Chng PHIấN M V DCH M Núi n gen tc l núi n ADN v cỏc quan h ca nú vi ARN v protein s Lý thuyt trung tõm ca Sinh hc phõn t; ú cỏc si n ca ADN c dựng lm khuụn cho tỏi bn (replication) Mt khỏc, cỏc gen cú th lm khuụn cho s tng hp cỏc ARN quỏ trỡnh phiờn mó (transcription) n lt, cỏc phõn t ARN ny li lm khuụn cho s tng hp cỏc chui polypeptide m t ú to thnh cỏc protein, gi l dch mó (translation) Phiờn mó v dch mó l hai giai an chớnh s biu hin ca cỏc gen mó húa protein Trong chng ny, chỳng ta s ln lt tỡm hiu cỏc sau: (i) Quỏ trỡnh phiờn mó; (ii) Cu trỳc v chc nng ca cỏc loi ARN c bn t bo; (iii) Quỏ trỡnh dch mó; v (iv) So sỏnh nhng im liờn quan cỏc t bo prokaryote v eukaryote Phiờn mó (Transcription) 1.1 c im chung ca phiờn mó prokaryote v eukaryote Phiờn mó (transcription) l quỏ trỡnh tng hp cỏc ARN khỏc t thụng tin di truyn cha ng ADN Tr cỏc gen mó húa protein cỏc operon vi khun, núi chung, cỏc ARN mi c tng hp ch l cỏc bn s cp (primary transcript) gi l cỏc pre-ARN Cỏc pre-ARN ny phi tri qua mt quỏ trỡnh sa i tr thnh cỏc ARN trng thnh (mature) trc tham gia vo quỏ trỡnh sinh tng hp protein ca t bo Hỡnh 5.1 Cu trỳc chung ca mt gen hay n v phiờn mó Quỏ trỡnh phiờn mó (Hỡnh 5.2) cú cỏc c im chung sau õy: (i) Din di tỏc dng ca cỏc enzyme ARN polymerase (ii) Vựng ADN cha gen c m xon cc b, v ch mt mch n gi l mch cú ngha (sense) c dựng lm khuụn (template) cho tng hp ARN (iii) Phn ng tng hp ARN din theo nguyờn tc b sung v c kộo di theo chiu 5'3', ngc vi chiu ca mch khuụn nh sau: Mch khuụn: 3'-A-T-G-C-5' Mch ARN: 5'-U-A-C-G-3' (iv) Nguyờn liu l loi ribonucleoside triphosphate: ATP, UTP, GTP, CTP (v) Sn phm ca phiờn mó l cỏc ARN mch n (vi) S u v kt thỳc phiờn mó ph thuc vo cỏc tớn hiu iu ho l cỏc trỡnh t ADN c thự nm trc v sau gen c phiờn mó 73 (vii) Quỏ trỡnh phiờn mó cú th chia lm ba bc: M u l s tng tỏc gia ARN polymerase vi vựng promoter nhm xỏc nh mch khuụn ca gen v tng hp vi nucleotide; Kộo di l giai an sinh trng tip tc ca chui ARN dc theo mch khuụn cho n cui gen; v Kt thỳc phiờn mó c trng bng s gii phúng mch ARN v ARN polymerase khuụn ADN Hỡnh 5.2 S tng hp ARN trờn mch khuụn ca gen (ADN) di tỏc dng ca ARN polymerase 1.2 Phiờn mó prokaryote 1.2.1 ARN polymerase prokaryote cỏc prokaryote, i din l E coli, ARN polymerase hon chnh (holoenzyme) l mt protein cú nhiu tiu n v, gm hai phn chớnh l yu t sigma () v lừi enzyme Yu t sigma (sigma factor) giỳp cho ARN polymerase nhn bit v bỏm cht vo promoter cú th bt u phiờn mó ti v trớ chớnh xỏc, v lừi enzyme (polymerase core) úng vai trũ chớnh tng hp mch ARN Tt c cỏc lp ARN E coli u c phiờn mó bi ch mt ARN polymerase Sau õy l mt s c tớnh hot ng ca ARN polymerase ca E coli (Bng 5.1; Hỡnh 5.3): Bng 5.1 Cỏc thnh phn cu trỳc ca ARN polymerase prokaryote Tiu n v S lng Vai trũ dựng kt hp holoenzyme ARN polymerase hỡnh thnh liờn kt phosphodiester ' bỏm khuụn ADN nhn bit promoter v u phiờn mó 2' Holoenzyme = 2' + Lừi enzyme + Yu t sigma (i) Khi bỏm vo promoter, ARN polymerase gõy thỏo xon ớt nht 10 bp, nhng cú l l khong 17 bp vựng lõn cn im bt du phiờn mó (ii) Bỳp phiờn mó lan ta cựng vi ARN polymerase lm l mch khuụn vỡ vy nú cú th c phiờn mó Thc t, ARN polymerase ca E coli m rng ớt nht t v trớ -44 n +3 phc hp m ca promoter 74 Hỡnh 5.3 Mụ hỡnh chc nng ca vựng u cui C (C-terminal domain = CTD) ca tiu n v ARN polymerase (a) Trong lừi promoter, CTD khụng c s dng, nhng (b) mt promoter cú yu t UP, thỡ CTD tip xỳc vi yu t UP Lu ý hai tiu n v c mụ t: mt cỏi nm khut sau cỏi (iii) Tiu n v ca ARN polymerase cú mt vựng chc nng u C (C-terminal domain = CTD) un gp mt cỏch c lp cho cú th nhn bit v bỏm vo yu t iu hũa ngc dũng ca promoter gi l UP iu ny cho phộp s tng tỏc cht gia polymerase v promoter (iv) Tiu n v dựng kt hp holoenzyme ARN polymerase V iu ny gõy s kt hp cỏc gc chc nng vựng u mỳt N ca (-NTD; N-terminal domain) Cỏc im tip xỳc gia -NTD v cỏc tiu n v v ' nm trờn cỏc phớa i din ca dimer -NTD so vi cỏc vựng u cui C ca dimer (v) Tiu n v lừi bỏm vo cỏc nucleotide ti v trớ hot ng ca ARN polymerase ni m cỏc liờn kt phosphodiester c hỡnh thnh Yu t cng gn k v trớ bỏm nucleotide, ớt nht pha u 1.3 Cỏc promoter prokaryote Cỏc vựng ng (promoter) núi chung nm k trc gen v cú cha cỏc on trỡnh t c thự cho phộp ARN polymerase nhn bit v bỏm cht vo u phiờn mó ti v trớ chớnh xỏc trờn mch khuụn ca gen Cỏc promoter ca cỏc operon vi khun núi chung cú cu trỳc khỏ tng ng on trỡnh t quan trng nht ca promoter c gi l hp TATA (TATA box) hay hp Pribnow (Pribnow box) ú l trỡnh t TATAAT nm v trớ -10'' (Hỡnh 5.4) Ngoi ra, cỏc promoter vi khun cũn cú trỡnh t TTGACA gn v trớ ''-30'', gi l on nhn bit (recognition sequence) i vi cỏc gen mó húa protein eukaryote, nm phớa trc im bt u phiờn mó chng 75 nucleotide cú trỡnh t GGCCAAATCT, thng c gi l hp CCAAT (CCAAT box) - c l hp cat; nú úng vai trũ iu hũa tc phiờn mó (Hỡnh 5.4) * Lu ý: Tt c cỏc trỡnh t tớn hiu u c quy c trờn mch i khuụn ca gen, vỡ chỳng cú trỡnh t ging vi ARN c tng hp (ch khỏc l baz T gen c thay bi U ARN) Cỏc ký hiu du '' v '+' ch cỏc v trớ trc v sau v trớ bt u phiờn mó, cũn gi l cỏc yu t ngc dũng (upstream) v xuụi dũng (downstream) Hỡnh 5.4 Mụ hỡnh cu trỳc vựng ng (promoter) ca E coli 75 1.4 Cỏc giai on ca quỏ trỡnh phiờn mó E coli - Giai on bỏm v u: Trc tiờn, enzyme ARN polymerase hon chnh (holoenzyme) nhn bit v bỏm cht vo promoter s thỏo xon mt vựng cú kớch thc khong 12-17 cp baz Tng hp ARN thng c u bng nucleotide u tiờn l ATP hoc GTP Sau holoenzyme ARN polymerase tng hp c mt vi nucleotide, nhõn t sigma tỏch i vo mt chu k phiờn mó khỏc, gi l chu k sigma (sigma cycle) (Hỡnh 5.5) - Giai on kộo di: Enzyme lừi tin hnh kộo di chui ARN theo chiu 5'3' dc theo mch khuụn cú chiu ngc li ARN polymerase lừi tin n õu thỡ ADN c m xon v phiờn mó n y; v vựng ADN ó c phiờn mó úng xon tr li Hỡnh 5.5 ARN polymerase bỏm promoter (trỏi) v cỏc giai on u phiờn mó E coli - Giai on kt thỳc: Khi quỏ trỡnh phiờn mó tng hp xong hai on kt thỳc giu GC v AT nm ng sau gen thỡ ti vựng uụi mch ARN hỡnh thnh cu trỳc ''kp túc'' lm dng s phiờn mó ca lừi ARN polymerase Vic kt thỳc mt s bn ARNcn ti yu t rho () cú bn cht protein, khin cho mch ARN va c tng hp v enzyme lừi c gii phúng ADN khuụn (Hỡnh 5.6 v 5.7) Hỡnh 5.6 Mụ hỡnh cu trỳc vựng kt thỳc phiờn mó (terminator) ca prokaryote 76 Hỡnh 5.7 Phiờn mó E coli, vi s hỡnh thnh cu trỳc kp túc v tham gia ca yu t Rho giai on kt thỳc phiờn mó Lu ý, vi khun s dch mó mARN c bt u phiờn mó ang cũn tip din 1.5 Phiờn mó v sa i ARN sau phiờn mó eukaryote 1.5.1 Cỏc ARN polymerase eukaryote cỏc eukaryote, cú ba loi ARN polymerase I, II v III vi s phõn b v chc nng chuyờn húa khỏc i vi b gen nhõn, nh sau: ARN polymerase I hch nhõn (nucleolus) phiờn mó phc hp gen rARN cho sn phm gm cỏc rARN 18S, 28S v 5,8S; ARN polymerase II cú dch nhõn (nucleoplasm) phiờn mó cỏc gen mó húa protein cho sn phm l cỏc hARN tin cht ca cỏc mARN v c gen cho cỏc kiu snARN; ARN polymerase III cú dch nhõn phiờn mó cỏc gen tARN, rARN 5S, v c snARN U6 Ngoi ra, ARN polymerase ty th chu trỏch nhim tng hp tt c cỏc ARN ca ty th (Bng 5.2) Bng 5.2 Cỏc ARN polymerase eukaryote nh khu Polymerase Sn phm ARN polymerase I hch nhõn cỏc rARN 18S, 28S v 5,8S ARN polymerase II dch nhõn cỏc mARN, snARN (v snARN U1, U2, U3, U4, U5) ARN polymerase III dch nhõn cỏc tARN, ARN 5S, ( v snARN U6, ARN 7S hay 7SL) ARN polymerase ty th ty th tt c cỏc ARN ca ty th 1.5.2 Cỏc promoter eukaryote Cỏc vựng ng (promoter) núi chung nm k trc gen v cú cha cỏc on trỡnh t c thự cho phộp ARN polymerase nhn bit v bỏm cht vo u phiờn mó ti v trớ chớnh xỏc trờn mch khuụn ca gen Vn ny tng i phc cỏc eukaryote, vỡ vy õy ta ch xột cỏc promoter ca cỏc gen mó húa protein m khụng cp cỏc loi promoter ca cỏc gen mó húa cỏc ARN khỏc Cỏc promoter ca cỏc gen mó húa protein eukaryote v ca operon vi khun núi chung cú cu trỳc khỏ tng ng Nu nh hp TATA vi khun, cú trỡnh t TATAAT nm v trớ -10'' thỡ i vi cỏc gen mó húa protein ca eukaryote, ú l trỡnh t TATAAA nm gn v trớ -30 (Hỡnh 5.8) v nú c trng riờng cho cỏc ARN polymerase II 77 Hỡnh 5.8 Cu trỳc vựng ng (promoter) ca eukaryote Núi chung, cỏc vựng ny c bo tn cao v c thự cho tng loi ARN polymerase nht nh, c gi l cỏc trỡnh t iu hũa (consensus sequences) Cỏc t bin thay th baz ti cỏc hp TATA, ngha l lm cho nú bt ging vi trỡnh t c bo tn (vớ d, TATAAT TGTAAT) ú s lm yu kh nng phiờn mó ca promoter (down mutation) Ngc li, cỏc t bin lm cho cỏc trỡnh t promoter tr nờn ging vi cỏc trỡnh t iu hũa (vớ d, TATCTT TATAAT), s lm mnh kh nng phiờn mó ca promoter (up mutation) 1.5.3 Sa i sau phiờn mó i vi sn phm ca cỏc gen phõn on tr thnh cỏc phõn t mRNA trng thnh cú kh nng tham gia vo quỏ trỡnh dch mó t bo cht, tt c cỏc bn mARN (pre-mRNA) ca cỏc gen mó húa protein t bo eukaryote u phi tri qua quỏ trỡnh sa i ARN sau phiờn mó nhõn (RNA processing) Sau ú cỏc phõn t mARN i t bo cht tham gia vo quỏ trỡnh dch mó Hai s kin sa i chớnh yu i vi bn mARN, ú l: Gn thờm chúp m7Gppp v uụi poly(A); v Ct b cỏc intron v ni cỏc exon hay cũn gi l splicing Cỏc chúp 5' v uụi poly(A) ny cú tỏc dng bo v mARN b phõn ct bi cỏc enzyme t bo cht (Hỡnh 5.9) V chi tit, xem chng Hỡnh 5.9 Cỏc bc tng quỏt ca quỏ trỡnh phiờn mó v sa i sau phiờn mó i vi bn premARN ca cỏc gen phõn on: (1) Lp chúp 5-m7Gppp cựng lỳc phiờn mó; (2) Gn uụi poly(A); v (3) Splicing loi b cỏc intron v nụi cỏc exon 78 Cu trỳc v chc nng ca cỏc ARN Trờn nguyờn tc, cỏc ARN c cu to t cỏc n phõn l cỏc ribonucleotide; cỏc ribonucleotide ny ni kt vi bng cỏc liờn kt 3',5'-phosphodiester to thnh cỏc chui polyribonucleotide - cu trỳc s cp ca cỏc phõn t ARN (Chng 1) ng pentose c trng ca ARN l ribose, cũn thnh phn baz, ngoi bn loi c bn adenine (A), uracil (U), guanine (G) v cytosine (C), cũn phỏt hin khỏ nhiu dng baz him cú mt ch yu cỏc tARN Cú ba loi phõn t ARN c bn tham gia vo quỏ trỡnh sinh tng hp protein ca cỏc t bo, ú l: ARN thụng tin (messenger RNA = mRNA), ARN chuyn (transfer RNA = tRNA), v ARN ribosome (ribosomal RNA = rRNA) Núi chung, cỏc phõn t ARN cú kớch thc hn cỏc phõn t ADN bt k sinh vt c th no Cỏc phõn t ARN cú th l mch n hoc mch kộp, mch thng hoc mch vũng nhng ph bin l dng mch n, thng (nhng khụng thy cú cỏc phõn t ARN mch kộp, vũng no c mụ t) Loi ARN cú hm lng cao nht cỏc t bo l rARN Bng 5.3 cho thy hm lng tng i (%) v kớch thc (trng lng phõn t v s nucleotide) ca cỏc phõn t ARN vi khun E coli Bng 5.3 Cỏc phõn t ARN E coli Loi ARN Chc nng (%) TLPT S nucleotide mARN Mó hoỏ cỏc protein Bin thiờn Bin thiờn tARN Mang axit amin 15 2,5.101 ~ 75 rARN 5S Thnh phn ribosome 80 3,6.101 120 16S Thnh phn ribosome 0,55.10 23S Thnh phn ribosome 1,2.10 1542 2904 Ngoi ba loi ARN chớnh (rARN, tARN v mARN) cú mt cỏc t bo prokaryote v eukaryote, cỏc t bo eukaryote cũn cú cỏc loi ARN khỏc, nh: (i) ARN d nhõn, hnARN (heterogenous nuclear RNA) vi kớch thc sai bit rt ln, chỳng l tin thõn ca cỏc mARN trng thnh sau ny; (ii) cỏc ARN nhõn kớch thc bộ, snARN (small nuclear RNA), vi cỏc loi nh U1 U10 ú sỏu loi u cú vai trũ quan trng x lý pre-mARN ca cỏc gen phõn on; v (iii) ARN t bo cht, scARN (small cytoplasmic RNA) 7SL cn cho tng hp cỏc protein ch tit v bỏm vo mng; v mt vi ARN khỏc na c gii thiu Bng 5.4 Bng 5.4 Cỏc lp ARN chc nng chớnh v ph cỏc t bo Loi ARN Chc nng Cỏc lp chớnh mARN ARN c phiờn mó t cỏc gen mó hoỏ protein, mang thụng tin cho dch mó Mt s bn tng t mARN khụng c dch mó, vớ d XIST, H19 c ch in du b gen b m (parental imprinting) hnARN mARN trc ct-ni ú l cỏc bn cha (heterogenous c sa i ca cỏc gen eukaryote; s d gi nh 79 nuclear) tARN rARN vy bi vỡ tớnh a dng ln v kớch thc ca nú so vi tARN v rARN Phõn t thớch ng thc hin vic dch mó tARN cng lm mi cho tỏi bn ADN s tỏi bn ca cỏc retrovirus Thnh phn cu trỳc chớnh ca cỏc ribosome, cn cho quỏ trỡnh tng hp protein ca t bo Cỏc lp ph iARN (initiator) Cỏc trỡnh t ARN ngn c dựng lm mi cho s tng hp ADN mch chm snARN (small nuclear) hay U-RNA (uridine-rich) Cỏc phõn t ARN trng lng phõn t thp phỏt hin c dch nhõn, l thnh phn ca cỏc enzyme ct b cỏc intron v cỏc phn ng x lý (processing) khỏc; chỳng cha nhiu gc uridine c sa i snoARN (small nucleolar) Cỏc phõn t ARN trng lng phõn t thp phỏt hin c hch nhõn, cú th tham gia vo quỏ trỡnh x lý rARN (ARN processing) scARN (small cytoplasmic) Cỏc phõn t ARN trng lng phõn t thp phỏt hin c t bo cht vi cỏc chc nng khỏc Vớ d ARN 7S thnh phn ca tiu phn nhn bit tớn hiu v pARN (prosomal), mt ARN kt hp vi khong 20 protein v c bc gúi vi mARN mRNP hay th thụng tin cú tỏc dng iu ho s biu hin ca gen ARN ca telomerase Mt ARN nhõn cú cha khuụn cho cỏc on lp telomere v l thnh phn ca enzyme telomerase gARN Mt loi ARN c tng hp cỏc roi ng Trypanosoma; nú cung cp khuụn cho biờn ARN (guide RNA) ARN antisense ARN ngc ngha b sung vi mARN v cú th to thnh mt mch ụi vi nú kỡm hóm vic tng hp protein Nú cú nhiu h thng, nhng rt ph bin vi khun; v cng gi l ARN b sung gõy nhiu mARN Ribozyme Cỏc phõn t ARN m cú th xỳc tỏc cho cỏc phn ng hoỏ hc, cỏc enzyme cha ARN Thụng thng nú cú hot tớnh t xỳc tỏc (cỏc intron t ct), nhng mt ribonuclease P l mt cht xỳc tỏc ớch thc (vớ d x lý tARN) Cỏc ARN khỏc hot ng hi ho vi cỏc protein, vớ d MRP endonuclease tỏi bn 80 ADN ty th (i) Vựng dn u (5'UTR) khụng c dch mó nhng cú cu trỳc cn thit cho s bỏm vo ca tiu n v ribosome (Hỡnh 5.10) (ii) Vựng mó hoỏ (coding region) nm k sau vựng 5'-UTR; nú mang thụng tin cu trỳc ca mt chui polypeptide, nu l mARN ca eukaryote (monocistronic) hoc mang thụng tin ca nhiu polypeptide khỏc v cỏch bi cỏc on m khụng c dch mó, nu l mARN prokaryote (polycistronic) (iii) Vựng kộo sau (3'-UTR) nm uụi mARN, khụng c dch mó 2.1 ARN thụng tin (mARN) Cỏc mARN l loi ARN quan trng nht c dựng lm khuụn trc tip cho quỏ trỡnh tng hp polypeptide t bo cht Nhỡn chung, cỏc mARN cú cu trỳc mch thng, vi kớch thc khỏc v u cú ba phn chớnh nh sau: Hỡnh 5.10 Cu trỳc chung ca mARN Hỡnh 5.11 Cu trỳc ca mARN prokaryote (a) v mARN eukaryote (b) Hỡnh 5.11 cho thy nhng im khỏc cu trỳc ca cỏc mARN prokaryote v eukaryote, cho thy cu trỳc m c trng cú mt u 5' ca tt c cỏc mARN trng thnh eukaryote Trong nhõn cỏc t bo eukaryote cú cỏc ARN nhõn kớch thc ln v sai khỏc rt ln gi l hnARN (heterogenous nuclear RNA) l tin thõn ca cỏc mARN, cỏc ARN nhõn kớch thc snARN (small nuclear RNA) cú mt thnh phn ca cỏc enzyme splicing, v cỏc ARN t bo cht kớch thc scARN (small cytoplasmic RNA) Trong cỏc t bo ng vt cú vỳ, mt vi loi mARN thỡ ht sc phong phỳ, ú hu nh mc phc ca mARN (s lng loi mARN khỏc nhau) c i din bi cỏc mARN him Mt im cn chỳ ý l s biu hin ca mt gen t l vi phong phỳ ca loi ARN tng 81 ng (mt gen biu hin cng mnh s bn ca nú t bo cng ln) 2.2 Cỏc ARN chuyn (tARN) Mi phõn t tARN cú hai chc nng chớnh l mang axit amin ó c hot hoỏ v i n phc h ribosome-mARN tin hnh vic c dch mó cho mt codon c th ca mARN Trong thnh phn nucleotide ca cỏc tARN cú khỏ nhiu baz chun b bin i thnh cỏc baz sa i nh hot ng xỳc tỏc ca cỏc enzyme sau phiờn mó Cỏc baz ny (cũn gi l cỏc baz him) trung ch yu cỏc vũng thõn (stem loops) nh: 5',6'-dihydrouridine (DHU), inosine (I), ribothymidine (T), pseudouridine () v.v (Hỡnh 5.12) Hỡnh 5.12 Cỏc baz him cú mt ARN, ch yu l cỏc tARN Mi t bo cú chng 45-50 phõn t tARN khỏc Hu ht cỏc tARN cú khong 75-80 nucleotide vi cu trỳc bc hai m rng cỏc tng tỏc cp baz (A-U v G-C) mt s on ca chỳng (Hỡnh 5.13) cng nh cu trỳc bc ba õy l kiu cu trỳc lỏ ba thựy gn nh, vng chc phự hp vi cỏc chc nng khỏc ca cỏc tARN Núi chung, cỏc phõn t tARN thng rt ging nhiu on v khỏc ch yu b ba i mó (anticodon) Lu ý rng, baz him Inosine (I) cú mt v trớ 5' ca anticodon mt s phõn t tARN cú th kt cp linh hot vi C, U hoc A v trớ 3' ca cỏc codon mARN Mi tARN thng cú 3-4 vũng trờn thõn (tớnh t u 5') vi chc nng khỏc nh sau (Hỡnh 5.13): (i) vũng I - DHU nhn bit aminoacyl-tARN synthetase; (ii) vũng II - anticodon c mó trờn mARN bng s kt cp anticodon-codon (theo nguyờn tc b nhng cú s linh hot; chng 3); (iii) vũng III - ph (extra loop) cú th khụng cú mt s tARN; (iv) vũng IV - TC nhn bit ribosome i vo ỳng v trớ tip nhn aminoacyl-tARN (v trớ A) V cui cựng, on mch thng -CCA u 3' l v trớ gn vo ca axit amin ó c hot hoỏ to thnh cỏc aminoacyl-tARN 82 Hỡnh 8.5 Tớnh i xng quay bc hai (palindrome) ca on ADN mch kộp Hỡnh 8.6 S minh hai kiu ct khỏc ca cỏc enzyme gii hn v cỏc enzyme gii hn tng ng Vớ d õy l SmaI v XmaI 2.2 Cỏc vector thụng dng k thut di truyn ADN tỏi t hp (recombinant ADN) l phõn t ADN c to ng nghim bng cỏch kt hp cỏc ADN t cỏc ngun khỏc nhau, theo mt quy trỡnh k thut nht nh (gi l k thut tỏi t hp ADN) Thụng thng mt phõn t ADN tỏi t hp bao gm mt phõn t ADN cú bn cht l plasmid hoc phage nguyờn gi l vector (Hỡnh 8.7) v mt on ADN t ngun khỏc mang mt gen hoc yu t iu hũa mong mun c cho xen vo gi l ADN ngoi lai (foreign ADN) Hỡnh 8.7A Cu trỳc ca cỏc plasmid pBR322 v pUC19 Lu ý cỏc vựng cha im tỏi bn (Ori), cỏc gen khỏng thuc (ampicillin, tetracyclin) v cỏc marker chn lc; c bit i vi vector pUC19 cho thy v trớ a to dũng (cha nhiu v trớ ct ca cỏc enzyme gii hn xem thờm Hỡnh 8.7B) Vi vector pUC19, lacZ = gen -galactosidase; lacI = gen c ch ca operon Lac 136 Hỡnh 8.7B Bn ca mt on trỡnh t cha nhiu v trớ to dũng ca cỏc enzyme gii hn khỏc ca vector pUC19 Trong s cỏc vector, cỏc plasmid ca vi khun c s dng rng rói hn c, nh cú cỏc c im sau: (i) Mi plasmid l mt phõn t ADN si kộp thng dng vũng v ch cú mt im tỏi bn riờng; (ii) Cú kh nng xõm nhp vo t bo vt ch v hot ng bỡnh thng; (iii) Cú kớch thc bộ, thng ch vi ngn cp baz nờn d dng tinh chit; (iv) S bn mi t bo vi khun thng khỏ cao; (v) Mt s plasmid cú cha cỏc gen khỏng thuc tin li cho vic theo dừi v phỏt hin s cú mt ca plasmid tỏi t hp vi khun ch Hỡnh 8.8 Cỏc u dớnh ca ADN lambda (a) v vector lambda cú xen mt vựng ADN dch gt10 thụng qua vt ct ca EcoRI Hỡnh 8.9 Cu trỳc v s dng ca nhim sc th nhõn to ca nm men (YAC) Chỳ thớch: trp1, ura3 = cỏc marker chn lc; cen/ars = centromere v trỡnh t tỏi bn t tr (autonomously replicating sequence = ARS), cho phộp tỏi bn S cerevisiae; tel = telomere; n gin, im tỏi bn ca E coli v cỏc marker chn lc i vi E coli khụng nờu õy 137 Trong s cỏc phage dựng lm vector thỡ phage lambda (; Hỡnh 8.8) cú nhiu u th nht, bi l phn gia ca b gen cú cha mt s gen khụng quan trng v khụng liờn quan vi s tỏi bn ca nú, nờn thun li cho vic xen on ADN mong mun vo õy Cỏc phage khụng cha cỏc gen khỏng thuc cho nờn vic theo dừi phage tỏi t hp c xỏc nh da vo cỏc vt tan dng tớnh (positive plaques) trờn nn vi khun Sau ny, k thut cụng ngh ADN tỏi t hp phỏt trin nhm phc v cho gii trỡnh t b gen cỏc sinh vt v c bit l b gen ngi, cỏc plasmid kớch thc ln nm men c phỏt hin v s dng rng rói Ngi ta ó to cỏc nhim sc th nhõn to ca nm men (yeast artificial chromosome = YAC; Hỡnh 8.9) v cỏc nhim sc th nhõn to ca vi khun (bacterial artificial chromosome = BAC) gi l cỏc siờu vector (supervectors) 2.3 C s ca vic xõy dng phõn t ADN tỏi t hp in vitro 2.3.1 Phng phỏp s dng cỏc u dớnh Bt k on ADN no nu c ct bi cựng mt loi enzyme gii hn (vớ d, EcoRI) cho cỏc u dớnh thỡ cú th dớnh lớp li vi v c ni bi ADN ligase Phng phỏp thnh lp phõn t ADN tỏi t hp kiu ny ln u tiờn c a bi J Mert v R Davis nm 1972 bng thc nghim trờn cỏc virus V sau ú, ln u tiờn nm 1973, H.Boyer v nhúm nghiờn cu ca S.Cohen ó to c phõn t ADN tỏi t hp gm vector l plasmid nh pSC101 ca E coli v ADN ''ngoi lai'' l mt plasmid khỏc Chớnh s kin ny ó t nn múng v m trin vng to ln cho k thut ADN tỏi t hp sau ny (Hỡnh 8.10) Hỡnh 8.10 Thnh lp phõn t ADN tỏi t hp bng phng phỏp s dng cỏc on cú u dớnh c to bi enzyme gii hn ct lch ( õy l BamHI) 2.3.2 Phng phỏp ni trc tip hoc tng hp cỏc u b sung i vi cỏc on ADN c to bng cỏch x lý enzyme gii hn ct thng nh HindII chng hn, thỡ vic ni cỏc on ADN cú u bng c to cú th thc hin theo hai cỏch sau: 138 Hỡnh 8.11A Khõu ni to u dớnh si n vo on ADN u bng (blunt) vi enzyme transferase u mỳt (terminal transferase) Ni trc tip bng ADN ligase ca phage T4 hoc tng hp thờm cỏc u dớnh vo cỏc u 3' mt s nucleotide b sung bng cỏch s dng cỏc enzyme end transferase, ri sau ú cỏc on ADN nh th s c ni vi bi ADN ligase ca vi khun C s ca phng phỏp kt hp ADN ny c thc hin ln u tiờn gia ADN ca virus SV40 vi ADN ca phage bi L Lobban v D Kaiser (1972), v D Jackson v P Berg (1972) (Hỡnh 8.11) Hỡnh 8.11B To dũng bng cỏch s dng vic khõu ni homopolymer i vi cỏc on u bng c to bi enzyme gii hn SmaI 2.4 To dũng tỏi t hp 2.4.1 Nguyờn tc chung V nguyờn tc, k thut ADN tỏi t hp hay to dũng (cloning) gm cỏc bc chung nht nh sau (Hỡnh 8.12): (1) Tỏch chit v tinh sch ADN thuc cỏc ngun khỏc (gm vector v ADN mang gen mong mun); (2) To phõn t ADN tỏi t hp in vitro; (3) a phõn t ADN tỏi t hp vo t bo nhn, thng l E coli hoc nm men; v (4) Phỏt hin v phõn lp cỏc dũng ADN tỏi t hp c hiu Trong t bo ch, phõn t ADN tỏi t hp cú th biu hin gen mong mun (cho sn phm protein) hoc tỏi bn c lp nhiu ln to hng lot bn ca nú, v t bo ch phõn chia s kộo theo s to dũng phõn t (molecular cloning) Mt khỏc, tc phõn chia rt nhanh ca cỏc vi khun nờn cú th to hng triu bn mong mun mt thi gian ngn Vỡ th nh khoa hc cú th tỏch dũng bt k mt gen no dựng cho nghiờn cu hoc cho sn xut trờn quy mụ cụng nghip mt s lng ln cỏc protein l cỏc ch phm y-sinh hc no ú 2.4.2 Quy trỡnh to dũng gen tỏi t hp (Hỡnh 8.13) 139 Hỡnh 8.12 i cng v quy trỡnh to dũng gen (sn xut protein) vi khun Bõy gi ta xột quy trỡnh k thut to dũng m vic phỏt hin ADN tỏi t hp da trờn kh nng khỏng thuc vector plasmid mang li Bc 1: Tinh chit ADN Gi s ó tinh chit c plasmid cú cha hai gen khỏng ampicillin v tetracyclin, ký hiu l Amp v TetR; v cng gi thit rng gen TetR cú cha im ct ca EcoRI, v phõn t ADN ngi cú mang gen insulin R Hỡnh 8.13 S thớ nghim to dũng vi khun mang ADN tỏi t hp, õy l gen insulin ngi 140 Bc 2: Kin to phõn t ADN tỏi t hp in vitro Trc tiờn, dựng enzyme gii hn u dớnh EcoRI (xem Bng 8.1) ct vũng plasmid ti gia gen TetR v cho ct ADN ngi, s cỏc on b ct cú mt on mang gen insulin Sau ú em trn ln hai loi ADN trờn ng nghim vi ADN ligase Kt qu l cú th xy ba trng hp: (1) Plasmid t ni li thnh mch vũng nh lỳc u; (2) on ADN t ni li thnh mch vũng; v (3) Plasmid tỏi t hp cú mang gen insulin, v cú th mang mt on ADN khụng phi gen ú Bc 3: Bin np v phỏt hin dũng ADN tỏi t hp chung a cỏc ADN c x lý vo cỏc t bo E coli Nu phõn t cú kớch thc ln ngi ta phi x lý vi khun 'th nhn' bng chlorid calcium (CaCl2) lm cho mng tr nờn thm c d dng Sau ú em cy riờng r cỏc vi khun trờn mụi trng cú ampicillin v theo dừi + Nu cú xut hin khun lc, chng t vi khun cú mang gen AmpR, tc l chỳng cú mang plasmid ban u (trng hp 1) hoc plasmid tỏi t hp (trng hp 3) Ngc li, nu ch cy khụng xut hin khun lc, chng t vi khun mang ADN t ni (trng hp 2) + K ú, em cy riờng r cỏc vi khun thu c sang mụi trng cú tetracyclin Nu cú xut hin khun lc, chng t vi khun cú mang gen TetR nguyờn (trng hp 1) Nu khụng cú khun lc, chng t vi khun em cy cú mang ADN tỏi t hp (trng hp 3); vỡ gen TetR b bt hot on ADN xen vo Bng cỏch theo dừi nh vy cho phộp xỏc nh c dũng vi khun mang ADN tỏi t hp, nhng cha bit c õu l cỏc dũng c hiu, ngha l cú mang gen insulin Bc 4: Chn dũng ADN tỏi t hp c hiu V nguyờn tc, c triu phộp th mi cú mt t bo mang gen mong mun Vi trng hp trờn, ngi ta cú th s dng phng phỏp dch hc bng cỏch dựng khỏng th chng li protein c sinh bi dũng vi khun tng ng (tc huyt tỡm gen khỏng insulin) Hỡnh 8.14 minh mt cụng on ca quy trỡnh thớ nghim ADN tỏi t hp vi khun E coli s dng mụi trng nuụi cy cú b sung ampicillin i vi ba kiu t bo: t bo cú mang plasmid tỏi t hp, t bo ch mang plasmid pUC19 khụng tỏi t hp, v t bo khụng bin np c (Hỡnh 8.14a) Qua ờm sinh trng, cỏc t bo no cú mang plasmid tỏi t hp v plasmid khụng tỏi t hp s mc thnh cỏc khun lc (mu sc tng ng õy l trng v xanh; Hỡnh 8.14b) Sau chn cỏc dũng cú xen plasmid tỏi t hp, a lờn mng lc v cho tin hnh lai húa gia ARN v ADN (gen) ca nú bng cỏc vt dũ phúng x nh ó núi trờn Sau ú a sn phm lai phõn t ny lờn tm phim X quang nh v gen quan tõm t dũng tỏi t hp (Hỡnh 8.14c) Núi chung, tỡm dũng lai c hiu ngi ta s dng cỏc mu dũ l mARN hoc rARN c hiu Chng hn, trng hp nu cn chn dũng lai mang on mARN c th, ngi ta em cy u cỏc dũng vi khun cú cha ADN tỏi t hp lờn trờn mt thch ca hp petri cha mụi trng nuụi cy Sau ú úng du lờn mng lc nitrocellulose, v thu c bn Vic x lý bn bng NaOH s lm cho cỏc t bo vi khun tan v ti ch (in situ), v cỏc ADN thoỏt t chỳng s b bin tớnh (cỏc si n tỏch ri nhau) v dớnh vo mng lc Sau ú em nhỳng mng lc ny vo mu mARN tng ng ó c tinh khit v ỏnh du phúng x (P32); mu ARN ny c gi l vt dũ phúng x (radioactive probe) Nu dũng no cú cha ADN mó hoỏ cho mARN thỡ s 141 xy hin tng lai gia mARN v vựng si n tng ng trờn ADN ú Sau loi b cỏc mARN khụng lai c, ngi ta t mt ming phim nh lờn trờn mng lc; nhng vt nh xut hin trờn nh phúng x t ghi cho thy v trớ ca dũng mang ADN b tr vi mu ARN T õy cú th tỏch riờng cỏc dũng lai c hiu s dng cho cỏc nghiờn cu tip theo Sinh trng qua ờm T bo + pUC19 Cỏc khun lc trng: T bo + pUC19 T bo khụng pUC19 + on xen c bin np + on xen Cỏc khun lc xanh: ch cú pUC19 Mụi trng + ampicillin + X-gal Cỏc dũng khỏng ampicillin Mng Mu dũ phúng x Mng Cỏc dũng chn lc Phim tia X Hỡnh 8.14 Xỏc nh cỏc dũng vi khun mang plasmid cú xen mt on ADN (gen) c hiu bng vt dũ phúng x l mARN - sn phm ca nú 2.5 Tng hp v to dũng cADN i vi trng hp cn cho biu hin mt gen l (sn xut mt protein) mong mun vi khun, ngi ta cú th tng hp gen ca nú da trờn khuụn mu mARN v enzyme phiờn mó ngc tinh ch t retrovirus Sau ú cho xen gen ny vo plasmid, ri em cy vo vi khun v xỏc nh cỏc dũng cADN c hiu õy ta ch xột hai bc u: Bc 1: Tng hp cADN (Hỡnh 8.15A) Hỡnh 8.15A Tng hp cADN t mt ARN nh enzyme phiờn mó ngc Nh ó bit, cỏc mARN eukaryote u cú cỏi uụi poly(A) u 3' Chớnh trỡnh t ny to iu kin thun li cho vic tng hp si ADN b sung, cADN Khi em trn ln cỏc on ngn 142 gm cỏc nucleotide thymine (oligodT) vi mARN ny s xy s lai hoỏ gia nú vi vựng uụi mARN on oligo(dT) lm mi cho enzyme phiờn mó ngc (reverse transcriptase) tng hp si cADN m sn phm l si kộp lai ARN- cADN u 3' ca si cADN c tng hp cú cỏi chúp (tng t u 5' ca mARN) Tip theo, bng cỏch x lý vi NaOH, si mARN b loi ra; k ú cỏi chúp u 3' ca cADN li lm mi cho ADN polymerase I tng hp si th hai dc theo si khuụn cú ca nú Sn phm cADN bõy gi cũn mang cỏi vũng si n Sau ú, cỏi vũng ny c ct b bng cỏch x lý vi nuclease S1 to cADN si kộp Bc 2: Xen on cADN vo plasmid (Hỡnh 8.15B) xen on cADN vo plasmid ngi ta cú th dựng enzyme end transferase gn thờm uụi homopolymer (vớ d, CCCC ) vo cỏc u 3' ca cADN V plasmid sau c m vũng, cng phi lp thờm u 3' nhng trỡnh t tng ng l GGGG cng vi enzyme trờn Tuy nhiờn, cỏch ph bin hn c l gn thờm vo c hai u bng ca si kộp cADN ny bng cỏc oligonucleotide gm 8-10 cp baz, nh xỳc tỏc ca ADN ligase T4 Sau ú, dựng enzyme gii hn thớch hp ct on ni ny to cỏc u dớnh ng thi ct plasmid bi cựng mt enzyme ú ti gen TetR Hai ADN núi trờn c ni vi bng ADN ligase to plasmid lai Hỡnh 8.15B To dũng cADN ng dng ca cụng ngh ADN tỏi t hp v k thut di truyn 3.1 ng dng nghiờn cu cỏc b gen Vic tỏch dũng tỏi t hp cho phộp nhn c mt s lng ln bt k gen hoc vựng iu ho no tin hnh phõn tớch trỡnh t nucleotide, xỏc nh cỏc vựng chc nng v ch cỏc c ch hot ng ca chỳng Nh ú ó a li nhng hiu bit mi v t chc v hot ng ca cỏc b gen prokaryote (nh cỏc im tỏi bn, cỏc vựng iu ho phiờn mó, cỏc gen nhy v.v.) v cỏc b gen eukaryote (nh cỏc centromere, telomere, cỏc gen phõn on, cỏc gen gi, ADN lp li v.v.) nh ó c tho lun cỏc chng trc 143 Bng cỏc thớ nghim to dũng plasmid tỏi t hp kinh in vi khun E coli, v bng cỏch ci tin s dng nhim sc th nm men nhõn to ny (YAC), ngi ta ó thnh lp cỏc th vin gen (gene library) hay th vin b gen (genomic library) trờn c s ú tin hnh lp bn vt lý v xỏc nh trỡnh t ADN b gen ca nhiu sinh vt khỏc nhau, k c b gen ngi Nu nh vo nm 1977, F.Sanger xỏc nh y cỏc trỡnh t phage X174 (5386 nucleotide, gen) v phage G4 (5577 nucleotide, 10 gen), thỡ n ngi ta xỏc nh v lp bn cho cỏc ADN cú kớch thc ln hn nhiu; vớ d: b gen phage lambda gm 48.502 cp baz vi khong 61 gen (1983) v.v ỏng k l, D ỏn B gen Ngi (HGP) ó chớnh thc i vo hot ng t 1990 J.Watson ch trỡ cựng vi s cng tỏc ca nhiu nh khoa hc trờn th gii Vic phõn tớch trỡnh t b gen ngi hon thnh vo 4/2003, cho thy b gen ca chỳng ta cú trỡnh t y gm 3.164.700.000 cp baz, cha ng khong 25.000 gen mó húa protein chu trỏch nhim xõy dng nờn mt b protein (proteome) gm khong 35.000 protein khỏc cỏc t bo 3.2 ng dng y-dc hc 3.2.1 Sn xut cỏc ch phm y-sinh hc Nu nh vo nm 1972, Giỏo s Roger Guillemin (Phỏp) ó phi dựng ti 500.000 nóo cu mi tinh chit c vi miligram somatostatin, mt hormone sinh trng ca vựng di i th (vi cụng trỡnh ny ụng ó c trao gii Nobel nm 1980), thỡ vo 10/1977 Hebert Boyer (M) ó ch to thnh cụng hormone ny t E coli bng phng phỏp ADN tỏi t hp n 8/1978 chớnh Boyer li l ngi u tiờn cho sn xut thnh cụng insulin ngi t E coli Cỏc thnh tu u tiờn ny ó m mt k nguyờn mi phỏt trin rc r nht lch s cụng ngh sinh hc, cụng ngh ADN tỏi t hp Sau ú l hng lot cỏc ch phm khỏc nh cỏc hormone tng trng ca ngi (HGH), bũ (BGH), ln (PGH), cỏc vaccine v cỏc interferon phũng chng cỏc cn bnh nan ngi y nh ung th, viờm gan v.v v mt s bnh quan trng gia sỳc nh hin tng 'l mm-long múng' virus gõy tt c u c sn xut t E coli c bit l, s i ca cỏc hóng, cỏc cụng ty ln ó u t mnh m cho s phỏt trin ca k ngh ny Nh vy gúp phn gii quyt cú hiu qu nhiu thc tin t y hc, chn nuụi-thỳ y, v nụng nghip núi chung Mt s sn phm c to dũng vi khun liờn quan n cỏc ng dng khỏc iu tr bnh ngi c gii thiu Bng 8.2 144 Bng 8.2 Cỏc sn phm ca ngi c to dũng t vi khun Sn phm p dng Cỏc interferon Dựng iu tr cỏc bnh lõy nhim virus v ung th Interleukin Kớch thớch h thng dch v cú th dựng iu tr ung th v cỏc ri lon h thng dch Insulin Somatotropin Cht kớch hot plasminogen c dựng iu tr bnh tiu ng c dựng iu tr d tt lựn thuc v tuyn yờn Lm tan cỏc cc ụng mỏu cho iu tr v ngn chn cỏc tỡnh trng tc nghn tim mch Nhõn t hoi t Tn cụng v git cỏc u ung th Nhõn t XI, VIII c dựng iu tr bnh mỏu khú ụng Erythropoietin Kớch thớch to cỏc t bo hng cu cho iu tr bnh thiu mỏu (anemia) Beta endorphin Cỏc cht gim au t nhiờn c th to ra; cú th c dựng lm thuc gim au Cỏc enzyme c dựng rng rói t vic iu khin cỏc phn ng hoỏ hc cỏc quỏ trỡnh k ngh cho n vic b sung cỏc enzyme khu phn n ca ngi Kớch thớch kh nng dch ca c th i vi mt Cỏc vaccine tiu hoc hai khỏng nguyờn then cht ca mt tỏc nhõn gõy bnh; gim nguy c ri ro ca cỏc vaccine thụng n v thng Bờn cnh vic sn xut cỏc hormone, vaccine núi trờn, ngi ta cũn sn xut c cỏc khỏng th n dũng (monocloning antibodies) dựng : (i) xỏc nh vi khun gõy bnh (nh thng hn chng hn); (ii) xỏc nh mc hormone t ú ỏnh giỏ chc nng tuyn ni tit hoc s thay i quỏ trỡnh tng hp hormone u gõy ra; (iii) phỏt hin mt s protein cú ý ngha chn oỏn u hoc mt s tỡnh trng trc sinh; (iv) phỏt hin cỏc thuc b cm cú mỏu, hoc kim tra nng thuc mỏu v t chc nhm m bo liu thuc s dng cho khụng vt quỏ ngng gõy c v.v Nh cú tớnh c hiu v chớnh xỏc cao v s dng d dng, vic sn xut cỏc khỏng th n dũng ó to nờn mt nhỏnh phỏt trin mau l nht ca cụng ngh sinh hc, v cựng vi vic sn xut cỏc vaccine chỳng ó tr thnh nhng phng tin quan trng nht chớnh sỏch y t cng ng ca cỏc nc ang phỏt trin v xột v lõu di, vic ng dng cỏc khỏng th n dũng cú trin vng cha c nhiu bnh ú cú cỏc u ỏc tớnh 3.2.2 ng dng chn oỏn v iu tr gen Trong chn oỏn bnh mc phõn t, thnh tu ni bt nht l vo nm 1981, ln u tiờn bnh thiu mỏu hng cu hỡnh lim c chn oỏn trc sinh mc gen nh phõn tớch ADN bng enzyme gii hn T õy ó m hai hng chớnh chn oỏn gen l: chn oỏn cỏc bt 145 thng bm sinh v chn oỏn cỏc bt thng ADN soma Mt s thnh tu khỏc t c theo hng u gm cú: bnh hemophilia A, ri lon dng c Duchenne, hi chng X-fragile, bnh retinoblastoma - mt dng ung th vừng mc Theo hng sau, ngi ta ó ỏp dng i vi mt s dng ung th mỏu nh cỏc lympho Burkitt, lympho nang, bnh bch cu ỏng k l gn õy, ngi ta ó xỏc nh c nhiu gen gõy bnh quan trng ngi, nh: gen gõy bnh húa x nang (cystic fibrosis) nm 1990, gen gõy bnh Huntington nm 1993 Liu phỏp gen (gene therapy) cng l mt phng thc sn xut v iu tr mi bng cỏc phõn t tr liu õy l hng cú nhiu trin vng nht nhng khú thc hin nht vỡ nú cú liờn quan n c phng phỏp lun ln khớa cnh o lý S kin ni bt nht l vo nm 1990-91, W.F.Anderson, R.M.Blaese v Ken Cuver thc hin thnh cụng ca liu phỏp gen u tiờn trờn mt gỏi bn tui mc bnh suy gim dch phi hp (SCID) vi s thiu ht adenosine deaminase (ADA), mt enzyme cn thit cho sn xut cỏc khỏng th cỏc t bo h mim dch, gi l hi chng bubble-boy (bnh gen gn u mỳt vai ngn nhim sc th s 20 gõy ra) Mt khỏc, liu phỏp gen cng ó m nhng trin vng to ln cha tr cỏc cn bnh ph bin nht, tỏc ng ti hng triu triu ngi trờn hnh tinh nh: ung th, SIDA/AIDS, viờm gan virus, cỏc bnh tim mch, cỏc bnh thoỏi húa thn kinh (bnh Parkinson, bnh Huntington, bnh Alzheimer ) hay c nhng bnh mn tớnh nh a thp khp 3.3 ng dng nụng nghip K thut di truyn vi cỏc sinh vt bin i gen (GMO) i vi ngnh chn nuụi, cụng ngh sinh hc núi chung v cụng ngh sinh hc núi riờng ó t nhiu thnh tu ỏng k, chng hn cỏc k thut chuyn ghộp gen ỏp dng cho hp t v phụi cỏc gia sỳc nhm tng cng kh nng chng bnh v ci thin ging núi chung; cng nh cỏc k thut mi xỏc nh gii tớnh ca phụi Hỡnh 8.16 Mụ hỡnh tng quỏt v thớ nghim truyn gen ng vt Hỡnh 8.16 cho thy kh nng ng dng k thut cy ghộp gen trờn trng chut ó c th tinh Sau ú em phụi ó ghộp gen cy vo t cung ca chut lm m khỏc Kt qu l to c chut cú b lụng dng khm nh mong mun in hỡnh cho cỏc thớ nghim truyn 146 gene ng vt l vo nm 1982,R.D.Palmiter, R.L.Brinster v cỏc ng s i hc Seatle (Philadelphia, USA) bng cỏch truyn gen xỏc nh hormone sinh trng ca chut cng vo trng ó th tnh ca chut bỡnh thng, ri cy tr li cỏc t bo ó c bin i gen vo vũi trng ca cỏc chut cỏi cú th mang thai cho n cựng V kt qu l, cỏc tỏc gi ny ó thu c dng chut nht cú kớch thc ln gp 2-3 ln chut bỡnh thng, gi l chut khng l i vi trng trt, vic s dng cỏc phng phỏp chuyn ghộp gen ó t c nhiu thnh tu to ln Chng hn, hóng Biogen (USA) nm 1984 ó chuyn thnh cụng plasmid Ti vo t bo thc vt; hóng Calgen v Phytogen (USA, 1984) ó ghộp thnh cụng gen khỏng glyphosate bo v cõy bụng; nm 1985 hóng Molecular Genetics (USA) ó to c ging ngụ mi cho nhiu tryptophan Nm 1993, bng k thut sỳng bn gen vo t bo thc vt ngi ta ó a c gen sn xut protein dit sõu vo cõy ngụ, v kt qu l ó to c ging ngụ chng chu cao i vi sõu c thõn iu thỳ v l vic tỏch cỏc gen c nh m, gen Nif (Nif = nitrogen fixation) t cỏc vi khun nt sn cõy h u v a vo b gen ca cỏc cõy trng khỏc to cỏc ging cõy trng mi cú kh nng c nh nit v cho nng sut cao (Hỡnh 8.17) Hỡnh 8.17 Mụ hỡnh chuyn gen cõy trng Trong chn ging vi sinh vt, ngi ta ó thc hin thnh cụng vic chuyn gen cellulase vo vi khun (J.P.Aubert, 1/1983), ci bin E coli sn xut L-aspartat (hóng Tanabe, Nht 1985), ghộp gen vo x khun S violacconiger ci tin vic sn sinh enzyme glucoisomerase (hóng Roquette v Cayla, 1985), ngoi cũn to c cỏc ging vi sinh vt bin i gen cú kh nng n cn du dựng x lý cỏc ph thi cú c t nhm bo v mụi sinh Bờn cnh vic to ging nm men mi cú th git cht cỏc vi khun xut hin bia (hóng Suntory, 1985), cũn to c chng nm men sn xut insulin v interferon (Kimura, 1986) v.v 3.4 ng dng khoa hc hỡnh s v cỏc xó hi khỏc K thut di truyn cũn c ng dng rt hiu qu cỏc ngnh hỡnh phỏp hc, chng hn bng cỏch s dng k thut 'du võn ADN' (ADN fingerprinting) thay cho 'du võn tay' trc õy cho phộp cỏc ngnh cnh sỏt hỡnh s xỏc nh chớnh xỏc cỏc ti phm hoc nhn dng xỏc nn nhõn chin tranh hoc tai nn gõy (Hỡnh 8.18) 147 Hỡnh 8.18 Du võn DNA (DNA finger-printing) cú th giỳp cỏc nh nghiờn cu xỏc nh kh nghi trng hp ti phm TểM TT (1) Vic tinh ch v s dng enzyme ct gii hn cựng vi cỏc plasmid to cỏc phõn t ADN tỏi t hp u tiờn ng nghim l nn tng cho s i v phỏt trin mnh m ca k thut di truyn v cụng ngh ADN tỏi t hp t gia thp niờn 1970 n (2) S phỏt trin nhanh chúng ca lnh vc cụng ngh ny khụng nhng ó nhanh chúng mang li lng tri thc khng l v cu trỳc v c ch hot ng ca cỏc gen, cỏc b gen m cũn tr thnh lc lng sn xut trc tip ca xó hi, to hng lot cỏc ch phm y-sinh hc hu ớch t cỏc t bo vi khun; to cỏc sinh vt bin i gen (GMOs) - mang nhng c tớnh quý him Qua ú gúp phn gii quyt nhng thc tin t y hc v cụng tỏc chn to ging (3) ỏng k nht l cựng vi s phỏt trin vt bc ca cụng ngh ADN tỏi t hp v k thut di truyn, cỏc nh khoa hc ó thnh cụng vic xỏc nh trỡnh t y ca b gen ngi vo 4-2003 (4) K t sau s kin thnh cụng sm hn mong i ca D ỏn b gen ngi ó m hng lot cỏc hng nghiờn cu mi; ỏng k nht l Genomics v Proteomics 148 CU HI V BI TP Cú phõn t ADN c em gõy bin tớnh Kt qu thu c cho thy phõn t ADN I núng chy 720C v phõn t ADN II núng chy 820C S liu ú ch yu núi lờn iu gỡ? Gi s bn dựng enzyme HaeI v BamHI phõn ct mt plasmid ký hiu l pZ28 T BamHI thu c ch on v t HaeI bn nhn c on Cú bao nhiờu v trớ ct cho mi enzyme y? Gii thớch Gi s mt enzyme ct hn ch cú mt mu trỡnh t ớch i xng bc hai l 5'-GCA, cú th suy trỡnh t y ca on ớch y l gỡ? Gi s ln u tiờn mt enzyme ct gii hn c phỏt hin t vi khun cú tờn tm gi l Bacterium malvacarum, bn s t tờn ca enzyme ú nh th no? Trong t nhiờn, cỏc t bo vi khun cú hai h thng enzyme no giỳp nú va chng li s xõm nhp ca cỏc phage l va bo v c b gen ca chỳng? Th no l enzyme gii hn? Chỳng cú nhng tớnh cht no m c coi l cụng c thit yu i vi cụng ngh ADN tỏi t hp? Bng hai vớ d v enzyme gii hn, hóy chng t rng ớt nht cú hai phng phỏp thnh lp cỏc phõn t ADN tỏi t hp in vitro T cỏc enzyme gii hn BamHI, EcoRI v HindIII Bng 8.1 v BglII cú on ớch c bit l AGATCT, hóy cho bit cp enzyme no s to cỏc u dớnh hay u b sung (sticky ends) tng thớch? Trỡnh t ca u dớnh tng thớch ny l gỡ? Gi s bn ct hai ADN khỏc nhau, mt vi BamHI v mt vi BglII, sau ú ni chỳng li vi thụng qua cỏc u dớnh tng thớch Mt ó khõu ni ri, bn cú th tỏch hai ADN ny ln na bng enzyme gii hn ú hay khụng? Ti sao, hoc ti khụng? Gi s bn bin np mt ADN tỏi t hp cho vi khun v nhm ln, bn t cỏc t bo c bin np ú trờn mụi trng khụng cú cht khỏng sinh no c Kt qu m bn quan sỏt c l gỡ? Ti sao? 10 Gi s rng bn chit xut c mt enzyme ct gii hn t loi vi khun cú tờn khoa hc l Xenobacterium giganticus Theo danh phỏp ó hc, bn s vit tờn enzyme ú nh th no? 11 Cho bit trỡnh t ca mt on ADN cú cha mt v trớ nhn bit i xng xuụi ngc (palindromic recognition site) cho mt enzyme gii hn l GACGATATCAACT Hóy tỡm trỡnh t ca v trớ nhn bit ú 12 Th no l phõn t ADN tỏi t hp, vector tỏch dũng? Hóy nờu cỏc bc ca quy trỡnh to dũng gen tỏi t hp v cho s minh ho 13 Gi s tinh ch c plasmid pBR322 v ADN ngi cú cha mt gen cn nghiờn cu Hóy phõn tớch k thut to dũng gen y E coli 14 Enzyme phiờn mó ngc l gỡ? Nú c tinh ch t loi sinh vt no v c ng dng vo khõu no cụng ngh ADN tỏi t hp? Gii thớch v cho s minh ho 15 Cú th s dng cỏc cht khỏng sinh xỏc nh xem liu plasmid pBR322 ó nhn c mt on xen v trớ EcoRI ca nú hay khụng? Ti sao, hoc ti khụng? 149 Chịu trách nhiệm nội dung: Pgs.Ts Nguyễn văn hòa Biên tập: Tổ công nghệ thông tin Phòng khảo thí - đảm bảo chất lợng giáo dục 150 [...]... 5.5 Thnh phn cu to ca ribosome Prokaryote v Eukaryote Vi khun T bo ng vt cú vỳ RIBOSOME 70S 80S ng kớnh 18 -20 nm 20 -22 nm 50S 60S 23 S (29 04 nt) 28 S (4.718 nt) 5S ( 120 nt) 5,8S (160 nt) Tiu n v ln rARN 5S ( 120 nt) Protein 34 phõn t ~50 phõn t 30S 40S rARN 16S (1.5 42 nt) 18S (1.874 nt) Protein 21 phõn t ~35 phõn t Tiu n v bộ 3.1 Hot hoỏ axit amin Quỏ trỡnh ny din ra trong bo tng to ngun cỏc tARN mang... nguyờn tc b sung ngc chiu gia anticodon v codon 2. 3 ARN ribosome (rARN) v ribosome Cỏc rARN cựng vi cỏc protein c thự l nhng thnh phn cu trỳc nờn cỏc ribosome l nh mỏy tng hp protein ca t bo vi khun cú 3 loi rARN cú cỏc h s lng l 23 S, 16S (Hỡnh 5.14) v 5S, vi s lng nucleotide tng ng l 29 04, 15 42 v 120 (Bng 5.5) t bo eukaryote cú 4 loi rARN vi cỏc h s lng l 28 S, 18S, 5,8S v 5S (Hỡnh 5.15) Riờng cỏc t... enzyme ny (E) xỳc tỏc cho phn ng ATP hot hoỏ axit amin, vi s cú mt ca Mg2+, to ra phc hp [aminoacyl-AMP + E] (Hỡnh 5.17) RCH(NH2)COOH + ATP E*[RCH(NH2)CO~AMP] + PP Tip theo, cng di tỏc dng ca enzyme ú, phc hp ny kt hp vi tARN thớch hp 85 bng liờn kt ng hoỏ tr to ra aminoacyl-tARN E*[RCH(NH2)CO~AMP] + tARN RCH(NH2)CO~tARN + AMP 3 .2 C ch dch mó (tng hp chui polypeptide) Bc 1: M u (initiation) Quỏ trỡnh... ribosome ln bỏm vo tiu n v bộ to ra mt ribosome hot ng hon chnh Lỳc ny Met-tARN v trớ P v v trớ A trng; mt tARN th hai (aa2- tARN) i vo v trớ A v khp vi codon th hai (Hỡnh 5 .20 ) amino acid RO H2N-C-C-OH - = tRNA 3 H ATP PPi - = RO H2N-C-C-O-P-O-ribose-adenine H amino acid ó c hot hoỏ RO H2N-C-C-O - = AMP Hot hoỏ amino acid v gn aa vo tRNA H aminoacyl-tRNA Hỡnh 5.17 S hot hoỏ axit amin v gn axit amin ó hot... tớnh sinh lý - sinh húa (kiu hỡnh) ca t bo c coi l to ra mt nũi mi - Kiu gen ca vi khun l n bi Tuy nhiờn, b gen cỏc t bo vi khun cng cú th trng thỏi lng bi mt phn; y l do vi khun cú cỏc phng thc trao i di truyn thụng qua cỏc quỏ trỡnh sau: tip hp (conjugation), bin np (transformation) v ti np (transduction) Hỡnh thc sinh sn ny c gi l sinh sn cn hu tớnh (parasexual reproduction) ch khụng phi hu tớnh 2. 2... Methionine bỡnh thng Hỡnh 5 .21 Quỏ trỡnh tng hp kộo di chui polypeptide 88 Hỡnh 5 .22 Quỏ trỡnh kt thỳc tng hp chui polypeptide 4 Nhng im khỏc bit trong phiờn mó v dch mó prokaryote v eukaryote (1) Trờn õy mi ch phõn tớch hot ng ca mt ribosome trờn mARN Thc ra, trờn mt mARN cú rt nhiu ribosome cựng hot ng, gi l polyribosome hay polysome, to ra nhiu polypeptide ging nhau Hỡnh 5 .23 Nhiu ribosome (polysome)... cựng (Hỡnh 5 .21 ) Bc 3: Kt thỳc (termination) Quỏ trỡnh tng hp chui polypeptide s dng li khi mt codon kt thỳc c a i din vi v trớ A trng, vn c nhn bit bi mt protein kt thỳc gi l nhõn t gii phúng RF (release factor) S cú mt ca nú cựng vi transferase ct ri chui polypeptide ra khi tARN cui cựng v phúng thớch hai tiu n v ribosome cng nh chui polypeptide v tARN ra khi mARN (Hỡnh 5 .22 ) 87 Hỡnh 5 .20 M u dch... thc sinh sn ny c gi l sinh sn cn hu tớnh (parasexual reproduction) ch khụng phi hu tớnh 2. 2 iu ho hot ng ca Operon lactose (lac operon) 2. 2.1 iu ho õm tớnh Operon lactose Khi trong mụi trng nuụi cy E coli khụng cú lactose (cht cm ng) thỡ operon khụng hot 95 ng, ngha l cỏc enzyme tham gia phõn gii lactose khụng c sinh ra Nguyờn nhõn l do cht c ch bỏm cht vo yu t vn hnh gõy c ch s phiờn mó ca cỏc gen cu... (iii) bn vựng c ỏnh s 14 xy ra s t b sung gia cỏc vựng 1 v 2, v gia 3 v 4; mt s trng hp cú th xy ra s kt cp gia cỏc vựng 2 v 3 100 Do trong trỡnh t mó húa ca on dn u trpL cú hai codon Trp, nờn s dch mó on ny t ra nhy cm vi s lng tARNtrp a vo Nu mụi trng cung cp y Trp, ribosome trt qua cỏc codon Trp i vo vựng 2 V s cú mt ca ribosome vựng 2 ngn cn vựng ny kt cp vi vựng 3 Khi ú vựng 3 s cp vi vựng... (B) 2 iu ho biu hin gen prokaryote 2. 1 Cu trỳc Operon Phn ln cỏc gen trong b gen vi khun c t chc thnh cỏc n v hot ng chc nng c trng, gi l cỏc operon Cỏc gen cu trỳc trong mt operon c iu ho chung trong quỏ trỡnh chuyn hoỏ mt hp cht nht nh ca t bo Mụ hỡnh operon c F Jacob v J Monod (1961) a ra ln u tiờn l operon Lactose (lac operon; cho tin ta vit: operon Lac) vn c nghiờn cu k nht cho n nay (Hỡnh 6 .2) ... 18 -20 nm 20 -22 nm 50S 60S 23 S (29 04 nt) 28 S (4.718 nt) 5S ( 120 nt) 5,8S (160 nt) Tiu n v ln rARN 5S ( 120 nt) Protein 34 phõn t ~50 phõn t 30S 40S rARN 16S (1.5 42 nt) 18S (1.874 nt) Protein 21 ... thiờn Bin thiờn tARN Mang axit amin 15 2, 5.101 ~ 75 rARN 5S Thnh phn ribosome 80 3,6.101 120 16S Thnh phn ribosome 0,55.10 23 S Thnh phn ribosome 1 ,2. 10 15 42 2904 Ngoi ba loi ARN chớnh (rARN, tARN... ti np (transduction) Hỡnh thc sinh sn ny c gi l sinh sn cn hu tớnh (parasexual reproduction) ch khụng phi hu tớnh 2. 2 iu ho hot ng ca Operon lactose (lac operon) 2. 2.1 iu ho õm tớnh Operon lactose