = 25.3 x103 WA1/2 N2 = 5,54 ( t RB ) = 10.3 x103 WB1/2 N= ( N1 + N2 ) = 17.8 x103 Trang 10 Sắc ký khí (GC)  Chiều cao đĩa lý thuyết H= L = 1.68 x10-3 m N Chiều cao đòi hỏi cột để đạt độc phân giải 1.5 Ta có: ( RS )1 = ( RS ) N1 10.37 = = 1.5 N2  N2 = 372 Trang 11 17.8 x103 N2 [...].. .Sắc ký khí (GC)  Chiều cao đĩa lý thuyết H= L = 1.68 x10-3 m N Chiều cao đòi hỏi của cột để đạt độc phân giải là 1.5 Ta có: ( RS )1 = ( RS ) 2 N1 10.37 = = 1.5 N2  N2 = 372 Trang 11 17.8 x103 N2 ... kết sắc ký đồ Các chất xác định nhờ giá trị thời gian lưu sắc ký đồ Trang Sắc ký khí (GC) Hệ thống sắc ký khí bao gồm thành phần sau: 2.1 Nguồn cung cấp khí mang: Pha động sắc ký khí hay gọi khí. . .Sắc ký khí (GC) SẮC KÍ KHÍ I Cơ sở lý thuyết Sơ lược sắc kí khí Sắc kí khí phương pháp sắc kí mà pha động lỏng thay dòng khí mang liên tục chạy qua pha tĩnh... liệu Trang Sắc ký khí (GC) Sau phân tích xong, liệu in qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển Các đại lượng phương pháp sắc ký 3.1 Hệ số phân bố: Cân cấu tử hệ sắc ký mô tả