Sản xuất thuốc công nghệ DNA tái tổ hợp Insulin Insulin protein tuyến tụy tiết nhằm điều hòa lượng đường máu Cơ thể thiếu hụt insulin máu làm rối loạn hầu hết trình trao đổi chất thể, dẫn đến tích tụ nhiều đường nước tiểu Trong thể, insulin tổng hợp dạng proinsulin gồm ba chuỗi polypeptide: A, B C Khi proinsulin chuyển thành insulin, chuỗi C loại bỏ, hai chuỗi A B nối với hai cầu disulfide (-S-S-) Để điều trị bệnh người ta thường tiêm insulin cho người bệnh Chế phẩm insulin tách chiết từ tuyến tụy gia súc Tuy nhiên, để có 100 gram insulin người ta phải sử dụng tụy 4.000-5.000 bò Vì vậy, giá thành insulin trước cao Mặt khác, cấu tạo insulin bò khác với insulin người nên máu bệnh nhân điều trị insulin bò xuất kháng thể insulin bò Điều gây số hậu không mong muốn làm giảm phần hoạt tính insulin giảm thời gian tác động thuốc Boger (1978) lần sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp thông qua vi khuẩn E coli thu nhận lượng lớn insulin Cụ thể, người ta chuyển gen mã hóa tính trạng sản xuất insulin người sang cho E coli Vi khuẩn E coli tái tổ hợp gen nuôi cấy nồi lên men có dung tích 1.000 L, sau thời gian ngắn thu 200 g insulin, tương đương với lượng insulin chiết rút từ 8.000-10.000 bò Thành công cho thấy gen người làm việc cách hiệu genome vi sinh vật Hai sản phẩm thương mại insulin (được sản xuất từ nấm men S cerevisiae tái tổ hợp) sử dụng là: Actrapid Novolog (NovoNordisk) Interferon Interferon có chất protein, yếu tố miễn dịch không đặc hiệu, giúp thể chống lại nhiều loại bệnh interferon có phổ tác dụng kháng virus rộng Thông thường để thu nhận interferon, người ta phải tách chiết chúng từ huyết máu nên tốn Bằng phương pháp công nghệ DNA tái tổ hợp tương tự insulin, người ta thu nhận lượng lớn interferon thông qua thể vi sinh vật tái tổ hợp gen để phục vụ cho việc điều trị bệnh nhiễm trùng viêm gan B, viêm gan C, số bệnh ung thư virus Gilbert (1980) đoạt giải thưởng Nobel nhờ thành công việc thu nhận interferon từ E coli tái tổ hợp gen mã hóa interferon Đến năm 1981, Đại học Washington (Mỹ) thành công việc thu nhận interferon từ nấm men S cerevisiae có hiệu suất cao gấp 10.000 lần so với tế bào E coli tái tổ hợp 3.1 Hormone sinh trưởng người (human growth hormone-HGH) Hormone Thông thường, HGH động vật có vú sản xuất từ tuyến yên động vật non suốt thời gian trước chúng trưởng thành HGH có tác dụng tăng tốc độ sinh trưởng kích thích thể tăng khối lượng Ở người sau 30 tuổi, sản xuất hormone sinh trưởng dừng lại, tiêm HGH sau độ tuổi gây phát triển bắp lượng mỡ giảm xuống Hormone sinh trưởng người protein chứa khoảng 191 amino acid, thiếu thể người bị lùn Trước hormone phát triển tách từ tuyến yên người chết Mỗi tử thi cho khoảng 4-6 mg HGH muốn chữa khỏi cho người lùn phải cần lượng HGH thu từ 100-150 tử thi Điều cho thấy trở ngại lớn chữa trị chứng lùn cho trẻ em Hiện nay, HGH sản xuất công nghệ DNA tái tổ hợp thông qua E coli với hiệu suất lớn (1 L dịch lên men E coli thu HGH tương đương với lượng chất thu từ 60 tử thi) Đây protein sản xuất công nghệ sinh học đại sớm HGH tái tổ hợp khác với HGH bình thường amino acid, E coli khả loại bỏ gốc methionine khởi đầu mà thường bị loại sau dịch mã tế bào người Insulin hormone sinh trưởng người protein tương đối đơn giản không bị glycosyl hóa biến đổi nhiều hậu dịch mã, nên dùng E coli (prokaryote) làm tế bào vật chủ để sản xuất chúng Đối với protein đòi hỏi trình glycosyl biến đổi hậu dịch mã sử dụng tế bào prokaryote làm tế bào vật chủ công nghệ DNA tái tổ hợp mà phải sử dụng tế bào eukaryote như: nấm men, nấm mốc, thực vật động vật 3.2 Somatostatin Đây loại hormone đặc biệt, thường tổng hợp não động vật người với hàm lượng vô thấp Somatostatin có vai trò điều hòa hormone sinh trưởng insulin vào máu, kiểm tra tổng hợp hai loại hormone Quy trình sản xuất loại sản phẩm sinh học đặc biệt quý bao gồm bước chủ yếu sau đây: + Phân lập gen mã hóa somatostatin tổng hợp ống nghiệm + Tạo dòng gen somatostain cách gắn gen vào vector plasmid để chuyển gen vào E coli Mỗi mẻ nuôi cấy 7,5 L vi khuẩn E coli cho mg somatostatin nguyên chất Trước đây, muốn có khối lượng hormone phải tiến hành năm nguyên liệu lấy từ nửa triệu não cừu Vaccine Trong sản xuất vaccine, thời gian gần đây, người ta sử dụng vaccine bất hoạt vaccine sống nhược độc làm kháng nguyên kích thích tạo kháng thể cần thiết thể người vật nuôi Những vaccine sản xuất theo cách có vài hạn chế, chẳng hạn vaccine sống nhược độc có khả quay trở lại dạng độc hoạt lực giảm nhanh thể người vật nuôi Đến nay, nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp người ta sản xuất protein vỏ số loại virus virus bệnh dại viêm gan B Sản xuất vaccine kỹ thuật gen lĩnh vực phát triển mạnh công nghệ DNA tái tổ hợp Đây loại vaccine bào chế từ vi khuẩn chuyển gen mã hóa tổng hợp protein kháng nguyên loại virus hay loại vi khuẩn gây bệnh Hiện nay, loại vaccine kỹ thuật gen sử dụng cho người bao gồm vaccine viêm gan B, vaccine dại kiểu mới, vaccine tả kiểu mới, vaccine sốt rét vaccine bệnh phong Virus viêm gan B có vỏ lypoprotein Kháng nguyên bề mặt protein chủ yếu vỏ ngoài, phát máu người bị nhiễm Người ta biến nạp gen tổng hợp kháng nguyên virus viêm gan B vào vi khuẩn E coli sau sản xuất sinh khối quy mô lớn vi khuẩn E coli mang gen tái tổ hợp này, biến E coli thành nhà máy sản xuất kháng nguyên để làm vaccine Một số sản phẩm thương mại kháng nguyên bề mặt viêm gan B (được sản xuất từ nấm men S cerevisiae tái tổ hợp) sử dụng là: Ambirix (GlaxoSmithKline), Comvax (Merck), HBVAXPRO (Aventis Pharma), Hexavac (Aventis Pasteur), Infanrix-Penta (GlaxoSmithKline), Pediarix (GlaxoSmithKline), Procomvax (Aventis Pasteur), Twinrix (GlaxoSmithKline) Một số loại thuốc khác Hiện có gần 140 loại protein trị liệu cho phép sử dụng Mỹ châu Âu Các protein trị liệu chia làm hai loại: 1) protein không bị biến đổi hậu dịch mã, 2) protein cần trình hậu dịch mã (hầu hết kiểu N-glycosylation9) để có chức sinh học đầy đủ Các protein trình glycosyl hóa (glycosylation)10, hậu dịch mã, biểu đặc hiệu vi khuẩn E coli nấm men chúng chiếm khoảng 40% thị trường protein trị liệu Tuy nhiên, số chúng biểu hai hệ thống, chẳng hạn insulin tái tổ hợp sản xuất E coli (Humulin, Eli Lilly, Indianapolis, IN, USA) lẫn nấm men (Novolog, Novo Nordisk, Bagsvaerd, Đan Mạch) Sản xuất protein tái tổ hợp thường đòi hỏi trình N- glycosylation trạng thái tự nhiên chúng, hầu hết trường hợp chúng cần vật chủ biểu động vật có vú (hệ thống có khả bắt chước glycosylation người) Các vật chủ prokaryote E coli không glycosyl hóa protein được, hệ thống biểu thuộc eukaryote bậc thấp nấm men tế bào côn trùng thường ổn định để thực glycosylation động vật có vú Tuy nhiên, việc nuôi cấy tế bào động vật có vú gặp nhiều khó khăn như: môi trường dinh dưỡng đắt tiền, thời gian nuôi cấy dài ngày, tế bào mẫn cảm với lực trượt hệ lên men (xem chương 6) Do đó, yêu cầu sinh trưởng cho vật chủ biểu chế phẩm sinh-dược không cải thiện buộc công ty phải quay lại với hệ thống biểu nấm men nấm sợi (eukaryote) chúng có khả cung cấp hiệu suất protein cao (> g/L) trình lên men ngắn ngày, để tăng quy mô sản xuất (lên tới 100 m3) Tất protein trị liệu dựa sở nấm men sản xuất loài nấm men S cerevisiae (Bảng 5.3), loài nấm men khác phát triển để sản xuất protein trị liệu Nấm men Pichia pastoris trước công ty Philips Petroleum (Bartlesville, OK, USA) sử dụng hệ thống sản xuất protein đơn bào, sau biến đổi di truyền để biểu protein ngoại lai Hơn 120 protein tái tổ hợp biểu loại vật chủ này, nhiều số có nguồn gốc từ người động vật có vú Gần hơn, nấm men P pastoris dùng để biểu protein trị liệu (đang thử nghiệm lâm sàng) Công ty Genencor (Palo Alto, CA USA) trước sử dụng nấm sợi Aspergillus niger Trichoderma reesei cho sản xuất quy mô lớn enzyme công nghiệp tái tổ hợp Nhưng gần họ cố gắng biểu protein trị liệu (ví dụ: IgG hoàn chỉnh) A niger Kháng thể sản xuất với hàm lượng < g/L, lắp ráp xác liên kết với kháng nguyên Thành công tương tự với biểu kháng thể nguyên vẹn thu P pastoris, nhiên hàm lượng thấp < 40 mg/L Người ta chứng minh kháng thể sản xuất A niger có tập tính dược động học (pharmacokinetic behavior) hoạt tính ADCC11 tương tự với kháng thể có nguồn gốc từ tế bào động vật có vú Công ty Berna Biotechnology (Bern, Switzerland) phát triển phương pháp biểu protein thích hợp dựa sở nấm men methylotrophic Hansenula polymorpha, loài nghiên cứu để sản xuất vaccine tái tổ hợp  ... Đến nay, nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp người ta sản xuất protein vỏ số loại virus virus bệnh dại viêm gan B Sản xuất vaccine kỹ thuật gen lĩnh vực phát triển mạnh công nghệ DNA tái tổ hợp Đây loại... nay, HGH sản xuất công nghệ DNA tái tổ hợp thông qua E coli với hiệu suất lớn (1 L dịch lên men E coli thu HGH tương đương với lượng chất thu từ 60 tử thi) Đây protein sản xuất công nghệ sinh... chiết chúng từ huyết máu nên tốn Bằng phương pháp công nghệ DNA tái tổ hợp tương tự insulin, người ta thu nhận lượng lớn interferon thông qua thể vi sinh vật tái tổ hợp gen để phục vụ cho việc điều