Phần I: Mở đầu 1.Mục tiêu đề tài : Hàng năm có khoảng 300000 enzyme sản xuất toàn giới Để sản xuất hiệu tiết kiệm chi phí, ta sãn xuất enzyme thừ nguồn phế thải trấu, cám gạo, bã mía …trong ngành thực phẩm nói riêng, enzyme amylase có vai trò vô to lớn việc sãn xuất sãn phẩm thực phẩm Đó củng lý mà em thực đề tài “tìm hiểu quy trình sản xuất ezyme amylase từ Aspergilus Oryzae thực phẩm” 2.Nhiệm vụ: Tìm hiểu enzyme amylase nấm mốc aspergilus,nguyên liệu, trình sản xuất enzyme amylase từ Aspergilus Oryzae.Tìm hiểu ứng dụng nghành thực phẩm 3.Ý nghĩa thực tế vấn đề liên quan: Trong ngành thực phẩm nói chung, ngành chế biến tinh bột, đường nói riêng Trong chế biến tinh bột đường, công đoạn quan trọng thuỷ phân tinh bột đường đơn giản Sau đó, chủ yếu sở đường đơn nhờ lên men, người ta nhận nhiều sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, loại acid hữu cơ, amino acid… Quá trình thuỷ phân tinh bột gồm hai công đoạn chủ yếu giai đoạn hồ hoá giai đoạn đường hoá Trong thực tế sản xuất người ta áp dụng hai cách: Thuỷ Đồ án thực phẩm phân tinh bột acid enzym Để thuỷ phân tinh bột từ lâu người ta sử dụng acid vô HCl H2SO4 Nhưng thực tế, thuỷ phân acid khó kiểm soát thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm Do vậy, việc thay ứng dụng enzym để thuỷ phân tinh bột kết tất yếu lịch sử phát triển Amylase dùng để thay acid ngày mang tính quy mô công nghiệp Hiện nay, nhà sản xuất sử dụng amylase có khả chịu nhiệt cao mà không bị hoạt tính.Chẳng hạn amylase tách từ vi sinh vật, cụ thể chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập từ suối nước nóng Ngoài ra, amylase có nhiều ưu điểm so với sử dụng acid để thủy phân tinh bột: lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho trình tinh dịch đường Amylase lấy từ nguồn mầm thóc, mầm đại mạch, hạt bắp nảy mầm, nấm mốc … Nguyên liệu sản xuất gạo, bắp, khoai mì.đây nguồn nguyên liệu rẻ tiền dể kiếm nước ta.Do đó,đây lợi hướng phát triển mạnh làm sở phát triển cho nhiều ngành công nghiệp khác phát triển sản xuất bánh kẹo,bia,cồn,siro,chất làm mềm vải … _ Svth: Trần Đình Mạnh Đồ án thực phẩm Phần 2:Nội dung đề tài Chương I: Tổng quan lý thuyết 1.1Tổng quan nấm mốc Aspergilus Oryzae Quá trình lên men hoạt động sống tế bào vi sinh vật môi trường, trình xảy diều kiện tự nhiên trình sản xuất công nghiệp Bản chất hai trình nói mặt hình thức phương diện khác khác hoàn toàn Quá trình lên men tự nhiên quy luật sống vi sinh vật Tự tham gia tổng hợp chất sống từ vật liệu lên men có tự nhiên, vi sinh vật vật chất sử dụng trình lên men tự nhiên phức tạp, không đồng chủng loại số lượng Mặt khác, trình lên men không kiểm soát, nhiều pha lên men không định hướng Sản phẩm lên men đa dạng, không ổn định, chất lượng lên men không đồng Quá trình lên men sản xuất công nghiệp, tất khâu từ phân lập giống vi sinh vật, chất, pH, nhiệt độ, độ ẩm …các trình phản ứng sinh học, trình thu nhận, tinh sản phẩm kiểm soát hoàn toàn Sản phẩm tạo có định hướng rỏ ràng từ khâu chọn giống vi sinh vật cuối trình thu nhận sản phẩm Do chất lượng sản phẩm cải thiện nhiều 1.1.1: Vai trò chọn giống công nghệ enzyme Trong công nghệ enzyme từ vi sinh vật, giống đóng vai trò định: − Giống VSV định đến suất enzyme nhà máy − Giống VSV định đến chất lượng sản phẩm sinh học (Trong công nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò định) − Giống VSV định đến suất enzyme nhà máy − Giống VSV định đến chất lượng sản phẩm sinh học ( hoạt tính enzyme) − Giống VSV định vốn đầu tư cho sản xuất − Và cuối giống VSV định đến giá thành sản phẩm _ Svth: Trần Đình Mạnh Đồ án thực phẩm 1.1.2: Yêu cầu giống vi sinh vật công nghệ enzyme Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men đại sản xuất theo quy mô công nghiệp Do đó, giống vi sinh vật dung công nghệ enzyme cần phải có yêu cầu chuẩn mực định Đó là: − Giống vi sinh vật phải cho sản phẩm mà ta mong muốn, sản phẩm phải có số lượng chất lượng cao sản phẩm phụ khác Vì trình trao đổi chất, để chuyển hóa lượng sinh chất gấp hàng nghìn lần khối lượng thể khoảng thời gian ngắn, thể vi sinh vật cần phải tổng hợp nhiều chất Do sản phẩm tạo chứa nhiều loại khác Chính thế, giống vi sinh vật dung sản xuất loại sản phẩm đó, sản phẩm phải trội sản phẩm khác số lượng chất lượng − Giống vi sinh vật cần phải cho suất sinh học cao − Giống vi sinh vật phải có khả thích nghi phát triển mạnh điều kiện sản xuất công nghiệp − Giống vi sinh vật phải có khả đồng hóa nguyên liệu rẻ tiền dể kiếm địa phương nơi nhà máy hoạt động − Giống vi sinh vật sử dụng trình sản xuất đại phải giống vi sinh vật khiết tốc độ sinh sản nhanh − Tốc độ trao đổi chất mạnh mẽ để nhanh chóng tạo sãn phẩm mong muốn, dể dàng tách sản phẩm khỏi tạp chất môi trường sinh khối vi sinh vật giống − Giống vi sinh vật phải ổn định điều kiện bảo quản dể dàng bảo quản => Để tạo điều kiện thuận lợi chủng Giống vi sinh vật cung cấp cho trình lên men công nghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật khiết _ Svth: Trần Đình Mạnh Đồ án thực phẩm 1.1.3 Giới thiệu chủng nấm mốc Aspergilus Oryzae Aspergilus Oryzae loại nấm mốc thuộc Plectascales,lớp comycetes ( nang khuẩn ) Cơ thể sinh trưởng hệ bao gồm sợi mảnh, phân nhánh nhiều có vách ngang, chia sợi thành nhiều tế bào Từ sợi nằm ngang hình thành sợi đứng thẳng gọi cuống đính bào tử, có quan sinh sãn vô tính Cuống đính bào tử Aspergilus Oryzae thường dài 1-2 mm nên nhìn thấy mắt thường, phía cuống đính bào tử phòng lên gọi bọng Từ bọng phân chia thành tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi tế bào hình chai Đầu tế bào hình chai phân chia thành bào tử đính vào nhau, nên gọi đính bào tử Đính bào tử Aspergilus Oryzae có màu vàng lục màu vàng hoa cau … Hình 1.1 nấm mốc Aspergilus Oryzae Đặc điểm giống Aspergilus Oryzae giàu enzyme thủy phân nội bào thủy phân ngoại bào amylase, protease, pectinasa…Ta hay gặp chúng kho nguyên liệu, thùng chứa bột, gạo…đã hết không rửa sạch, cặn bã bia, rượu, lỏi ngô, bã sắn…Chúng mọc phát triển có thành lớp mốc, màu đen, vàng…Màu định bào tử già có màu _ Svth: Trần Đình Mạnh Đồ án thực phẩm sắc Các bào tử dể bị gió xa rơi đâu, gặp điều kiện thuận lợi mọc thành mốc 1.1.4: Quá trình phân lập giống vi sinh vật Vi sinh vật phân bố rộng tự nhiên, từ nơi có địa hình bình thường đến nơi có địa hình phức tạp, đâu củng có vi sinh vật Ở nơi giàu chất hữu cơ, không khí, bề mặt vật, thể người, động vật, nơi nhiệt độ cao đến nơi có nhiệt độ thấp Vi sinh vật có khả thích ứng môi trường Chính khả tuyệt vời mà vi sinh vật tồn điều kiện khắc nghiệt Thông thường, để phân lập giống vi sinh vật nhằm thu nhận enzyme ta dung ba cách phân lập: − Phân lập giống điều kiện tự nhiên − Phân lập giống điều kiện sản xuất − Phân lập giống từ mẩu giống hỏng Tùy vào khả điều kiện thực tế mà ta chọn cách phân lập cho có hiệu Mổi cách phân lập có ưu điểm khác biệt: 1.1.4.1: Phân lập giống điều kiện tự nhiên Trong điều kiên tự nhiên, vi sinh vật để tồn thích ứng nhanh vi sinh vật cần phải có khả sinh tổng hợp thập nhiều loại enzyme, để chuyển hóa nhanh chất có môi trường thành vật chất cung cấp cho tế bào Điều không phù hợp để sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp với loại enzyme có hoạt tính mạnh Do phát triển điều kiện tự nhiên nên vi sinh vật phải đối phó lúc với hàng loạt tác nhân ngoại cảnh phải phân giải hàng loạt chất khác Nên vi sinh vật phải tổng hợp nhiều loại enzyme lúc với tốc độ nhanh Ở điều kiện tự nhiên sản xuất công nghiệp có khác biệt đáng kể khả sinh tổng hợp enzyme giống vi sinh vật Các vi sinh vật sinh tổng hợp điều kiện tự nhiên gọi chung vi sinh vật hoang _ Svth: Trần Đình Mạnh Đồ án thực phẩm dại Chúng quen thuộc với thay đổi thất thường tự nhiên Khi đưa vào điều kiện sản xuất công nghiệp với nhiều điều kiện môi trường cố định, đòi hỏi loài vi sinh vật giống phải có thời gian thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp Tập cho chúng thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp điều cần thiết Trong trình sinh sản phát triển, cạnh tranh loài vi sinh vật, vi sinh vật điều kiện tự nhiên xảy thường biến đột biến Những đột biến thường cho hai hiệu ứng: gây cho cá thể chết, hai nhiều đột biến tạo loài vi sinh vật có khả sinh tổng Các loài vi sinh vật có khả sinh tổng hợp loại enzyme thường tập trung môi trường chất tương ứng Dựa vào đặc điểm dể dàng xác định vị trí cần phân lập loài vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme mà cần ta Ví dụ: Nếu ta muốn phân lập VSV có khả sinh tổng hợp amylase cao, ta phải tìm nơi có chứa nhiều tinh bột tự nhiên, muốn phân lập VSV có khả sinh tổng hợp amylase cần phải tìm nơi có nhiều protein tự nhiên hợp enzyme cao Việc gây đột biến có ý nghĩa cần tiến hành Những đột biến kiểu thường bền vững, thích hợp để đưa vào sản xuất quy mô công nghiệp 1.1.4.2: Phân lập giống điều kiện sản xuất Các giống phân lập điều kiện sản xuất thường thích nghi với điều kiện môi trường sản xuất Nhờ sau phân lập, giống không cần qua giai đoạn sản xuất thử, thí nghiệm Các giống phân lập điều kiện sản xuất thường giống chọn lọc qua trình biến đổi gen Và có đặc điểm sinh hóa hẳn giống vi sinh vật hoang dại _ Svth: Trần Đình Mạnh Đồ án thực phẩm Mật độ tế bào vi sinh vật điều kiện sản xuất ( dịch lên men, dịch nước thải, chất thải trình lên men ) thường cao Do đó, khả thu nhận chủng vi sinh vật có sinh tổng hợp cao thường cao 1.1.4.3: Phân lập giống mẫu giống hư hỏng Các ống giống bị nhiễm trình bảo quản bị nhiễm, nhiều tế bào giống vi sinh vật bị thoái hóa, nhiều tế bào vi sinh vật chưa bị thoái hóa Việc phân lập lại từ loại giống đạt kết tốt 1.1.5: Quá trình phân lập nấm mốc Aspergilus Oryzae Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzyme amylase Ở nấm mốc, nguồn chất thích hợp cho trình sinh tổng hợp enzim amylase tinh bột Chúng ta phân lập từ đất, thức ăn hay mua trực tiếp từ nhà cung cấp nấm mốc giống Ưu điểm giống mua thời gian bảo quản hiệu suất chất lượng giống đảm bảo chắn Tuy nhiên, trình phân lập giống cho kết đầy thú vị có ý nghĩa việc bổ sung chủng giống phòng thí nghiệm Quá trình lấy mẩu: lấy từ mẩu đất ẩm khoảng 100g mẩu lấy từ khoai tây cắt lát đem chon xuống đất Khoảng ngày đào lấy lát khoai tây lên,rủ đất cát bám bề mặt khoai Tiến hành phân lập : − Nghiền mẫu mẫu khoai tây − Lấy 10g mẫu đất mẫu khoai tây nghiền cho vào 90ml nước cất vô trùng sau đảo trộn mẫu − Dùng pipet hút 10ml dung dịch mẫu ban đầu cho vào ống nghiệm khác chứa 90ml nước cất vô trùng _ Svth: Trần Đình Mạnh Đồ án thực phẩm − Tiếp tục pha loãng mẫu nồng độ 10 -3,10-4 ống nghiệm − Hút 0,1ml cho vào đĩa Petri chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho nấm mốc phát triển, môi trường PDA (Potato Dextro Agar) − Dùng que trải, trải chất dinh dưỡng bề mặt môi trường, đem ủ nhiệt độ phòng ngày − Mốc sử dụng nguồn tinh bột làm chất, nên chổ xuất quầng sáng xung quanh thể lạc − Nhận biết cách bổ sung Iodine vào môi trường trước cấy Có tác dụng làm chất thị cho tinh bột − Cấy truyền nấm mốc đặt trưng môi trường PDA ống thạch nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển 72h, sau dự trữ máy làm đông Nhân giống vi sinh vật bình tam giác (qui mô nhỏ) Đổ 10ml H2O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm Lắc cho bào tử hoà trộn vào môi trường đến tạo dung dịch huyền phù Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có chứa môi trường sinh trưởng nấm KH2PO4 NH4NO3 KCl 1,4 10 0,5 MgSO4.7H2O FeSO4.7H2O Hồ tinh bột 0,1 0,01 20 pH=6,5 _ Svth: Trần Đình Mạnh Đồ án thực phẩm Phân phối khoảng 30 – 40ml môi trường vào erlen 50ml đem khử trùng Autoclave 1210C 15 phút sau để nguội đến nhiệt độ phòng Sau đem ủ 25 – 300C vòng 72 máy lắc 200 vòng/phút Sau nhân giống thành công sử dụng đem bảo quản dự trữ, để có hiệu cao cho nấm mốc giống ta cần có phương pháp bảo quản thích hợp 1.1.6: Phương pháp bảo quản Mục đích bảo quản giống vi sinh vật dùng sãn xuất enzyme đảm bảo tính ổn định trình sinh tổng hợp enzyme, tính ổn định hoạt tính enzyme Sau số phương pháp bảo quản: − Cấy truyền bảo quản lạnh: dựa nguyên tắc vi sinh vật hạn chế trình trao đổi chất điều kiện lạnh, khoảng thời gian định Trong thời gian vi sinh vật bảo tồn khả sinh tổng hợp enzyme − Bảo quản giống đất cát: Trong môi trường tối thiểu có độ ẩm thấp, vi sinh vật bảo tồn khả sinh tổng hợp enzyme thời gian dài Phương pháp phù hợp để bảo quản giống mốc Aspergilus Oryzae − Bảo quản giống hạt ngủ cốc: Bào tử nấm mốc hạt ngủ cốc xử lý nhiệt có độ ẩm < %, giữu khả sinh tổng hợp enzyme khoảng thời gian dài 1.2 Tổng quan enzyme amylase 1.2.1 Enzyme amylase Amylase hệ enzyme phổ biến tự nhiên.Enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải nội phân tử nhóm Polysaccharide với tham gia nước: R.R’ + H-OH  RH + R’OH _ Svth: Trần Đình Mạnh 10 Đồ án thực phẩm Có loại enzyme xếp thành nhóm: Endoamylase (enzyme nội bào) Exoamylase (enzyme ngoại bào) Endoamylase gồm có α-amylase nhóm enzyme khử nhánh Nhóm enzyme khử nhánh chia thành loại: khử trực tiếp Pullulanase ( hay α– dextrin6-glucosidase ); khử gián tiếp Transglucosylase( hay oligo-1,6glucosidase) Maylo-1,6-glucosidase.Các enzyme thủy phân liên kết bên chuỗi Polysaccharide Exoamylase gồm có β-enzyme γ-enzyme Đây enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử chuỗi Polysaccharide => Cơ chế tác dụng amylase tinh bột glycogen: Tinh bột: Là nhóm Carbohydrate thực vật, có chủ yếu loại củ khoai lang, khoai tây , khoai mì … loại hạt ngũ cốc , loại hạt có công thức tổng quát () Các loại tinh bột C 6H12O12)n Tinh bột từ nguồn khác có cấu tạo từ amylase amylopectin (Meyer, 1940có 20-30% amylase 70-80% amylopectin Trong thực vật, tinh bột xem chất dự trữ lượng quan trọng − Amylase có trọng lượng phân tử từ 50000 đến 160000 Da , cấu tạo từ 200-1000 phân tử D-glucose nối với liên kết α-1,4glusoside tạo thành mạch nhánh dài không phân nhánh − Amylopectin có khối lượng phân tử từ 400000 đến hang chục triệu Da, cấu tạo từ 600-6000 phân tử D-glucose, nối với liên kết α-1,4-glusoside α-1,6-glusoside tạo thành mạch có nhiều nhánh, tinh bột không tan nước lạnh đun nóng đến 60 o-85oC tinh bột bị hồ hóa gọi hồ tinh bột Dưới tác dụng enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân liên kết glucoside bị phân cắt Sự thủy phân tinh bột amylase xảy theo hai mức độ: dịch hóa _ Svth: Trần Đình Mạnh 11 Đồ án thực phẩm đường hóa Kết dịch hóa tạo sãn phẩm trung gian dextrin, dextrin tiếp tục bị đường hóa sãn phẩm maltose glucose − Cabohydrate thực phẩm nguồn cung cấp lượng quan trọng cho thể người Rau củng nguồn cung cấp tinh bột, phân tinh bột chuyển hóa thành disaccharide glucose Cabohydrate có mặt hầu hết loại thực phẩm, cung cấp đường tinh bột Glycogen : Là loại Cabohydrate dự trữ, động vật dự trữ thể chuyển hóa từ từ để sử dụng Glycogen cấu tạo từ glucose liên kết với lien kết α-1,4-glusoside vị trí phân nhánh α-1,6-glusoside Glycogen có nhiều mạch tinh bột, phân tử khối khoảng 2000000 đến 3000000 Da Glycogen dể tan nước, ăn thức ăn có nhiều thể dự trữ dạng chất béo chủ yếu gan 1.2.2: Đặc tính enzyme α-amylase Enzyme α-amylase từ nguồn khác có thành phần amino acid khác nhau, loại enzyme α-amylase có tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng Enzyme α-amylase protein giàu tyrosine, ryptophan, acid glutamic aspartic Các acid glutamic acid aspartic chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme: − α-amylase có methionine có khoảng đến 10 gốc cysteine − Trọng lượng phân tử α-amylase nấm mốc khoảng 45000 đến 50000 Da − α-amylase dể tan nước, dung dịch muối loãng rượu loãng − Protein α-amylase có tính acid yếu có tính chất globoline − Điểm đẵng điện α-amylase nằm khoảng pH= 4,5-5,7 − α-amylase metaloenzyme Mỗi phân tử α-amylase có chứa 1-3 nguyên tử gam Ca/mol, không 1-6 nguyên tử gam/mol Ca _ Svth: Trần Đình Mạnh 12 Đồ án thực phẩm tham gia hình thành cấu trúc nguyên tử bậc enzyme, trì hoạt động enzyme (Modolova, 1965) Do đó, Ca có vai trò trì tồn emzyme bị tác dụng tác nhân gây biến tính tác động enzyme phân giải protein Nếu α-amylase bị loại bỏ hết Ca bị hoàn toàn khả thủy phân chất α-amylase bền với nhiệt enzyme khác đặc tính có lẻ liên quan đến hàm lượng Ca phân tử nồng độ Mg2+ Tất amylase bị kìm hãm kim loại nặng Cu2+, Ag+, Hg2+ Một số kim loại Zn 2+, Cr3+, Li+, Mn2+, Na+, Co2+, Sn2+ ảnh hưởng đến α-amylase Thành phần amino acid α-amylase nấm mốc Aspergillus sau (g/100g protein): alamine =6,8; glycine=6,6; valine=6,9; leusine=8,3; Isoleusine=5,2; prolin= 4,2; phenylalanine=4,2; tyrosine= 9,5; trytophan=4; xetin= 6,5; trionin=10,7; cystein + cystine = 1,6; glutamic acid = 6,9; amide=1,5 ( Akabory et amiloza, 1954 ) Không giống α-amylase khác, amylase Aspergilus Oryzae có chứa thành phần phi protein polysacchalide Polyose bao gồm mol maltose, mol glucose, mol hesozamin mol enzyme (Akabory et amiloza,1965) Vai trò polyose vẫn chưa rỏ, biết tham gia vào phần trung tâm hoạt đọng nằm phía phân tử emzyme α-amylase nấm mốc hầy công hạt tinh bột bị tổn thương.Sãn phẩm cuối glucose maltose Đối với sợi nấm tỷ lệ 1:3,97 ( Hanrahan, Caldwell,1953) α-amylase sợi nấm không công liên kết α-1,6 glucoside amylopectin , nên thủy phân sẻ tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh Đây cấu trúc tinh bột enzyme α-amylasephân cắt tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh _ Svth: Trần Đình Mạnh 13 Đồ án thực phẩm Sản phẩm thủy phân cuối tinh bột tác dụng amylase, nấm sợi chủ yếu maltose, thứ đến maltotriose Khi nồng độ α - amylase vi sinh vật tương đối chuyển hóa 70 – 85% tinh bột thành đường lên men Còn α – amylase nấm mốc mức độ đến glucose maltose lên tới 84-87% Điều kiện hoạt động α-amylase từ nguồn khác không giống PH tối thích cho hoạt động α – amylase từ nấm sợi 4,0- 4,8 (có thể hoạt động tốt vùng ph từ 4,5-4,8) Theo số liệu Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa đường hóa chế phẩm từ amylase từ Asp.oryzea vùng 5,6- 6,2 Còn số liệu Fnixova pH tối thích cho hoạt động dextrin 6,0- 7,0 Độ bền tác dụng acid khác α – amylase Asp.oryzea bền vững acid α – amylase malt vi khuẩn Bas.sublitis Ở pH 3,6 00 C, α – amylase malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 1530 phút ; α – amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, hoạt lực α – amylase nấm sợi không giảm Trong dung dịch α – amylase nấm sợi bảo quản tốt pH =5,0- 5,5; α – amylase dextrin hóa nấm sợi đen _ Svth: Trần Đình Mạnh 14 Đồ án thực phẩm chịu đựng pH từ 2,5- 2,8 Ở nhiệt độ 0C pH = 2,5, bất hoạt hoàn toàn sau Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác α – amylase từ nguồn khác không đồng nhất, α – amylase nấm sợi nhạy cảm tác động nhiệt Nhiệt độ tối thích 500C bị vô hoạt 700C Trong dung dịch đệm pH = 4,7 α – amylase Asp.oryzea nhạy cảm với tác động nhiệt độ cao, chí nhiệt 40 0C vòng hoạt lực dextrin hóa 22-29%, hoạt lực đường hóa 27- 85% Ở 50 0C vòng giờ, α – amylase nấm sợi bị vô hoạt hoàn toàn ( Miller cộng ) 1.2.3 Cơ chế tác dụng α-amylase : Enzyme α-amylase có khả phân cách liên kết α-1,4-glusoside nằm bên phần tử chất ( tinh bột glucogen ) cách ngẫu nhiên, không theo trật tự α-amylase không thủy phân hồ tinh bột mà thủy phân hạt tinh bột nguyên với tốc độ chậm Quá trình thủy phân tinh bột α-amylase trình đa giai đoạn : − Ở giai đoạn đầu (dextrin hóa ) có số phần tử chất bị thủy phân thành lượng lớn dextrin phân tử thấp ( α-dextrin ) Độ nhớt hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose amylopectin bị dịch hóa nhanh ) − Giai đoạn (đường hóa ) : dextrin phân tử thấp tiếp tục phân hủy thành tetra-trimaltose Các chất bị thủy phân chẩm αamylase disaccharide monosaccharide Dưới tác dụng αamylase, amylose bị phân hủy nhanh thành oligosaccharide gồm 67 gốc glucose (vì vậy, người ta cho α-amylase phân cắt amylose thành đoạn 6-7 gốc glucopiranose 1) − Giai đoạn : oligosaccharide bị phân cách tạo nên mạch polyglucose collagen ngắn dần , bị phân giải châm đến _ Svth: Trần Đình Mạnh 15 Đồ án thực phẩm maltotetrose maltose Qua thời gian tác dụng dài , sản phẩm thủy phân amylose chứa 13% glucose 87% maltose.Tác dụng αamylase lên amylopectin xảy tương tự không phân cắt liên kết α -1,6 glycoside chổ mạch nhánh phân tử amylopectin nên dù có tác dụng lâu sản phẩm cuối cùng, đường nói (72% maltose 19% glucose), có dexin phan tử thấp isomaltose 8% Tóm lại, tác dụng α-amylase , tinh bột chuyển thành maltotetrose , maltose , glucose dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-amylase thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không màu với Iot maltose Khả dextrin hóa cao tính chất đặc trưng αamylase Vì người ta thường gọi amylase amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa 1.2.4: Lịch sử phát enmyme: Vào đầu kỷ XIX, nhà nghiên cứu tách các chất gây trình lên men Năm 1814, Kirchoff phát nước chiết mầm đại mạch có khả chuyển hóa tinh bột thành đường nhiệt độ thường Đây công trình thu chế phẩm dạng dung dịch lịch sử ngành enzyme học Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp Payen Fessoz chứng minh chất làm phân giải tinh bột thành đường tách dạng bột Thí nghiệm tiến hành cánh cho etanol vào dung dịch chiết hạt đại mạch nảy mầm thấy xuất kết tủa Kết tủa chuyển hóa tinh bột đun kết tủa khả chuyển hóa 1.3: Công nghệ lên men tạo enzyme α-amylase : 1.3.1: Giới thiệu pương pháp lên men bề mặt _ Svth: Trần Đình Mạnh 16 Đồ án thực phẩm Cuối kỷ 19 đầu kỷ 20, việc nuôi cấy VSV thường thực theo phương pháp bề mặt Phương pháp phát triển rộng rãi, không để thu nhận chế phẩm enzyme mà trước tiên phương pháp thu nhận kháng sinh số trình lên men truyền thống 1.3.1.1 Ưu nhược điểm phương pháp nuôi cấy bề mặt Phương pháp nuôi cấy bề mặt phương pháp tạo điều kiện cho VSV phát triển bề mặt môi trường Những ưu điểm phương pháp nuôi cấy bề mặt là: − Nuôi cấy bề mặt dễ thực Quy trình công nghệ thường không phức tạp − Lượng enzyme tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao nhiều so với nuôi cấy chìm Đây đặc điểm ưu việt quan trọng giải thích phương pháp nuôi cấy bề mặt phát triển mạnh trở lại − Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh khối VSV, enzyme nước ) Sau thu nhận dễ sấy khô dễ bảo quản − Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, việc vận hành công nghệ việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn − Trong trường hợp bị nhiễm VSV lạ, ta dễ dàng xử lý Môi trường đặc môi trường tĩnh, xáo trộn nên khu vực bị nhiễm ta cần loại bỏ khu vực khỏi toàn khối nuôi cấy Những khu vực khác hoàn toàn an toàn Phương pháp nuôi cấy bề mặt có ưu điểm cần quan tâm để khắc phục hoàn thiện dần phương pháp Nhược điểm lớn dễ nhận thấy là: Phương pháp tốn lớn diện tích cho nuôi cấy Trong phương pháp VSV phát triển bề mặt môi trường ( môi trường lỏng môi trường bán rắn) nên cần nhiều diện tích _ Svth: Trần Đình Mạnh 17 Đồ án thực phẩm a) Môi trường lỏng Ở môi trường lỏng, VSV phát triển bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng ( môi trường ) pha khí ( không khí ) Ở đây, VSV sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, O từ không khí, tiến hành trình tổng hợp enzyme Enzyme ngoại bào tách từ sinh khối hòa tan vào dung dịch môi trường Enzyme nội bào nằm sinh khối VSV Nuôi cấy VSV thu nhận enzyme môi trường lỏng theo phương pháp cấy bề mặt thường tiến hành khay có chiều cao khoảng 12-15 cm, chiều rộng chiều dài thiết kế tùy theo kích thước phòng nuôi cho thuận tiện thao tác Ở người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng Nếu chiều cao môi trường lỏng lớn, VSV khả đồng hóa hết chất dinh dưỡng phía đáy khay nuôi cấy Nếu chiều cao môi trường nhỏ, thiếu thành phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzyme không cao Trong nghiều nhà máy, người ta thường tạo môi trường khay nuôi cấy có chiều cao môi trường từ 5-7 cm hợp lý b) Môi trường đặc Phần lớn nhà máy sản xuất enzyme, nuôi cấy VSV thu nhận enzyme, người ta thường sử dụng môi trường đặc Để tăng khả xâm nhập không khí vào lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường Trong trường hợp này, VSV phát triển bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường sinh tổng hợp enzyme nội bào ngoại bào _ Svth: Trần Đình Mạnh 18 Đồ án thực phẩm Các enzyme ngoại bào thẩm thấu vào hạt môi trường, enzyme nội bào nằm sinh khối VSV VSV không phá triển bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn ( môi trường ) pha khí ( không khí ) mà phát triển bề mặt hạt môi trường nằm hẳn lòng môi trường Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao vừa phải có độ ẩm thích hợp Nếu độ ẩm cao làm bết môi trường lại, không khí xâm nhập vào lòng môi trường, có độ ẩm thấp không thuận lợi cho VSV phát triển Thông thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% W hợp lý Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu để nuôi cấu VSV thu nhận enzyme, người ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi không khí dễ xâm nhập vào lòng môi trường Phương pháp nuôi cấy bề mặt bán rắn (môi trường đặc ) thích hợp cho len men nấm mốc Asp.oryzae 1.3.2: Sản xuất nấm mốc giống – tạo sinh khối 1.3.2.1: Nguyên liệu cho sản xuất giống mốc Gạo nếp : nước 14%; Glucid 79,4%; Lipid 1,5% Protein 8,2% protein gạo nếp chủ yếu glutein ( oryzaine ) glubuline, có cozine prolamin Glucid gạo nếp chủ yếu tinh bột, đường, cellulose hemicellulose Trong tinh bột chủ yếu amylopectin, có số vitamin B1, B2, B6,PP E Gạo tẻ : nước 13,84%; glucid 77,55%; protein 7,35%; lipit 0,52%; cellulose 0,18% muối khoáng 0,54% _ Svth: Trần Đình Mạnh 19 Đồ án thực phẩm Bột mì : nước 11,6%; glucid 72% ;lipit 4,8%; protein 9%; cellulose 1,5%; muối khoáng 1,2% Bắp mảnh : nước11,4%; glucid 87,9%; lipit0,8%; protein 8,5%; cellulose0,4%; muối khoáng 0,4% 1.3.2.2: Chuẩn bị mốc giống Nuôi cấy giống bao gồm: − Trong ống thạch nghiêng hay giữ giống ống nghiệm − Trong bình tam giác (nhân giống nhỏ) − Trên sàng, khay (nhân giống lớn) a) Nuôi cấy ống thạch nghiêng Sau phân lập thành công môi trường chọn lọc từ đĩa petri cấy chuyển mốc sợi sang (hay lấy nấm mốc từ ống giống) ống thạch khác Yêu cầu ống giống phải tuyệt đối đảm bảo khiết, không lẫn lộn loài VSV khác Môi trường thạch nghiêng phải đảm bảo đầy đủ dinh dưỡng Tiếp tục nhân giống nuôi cấy đạt sinh khối theo mong muốn b) Nuôi cấy bình tam giác Cách làm môi trường bình tam giác: Môi trường gạo tẻ: gạo tẻ loại tốt, nấu cơm bình thường, hạt cơm chín không bị nhão không khô Độ ẩm khoảng 45%, để nguội bóp rời _ Svth: Trần Đình Mạnh 20 Đồ án thực phẩm hạt Cho vào bình tam giác thành lớp dày khoảng 1cm Đậy nút bình tam giác nút chống ẩm, hấp trùng P= 1atm vòng 30-45 phút Môi trường mảnh ngô: ngô mảnh có kích thước khoảng 0,2-0,5 mm, cho nước vào theo tỷ lệ 90% trọng lượng so với ngô, trộn khay khoảng 1-2h để nước ngấm Sau đó, bóp tơi cho vào bình tam giác lớp dày khoảng 1cm, đậy nút bình giấy chống ẩm Hấp trùng đồng thời làm chín P= 1atm, 120oC, thời gian 60 phút Lấy để nguội lắc cho khỏi bị vón cục Môi trường cám: chọn cám tốt, loại thô, không cần mịn hạt Sau làm tương tự mảnh ngô Thường sử dụng bình tam giác có dung tích 0,3-0,5 lít hay 1lít có cổ rộng Sau chuẩn bị môi trường bình thủy tinh, ta tiến hành nuôi cấy nấm mốc Trước tiên cần phải chuẩn bị 5ml nước vô trùng cho vào ống nghiệm Sau đó, đổ thêm nước vô trùng để hòa tan bào tử đồng thời cấy truyền chúng sang bình tam giác Trung bình ống nghiệm cấy truyền cho 23 bình tam giác dung tích lít Lắc cho giống phân bố môi trường tiến hành nuôi cấy chúng điều kiện thích ứng, thường nuôi 5-6 ngày Yêu cầu giai đoạn tạo nhiều bào tử khỏe mạnh, trường hợp thấy bình bị nhiễm phải bỏ c) Nuôi cấy mốc khay Chuẩn bị môi trường làm nấm mốc khay: nguyên liệu thường dùng ngô mảnh có kích thước 0,2-0,5 mm, trộn với nước theo tỷ lệ 80-90% trọng lượng so với ngô hấp áp suất cao Trộn xong để khoảng 3-4 để ngấm nước hấp chín Thời gian hấp khoảng 3-4h, lâu so với cám gạo Nguyên _ Svth: Trần Đình Mạnh 21 Đồ án thực phẩm liệu sau hấp chín đều, không bết hay khô Độ ẩm lại khoảng 45-50% vừa Cách gieo cấy nuôi mốc khay: nguyên liệu dở làm nguội nhanh, bóp tay cho tơi ra, nhiều dùng máy đánh tơi quạt để làm nguội Sau làm nguội đến 26-28 oC trộn nước giống từ bình tam giác theo tỷ lệ 0,5-1% với tỷ lệ cao Sau trộn giống, ủ môi trường vào khay thành luống cao 30cm Đặt nhiệt độ 30-32oC, ẩm 85-100% Thời gian ủ 6-8h, nhiệt độ khối môi trường lên tới 34-36oC bào tử nảy mần gần hết chưa thành sợi dài Lúc cần rải môi trường thành lớp mỏng 2-3cm, cần giữ cho nhiệt độ môi trường không vượt 36oC Lượng nhiệt tỏa nhiều khoảng 10-14 sau trộn giống Sau nuôi 34-36 giờ, nhiệt độ khối môi trường bắt đầu giảm, cần phải điều chỉnh nhiệt độ lên 34-35oC, để trình hình thành bào tử nấm mốc Thời gian nuôi mốc giống khay kéo dài khoảng 60 giờ, hình thành bào tử châm phải kéo dài đến 70-72 Mốc giống lấy thường có độ ẩm 30-32%, dùng làm giống cho công đoạn sản xuất Nếu dùng phải đem sấy đến độ ẩm 8%, giữ dùng dần cung cấp giống cho đơn vị sản xuất khác Nhiệt độ phòng sấy không 40 oC bao giống cần bảo quản nơi thoáng mát tránh ánh nắng Thời gian bảo quản tùy điều kiện có thể, 1-2 tháng lâu 1.3.3 Quy trình sãn xuất 1.4.1 Quy trình lên men công nghiệp tạo enzim α-amylase 1.4.1.1 nguyên liệu _ Svth: Trần Đình Mạnh 22 Đồ án thực phẩm Nguồn tinh bột: nước ta nguồn nguyên liệu chứa tinh bột vô đa dạng phong phú Nhưng để phù hợp với sản xuất enzim amylase cần phải tính đến chi phí cho giá thành sản phẩm Do nguồn nguyên liệu cần quan tâm trọng mức độ rẻ tiền dể kiếm Đây lợi quan cho nhà sản xuất người tiêu dùng để có giá thành thấp sãn xuất đại trà _ Svth: Trần Đình Mạnh 23 Đồ án thực phẩm _ Svth: Trần Đình Mạnh 24 [...]... phong phú Nhưng để phù hợp với sản xuất enzim amylase thì cần phải tính đến chi phí cho giá thành sản phẩm Do vậy nguồn nguyên liệu cần được quan tâm và chú trọng về mức độ rẻ tiền và dể kiếm Đây là một lợi thế quan trong cho nhà sản xuất và người tiêu dùng để có giá thành thấp và được sãn xuất đại trà _ Svth: Trần Đình Mạnh 23 Đồ án thực phẩm ... cung cấp giống cho các đơn vị sản xuất khác Nhiệt độ phòng sấy không được quá 40 oC các bao giống cần được bảo quản nơi thoáng mát tránh ánh nắng Thời gian bảo quản tùy điều kiện có thể, 1-2 tháng hoặc lâu hơn 1.3.3 Quy trình sãn xuất 1.4.1 Quy trình lên men công nghiệp tạo enzim α -amylase 1.4.1.1 nguyên liệu _ Svth: Trần Đình Mạnh 22 Đồ án thực phẩm Nguồn tinh bột: ở nước... thích cho hoạt động của α – amylase từ nấm sợi là 4,0- 4,8 (có thể hoạt động tốt trong vùng ph từ 4,5-4,8) Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm từ amylase từ Asp.oryzea trong vùng 5,6- 6,2 Còn số liệu của Fnixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin của nó là 6,0- 7,0 Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác nhau α – amylase của Asp.oryzea bền... Trần Đình Mạnh 13 Đồ án thực phẩm Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của amylase, nấm sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose Khi nồng độ α - amylase vi sinh vật tương đối có thể chuyển hóa 70 – 85% tinh bột thành đường lên men Còn các α – amylase của nấm mốc thì mức độ đến glucose và maltose có thể lên tới 84-87% Điều kiện hoạt động của α -amylase từ các nguồn khác nhau không... có công thức tổng quát là () Các loại tinh bột đều C 6H12O12)n Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ amylase và amylopectin (Meyer, 1940có 20-30% amylase và 70-80% amylopectin Trong thực vật, tinh bột được xem là chất dự trữ năng lượng quan trọng − Amylase có trọng lượng phân tử từ 50000 đến 160000 Da , được cấu tạo từ 200-1000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4glusoside tạo... mặt trong hầu hết các loại thực phẩm, cung cấp đường và tinh bột Glycogen : Là một loại Cabohydrate dự trữ, ở động vật được dự trữ trong cơ thể và chuyển hóa từ từ để sử dụng Glycogen được cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau bởi lien kết α-1,4-glusoside ở các vị trí phân nhánh và α-1,6-glusoside Glycogen có nhiều mạch hơn tinh bột, phân tử khối khoảng 2000000 đến 3000000 Da Glycogen dể tan trong. .. của Asp.oryzea bền vững đối với các acid hơn là α – amylase của malt và vi khuẩn Bas.sublitis Ở pH 3,6 và 00 C, α – amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 1530 phút ; α – amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α – amylase của nấm sợi không giảm là bao nhiêu Trong dung dịch α – amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH =5,0- 5,5; α – amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể ... Svth: Trần Đình Mạnh 14 Đồ án thực phẩm chịu đựng pH từ 2,5- 2,8 Ở nhiệt độ 0 0C và pH = 2,5, nó chỉ bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác α – amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α – amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt Nhiệt độ tối thích của nó là 500C và bị vô hoạt ở 700C Trong dung dịch đệm pH = 4,7 thì α – amylase của Asp.oryzea rất... _ Svth: Trần Đình Mạnh 15 Đồ án thực phẩm maltotetrose và maltose Qua một thời gian tác dụng dài , sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose.Tác dụng của amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng không vì phân cắt liên kết α -1,6 glycoside ở chổ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72%... có khoảng 7 đến 10 gốc cysteine − Trọng lượng phân tử α -amylase nấm mốc khoảng 45000 đến 50000 Da − α -amylase dể tan trong nước, dung dịch muối loãng và rượu loãng − Protein của các α -amylase có tính acid yếu và có tính chất của globoline − Điểm đẵng điện của α -amylase nằm trong khoảng pH= 4,5-5,7 − α -amylase là một metaloenzyme Mỗi phân tử α -amylase đều có chứa 1-3 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ... …các trình phản ứng sinh học, trình thu nhận, tinh sản phẩm kiểm soát hoàn toàn Sản phẩm tạo có định hướng rỏ ràng từ khâu chọn giống vi sinh vật cuối trình thu nhận sản phẩm Do chất lượng sản phẩm. .. vật cần phải tổng hợp nhiều chất Do sản phẩm tạo chứa nhiều loại khác Chính thế, giống vi sinh vật dung sản xuất loại sản phẩm đó, sản phẩm phải trội sản phẩm khác số lượng chất lượng − Giống... thích hợp để đưa vào sản xuất quy mô công nghiệp 1.1.4.2: Phân lập giống điều kiện sản xuất Các giống phân lập điều kiện sản xuất thường thích nghi với điều kiện môi trường sản xuất Nhờ sau phân