Giới thiệu số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật (tt) Một số phương pháp phổ biến sử dụng bảo quản nhóm vi sinh vật cụ thể: 5.2 Bảo quản vi tảo: Vi tảo thông thường bảo quản theo phương pháp: Cấy truyền, lạnh sâu đông khô Các phương pháp trình bày chi tiết phần vi khuẩn Một số điểm cần ý bảo quản vi tảo chỗ: Nên dùng tế bào già pha cân bằng, phương pháp lạnh sâu cho kết tốt phương pháp đông khô 5.3 Các phương pháp dùng cho bảo quản nấm sợi: a Phương pháp cấy truyền: Phương pháp thường ứng dụng với sợi nấm có bào tử Các chủng nấm sợi nuôi môi trường thạch thích hợp sợi nấm phát triển đến mức độ cực đại, sau trình hình thành bào tử, ống giống bảo quản theo cách khác nhau: Các ống thạch để tủ lạnh (4-7 OC) Bảo quản thạch lớp dầu: Các ống thạch bảo quản lớp dầu parafin có tỷ trọng tương đối 0.83- 0.89 khử trùng O nhiệt độ 121 C 15 phút Lớp dầu cách bề mặt thạch khoảng cm Nhiệt độ bảo quản 15-20 OC Bảo quản nước, nấm sợi nuôi môi trường thạch đĩa Sau sợi phát triển cực đại cắt thành - miếng nhỏ kích thước khoảng mm2 cho vào lọ nước trùng Bảo quản nhiệt độ phòng b Bảo quản nấm sợi có bào tử silicagel: Chuẩn bị: 1, Lọ đựng silicagel (10-15ml) có nắp chịu nhiệt (sắt hay nhựa) trùng nhiệt độ 170 OC 2, Silicagel: Loại suốt, màu, kích thước số lượng hạt silicagel đưa vào không 1/3 thể tích lọ, ° trùng nhiệt độ 170 C 3, Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt O (115 C/20 phút) 4, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo chủng, môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác (10-15 ngày) Cách tiến hành: 1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao (đối với số chủng có số lượng bào tử thấp tạo dịch bào tử từ vài ống thạch bào tử khác nhau) 2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào lọ đựng silicagel Chú ý silicagel hút nước sinh nhiệt việc đưa dịch bào tử vào phải thực chậu nước đá Lượng dịch bào tử đưa vào không vượt 1/3 thể tích hạt silicagel lọ Sau dùng tay lắc đảm bảo hạt silicagel dính dịch bào tử nấm sợi Dán nhãn, ghi thông tin cần thiết số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường nhiệt độ thích hợp 3, Lọ silicagel đậy nắp cẩn thận không vặn chặt (nới 1,5 vòng) sau giữ bình hút ẩm (độ ẩm 35-40%), 25OC tuần Vặn chặt nút quấn giấy parafil giữ 4OC Kiểm tra độ sống sót sau bảo quản: Mẫu silicagel °C, dùng que cấy vô trùng lấy hạt silicagel để mặt thạch môi trường mầm thóc (Maltagar), lắc cho hạt silicagel tiếp xúc lên mặt môi trường Để nhiệt độ thích hợp, kiểm tra tra khuẩn lạc nấm theo thời gian thích hợp c Bảo quản nấm sợi có bào tử theo phương pháp đông khô (freez-drying): Chuẩn bị: 1, Ống đông khô rửa (sonic cleaner) 15 phút sau O khử trùng 170 C 2, Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115OC/20 phút) 3, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác (10-15 ngày) Cách tiến hành: 1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao (đối với số chủng có số lượng bào tử thấp tạo dịch bào tử từ vài ống thạch bào tử khác nhau) 2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 0,3 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho chủng Dán nhãn, ghi thông tin cần thiết mã số chủng, ngày bảo quản, môi trường nhiệt độ thích hợp Sau đậy nút hay giấy bạc 3, Giữ -80°C trước tiến hành đông khô, đồng thời bật máy Dura-Stop, nhiệt độ đạt -40OC, đưa mẫu vào tủ đông khô Dura-Stop, bật máy DuraDry, mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -55OC, tăng nhiệt O độ Dura-Stop lên -5 C, để qua đêm 4, Tăng nhiệt độ Dura-Stop lên 25°C, đạt nhiệt độ cần thiết, tắt máy hút chân không không tắt Dura-Dry 5, Tắt Dura-Stop, nối tube mẫu vào hệ thống manifold, bật máy Dura-Dry, tiến hành hàn ống độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55OC Chú ý: Trong trường hợp dùng Dura-Dry thực sau: Tiến hành bước 1,2,3,4 Mẫu để tiền đông khô -80°C Bật máy Dura-Dry, đạt nhiệt độ -60oC đến -55oC, độ chân không 45 minitor, gắn ống mẫu với hệ thống manifold tiến hành hàn ống độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55oC Kiểm tra độ sống sót sau đông khô: - 1, Mở ống đông khô cách đốt nóng đầu hàn đèn cồn làm lạnh đột ngột cồn đốt 2, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 1ml nước cất vô trùng từ ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất vô trùng làm tan mẫu đông khô Hút toàn dịch huyền phù sang ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất Trộn nhỏ vào vị trí khác (mỗi vị trí giọt) môi trường thạch đĩa thích hợp nghiêng cho dịch chảy dọc theo hướng hình vẽ: 3, Sau đậy nắp đĩa, bao quanh parafil để nhiệt độ thích hợp 4, Cách đánh giá: Rất tốt: ≥ 100 khuẩn lạc Khá: 50 – 100 khuẩn lạc Trung bình: 10-50 khuẩn lạc Kém: < 10 khuẩn lạc Không mọc Bảo quản thực với mẫu từ trở lên Tuy nhiên, có số nấm sợi mà khuẩn lạc mọc tràn lan đánh sau: Nếu khuẩn lạc mọc khắp bề mặt đĩa tốt Mẻ đông khô thành công số khuẩn lạc mọc chiếm nửa bề mặt môi trường đĩa petri Các mẫu có số lượng khuẩn lạc mọc mức phải làm tăng mật độ bào tử trước đông khô thay đổi môi trường sinh bào tử, chuẩn bị dịch huyền phù bào tử từ 3-4 ống nghiệm bào tử nấm sợi d Bảo quản nấm sợi phương pháp đông khô trực tiếp: Phương pháp đông khô trực tiếp thực tương tự phương pháp đông khô trình bày thực sau: Chuẩn bị: 1, Ống đông khô rửa (sonic cleaner) 15 phút sau khử trùng 170oC 2, Môi trường L-drying chuẩn có thành phần sau: Đệm phosphat: 0.1M : 100 ml Monosodium glutamat: g Adonitol: 1.5 g (Khử trùng 115oC/20 phút) 3, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác (10-15 ngày) Cách tiến hành: 1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml môi trường trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử nấm có mật độ cao (đối với số chủng có số lượng bào tử thấp tạo dịch bào tử từ vài ống thạch bào tử khác nhau) 2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho chủng, dán nhãn, ghi thông tin cần thiết số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường nhiệt độ thích hợp Sau đậy nút hay giấy bạc 3, Đồng thời bật máy DuraDry, mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -75oC, nối ampoule mẫu vào hệ thống manifold (chú ý khoá van chân không nối ampoule mẫu với tube manifold sau lại mở ra, để đảm bảo độ chân không cần thiết làm đông khô phải đưa mẫu vào tín hiệu đèn thị cho phép) Khi độ chân không đạt 4548 minitor, nhiệt độ -55oC tiến hành trình làm khô 4, Hàn kín ampoule mẫu: Khi máy cô Dura-Dry chạy để đảm bảo độ chân không cần thiết, khoá van cho ampoule mẫu tiến hành hàn với mẫu vị trí ống bị thắt Dùng lửa gas để đốt nóng phần ống thắt cho phía xoay cho thuỷ tinh chảy bịt kín ống Sau dùng lửa gas để cắt rời phần (nối với manifold) phần chứa mẫu Hết đợt lại khoá van ampoule mẫu hàn Kiểm tra chất lượng sau bảo quản: Để kiểm tra độ sống sót mẫu nấm sợi bảo quản, thực theo cách mô tả phần đông khô Kiểm tra độ chủng: mẫu cấy môi trường thích hợp quan sát hình thái đặc điểm sinh học đặc trưng cần thiết để đánh giá khả tạp nhiễm đặc tính sinh học Thí nghiệm đánh giá nhanh thời gian bảo quản: - mẫu sau đông khô trực tiếp giữ 37oC tuần Độ sống sót mẫu bảo quản giảm tuần 37oC tương đương với bảo quản 10 năm 4oC e Bảo quản nấm sợi phương pháp lạnh sâu -80 oC o nitơ lỏng (-196 C): Vietsciences- Dương Văn Hợp, Nguyễn Lân Dũng [...]... tra chất lượng ngay sau khi bảo quản: Để kiểm tra độ sống sót của mẫu nấm sợi bảo quản, có thể thực hiện theo cách đã được mô tả ở phần đông khô Kiểm tra độ thuần chủng: các mẫu được cấy trên môi trường thích hợp và quan sát hình thái và các đặc điểm sinh học đặc trưng cần thiết để đánh giá khả năng tạp nhiễm và đặc tính sinh học Thí nghiệm đánh giá nhanh thời gian bảo quản: các - mẫu sau đông khô... sinh học Thí nghiệm đánh giá nhanh thời gian bảo quản: các - mẫu sau đông khô trực tiếp được giữ ở 37oC trong 2 tuần Độ sống sót của mẫu bảo quản giảm trong 2 tuần ở 37oC tương đương với bảo quản 10 năm ở 4oC e Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp lạnh sâu -80 oC và o nitơ lỏng (-196 C): Vietsciences- Dương Văn Hợp, Nguyễn Lân Dũng ... cấy tạo dịch huyền phù bào tử nấm có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau) 2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho mỗi chủng, dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp Sau đó đậy bằng nút bông... khắp trên bề mặt đĩa là tốt Mẻ đông khô là thành công nếu như số khuẩn lạc mọc chiếm ít nhất là nửa bề mặt môi trường trong đĩa petri Các mẫu có số lượng khuẩn lạc mọc dưới mức trên phải làm tăng mật độ bào tử trước khi đông khô như thay đổi môi trường sinh bào tử, hoặc chuẩn bị dịch huyền phù bào tử từ 3-4 ống nghiệm bào tử nấm sợi d Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp đông khô trực tiếp: Phương pháp... thạch đĩa thích hợp và nghiêng cho dịch chảy đều dọc theo một hướng như hình vẽ: 3, Sau đó đậy nắp đĩa, bao quanh bằng parafil và để ở nhiệt độ thích hợp 4, Cách đánh giá: Rất tốt: ≥ 100 khuẩn lạc Khá: 50 – 100 khuẩn lạc Trung bình: 10-50 khuẩn lạc Kém: < 10 khuẩn lạc Không mọc Bảo quản được thực hiện với các mẫu từ khá trở lên Tuy nhiên, có một số nấm sợi mà khuẩn lạc mọc tràn lan thì có thể đánh giá... chân không khi nối ampoule mẫu với tube manifold sau đó lại mở ra, để đảm bảo độ chân không cần thiết khi làm đông khô phải lần lượt đưa mẫu vào khi tín hiệu đèn chỉ thị cho phép) Khi độ chân không đạt 4548 minitor, nhiệt độ -55oC tiến hành quá trình làm khô trong 3 giờ 4, Hàn kín ampoule mẫu: Khi máy cô Dura-Dry đang chạy để đảm bảo độ chân không cần thiết, lần lượt khoá van cho từng ampoule mẫu và tiến... 3 giờ Bật máy Dura-Dry, khi đạt nhiệt độ -60oC đến -55oC, độ chân không 45 minitor, gắn ống mẫu với hệ thống manifold tiến hành hàn ống khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55oC Kiểm tra độ sống sót sau khi đông khô: - 1, Mở ống đông khô bằng cách đốt nóng đầu hàn trên đèn cồn và làm lạnh đột ngột bằng cồn đốt 2, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 1ml nước cất vô trùng từ ống nghiệm chứa 9,8 ml ... tính sinh học Thí nghiệm đánh giá nhanh thời gian bảo quản: - mẫu sau đông khô trực tiếp giữ 37oC tuần Độ sống sót mẫu bảo quản giảm tuần 37oC tương đương với bảo quản 10 năm 4oC e Bảo quản nấm... bảo quản 15-20 OC Bảo quản nước, nấm sợi nuôi môi trường thạch đĩa Sau sợi phát triển cực đại cắt thành - miếng nhỏ kích thước khoảng mm2 cho vào lọ nước trùng Bảo quản nhiệt độ phòng b Bảo quản. .. chất lượng sau bảo quản: Để kiểm tra độ sống sót mẫu nấm sợi bảo quản, thực theo cách mô tả phần đông khô Kiểm tra độ chủng: mẫu cấy môi trường thích hợp quan sát hình thái đặc điểm sinh học đặc