CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT PHẦN I : MỞ ĐẦU CHƯƠNG I ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH 1.1 Giới thiệu lịch sử chất kháng sinh Sự phát triển vi sinh vật học nói chung, vi sinh vật công nghiệp nói riêng, với bước ngoặc lịch sử phát minh vĩ đại chất kháng sinh Alexander Fleming (1982) mở kỷ nguyên y học: khai sinh ngành công nghệ sản xuất chất kháng sinh ứng dụng thuốc kháng sinh vào điều trị cho người Thuật ngữ" chất kháng sinh" lần Pasteur Joubert (1877) sử dụng để mô tả tượng kìm hãm khả gây bệnh vi khuẩn Bacillus anthracis động vật nhiễm bệnh tiêm vào động vật số loại vi khuẩn hiếu khí lành tính khác Babes (1885) nêu định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn chủng đặc tính tổng hợp hợp chất hoá học có hoạt tính kìm hãm chủng đối kháng Nicolle (1907) người phát hoạt tính kháng khuẩn Bacillus subtilis có liên quan đến trình hình thành bào tử loại trực khuẩn Gratia đồng nghiệp (1925) tách từ nấm mốc chế phẩm sử dụng để điều trị hiệu bệnh truyền nhiễm da cầu khuẩn Mặc dù vậy, thực tế tới năm 1929 thuật ngữ " Chất kháng sinh" Alexander Fleming mô tả cách đầy đủ thức báo cáo chi tiết penicillin Thập kỷ 40 50 kỷ XX ghi nhận bước tiến vượt bậc ngành công nghệ sản xuất kháng sinh non trẻ, với hàng loạt kiện : Khám phá hàng loạt chất kháng sinh, thí dụ griseofulvin (1939), gramicidin S (1942) , streptomycin (1943), bacitracin (1945), cloramphenicol polymicin (1947), clotetracyclin cephalosporin (1948), neomycin (1949), oxytetracyclin nystatin (1950), erythromycin (1952), cycloserin (1954), amphotericin B vancomycin (1956), metronidazol, kanamycin rifamycin (1957) Áp dụng phối hợp kỹ thuật tuyển chọn tạo giống tiên tiến (đặc biệt kỹ thuật gây đột biến, kỹ thuật dung hợp tế bào, kỹ thuật tái tổ hợp gen ) tạo GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT biến chủng công nghiệp có lực "siêu tổng hợp" chất kháng sinh cao gấp hàng ngàn vạn lần chủng ban đầu Triển khai thành công công nghệ lên men chìm quy mô sản xuất công nghiệp để sản xuất penicillin G (1942) việc hoàn thiện công nghệ lên men sản phẩm khác Việc phát hiện, tinh chế sử dụng axit - aminopenicillanic (6-APA, 1959) làm nguyên liệu để sản xuất chất kháng sinh penicilin bán tổng hợp cho phép tạo hàng loạt dẫn xuất penicilin số kháng sinh β - lactam bán tổng hợp khác 1.2 Định nghĩa kháng sinh Chất kháng sinh hiểu chất hoá học xác định, chất enzym, có nguồn gốc sinh học (trong phổ biến từ vi sinh vật), với đặc tính nồng độ thấp (hoặc thấp) có khả ức chế mạnh mẽ tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh mà đảm bảo an toàn cho người hay động vật điều trị 1.3 Cơ chế tác dụng kháng sinh Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh ( hay đối tượng gây bệnh khác - gọi tắt mầm bệnh) chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy thuộc vào chất kháng sinh đó; đó, kiểu tác động thường gặp làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạn chức điều tiết trình vận chuyển vật chất màng tế bào chất, làm rối loạn hay kiềm toả trình sinh tổng hợp protein, rối loạn trình tái ADN, tương tác đặc hiệu với giai đoạn định chuyển hóa trao đổi chất (hình 1.1) GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT Hình 1.1 Vị trí tác dụng số chất kháng sinh CHƯƠNG II CƠ CHẾ TÁC DỤNG PENICILLIN ĐỐI VỚI VI KHUẨN 2.1 Cơ chế tác dụng Tác dụng điều trị penicillin kháng sinh khác thuộc họ β-lactam xác định là: cấu trúc penicillin có nhiều điểm gần gũi với dipeptit D-alanin-Dalanin, hợp phần cấu trúc lớp peptido-glycan thành tế bào Do tương đồng đặc tính cấu trúc làm cho hoạt tính enzym tham gia vào trình tổng hợp tế bào bị biến đổi, enzym nhận "nhầm" chất Kết phần thành tế bào tổng hợp với "nhầm lẫn" không hình thành, làm cho thành tế bào mầm bệnh có phần hay chúng hoàn toàn thành tế bào chúng dễ dàng bị tự phân môi trường bị công cụ tự vệ thể bệnh nhân tiêu diệt Đồng thời, kháng sinh β-lactam liên kết đặc hiệu với số protein màng tế bào chất (đến xác định chín protein trên) Sự liên kết làm "bất hoạt" "hòa tan" protein đặc hiệu màng, dẫn đến làm hoạt tính polymeraza ATPaza (người ta xác định môi trường kháng sinh có D-alanin -cacboxylpeptidaza hoạt động số ACPaza lại GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT có hoạt tính B-lactamaza yếu) Ngoài ra, người ta phát thấy ảnh hưởng pencillin đến chuyển hóa photpholipit tế bào 2.2 Sự kháng thuốc Tuy nhiên nhiều trường hợp điều trị với penicillin xuất dấu kháng thuốc Nguyên nhân tượng kháng penicillin chúng tổng hợp đuợc hai enzym penicillinaza đặc biệt enzym β-lactamaza Gen mã hóa sinh tổng hợp enzym β-lactamaza lưu giữ plasmid (hoặc trasporon ) Vì vậy, với thời gian điều trị, lực kháng thuốc chúng trở nên thành thục Để vô hiệu khả kháng thuốc nêu trên, nguyên lý, giải pháp đơn giản làm vô hiệu khả tương tác enzym với chất cách làm biến đổi cấu trúc phân tử penicillin CHƯƠNG III CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN 3.1 Định nghĩa công thức hoá học tổng quát penicillin Penicillin nhóm kháng sinh thu từ nấm Penicillium hay điều chế Alexander Fleming tình cờ phát penicillin vào năm 1928 phải 10 năm sau penicillin nhà hoá sinh người Anh gốc Đức Ernest Chain nhà nghiên cứu bệnh học Úc Howard Florey số nhà khoa học khác nghiên cứu kỹ Penicillin sát trùng cách giết vi khuẩn hạn chế sinh trưởng chúng Hình 3.1: Sản phẩm penicillin lên men tự nhiên nhờ P.chrysogenum GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT 3.2 Cơ sở công nghệ sinh tổng hợp penicillin Vào năm đầu, việc nghiên cứu sản xuất penicillin thường sử dụng chủng có hoạt lực cao thuộc loài P notatum P baculatum Nhưng từ trường đại học Wisconsin (Mỹ) phân lập chủng P.chrysogenum có hoạt tính cao chủng thay từ khoảng sau năm 50 kỷ XX đến tất công ty sản xuất penicillin giới sử dụng biến chủng P.chrysogenum công nghiệp Việc tuyển chọn chủng công nghiệp để lên men sản xuất penicillin dựa vào kỹ thuật áp dụng hiệu để thu nhận biến chủng "siêu tổng hợp" penicillin lại kỹ thuật gây đột biến thường như: xử lý tia Rơn - ghen, xử lý tia cực tím tạo đột biến hoá chất, thí dụ Metylbis - amin (metyl -2-β-clo- etylamin), N-mustar (tris - β-clo- etylamin), Sarcrolyzin, HNO2, Dimetylsulfat, 1,2,3,4 -diepoxybutan 3.3.Đặc điểm hình thái sinh lý nấm P chrysogenum Nấm P chrysogenum nấm sợi, thường sống vùng ôn đới, cận nhiệt đới thường tìm thấy thực phẩm có chứa muối hầu hết môi trường bên nhà báo cáo nguyên nhân gây bệnh cho người Giống nhiều loài khác nấm P chrysogenum thường sinh sản bào tử từ cuống bào tử đính Bào từ nấm có màu xanh đến màu xanh sinh sắc tố màu vàng Hình 3.2.Nấm Penicillium chrysogenum mọc hộp petri GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT Hình 3.3 Nấm Penicillium chrysogenum kính vi quang học 3.4 Cơ chế sinh tổng hợp penicillin nấm mốc Penicillium chrysogenum Theo quan điểm phổ biến nay, trình sinh tổng hợp penicillin nấm mốc P chrysogenum tóm tắt sau: từ ba tiền chất ban đầu α-aminoadipic, cystein valin ngưng tụ lại thành tripeptit δ -(α- aminoadipyl) - cysteinyl - valin ; trình khép mạch tạo vòng β-lactam vòng thiazolidin để tạo thành izopenicillin-N; trao đổi nhóm α-aminoadipyl với phenylacetic (hay phenooxyacetic) tạo thành sản phẩm penicillin G (hay penicillin V, xem sơ đồ tổng hợp penicillin G hình 3.4 GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT Hình 3.4 Sơ đồ chế sinh tổng hợp penicillin từ axit L- α- aminoadipic, Lcystein L-valin Trong axit amin tiền chất cystein tổng hợp ba đường tổng hợp từ xerin (hình 3.5), từ homoxerin với việc tuần hoàn chuyển hóa α-cetobutyrat qua oxaloacetat (hình 3.6), hay từ homoxerin với chuyển hóa α- cetobutyrat qua izolecin Đồng thời α- aminoadipic giải phóng sơ đồ hình 3.7 tuần hoàn để tham gia trình ngưng tụ ban đầu GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT Hình 3.5 Sơ đồ chế sinh tổng hợp cystein từ xerin Hình 3.6 Sơ đồ chế sinh tổng hợp cistein từ homoxerin với biến đổi αcetobutyrat thành oxaloacetat GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT Tuy nhiên, giải phóng tích tụ môi trường (vì trình lên men sản xuất penicillin V phát thấy dịch lên men lượng lớn α- aminoadipic dạng vòng) Như vậy, trình sinh tổng hợp penicillin, phụ thuộc vào điều kiện lên men cụ thể định, xảy theo sáu đường hướng khác Do đó, hiệu suất chuyển hoá chất - sản phẩm biến đổi phụ thuộc vào đường hướng sinh tổng hợp tương ứng Theo lý thuyết hiệu suất lên men khoảng 683 - 1544 UI penicillin/g glucoza; song, thực tế, với chủng có hoạt tính sinh tổng hợp cao đạt khoảng 200 UI/g glucoza Hình 3.7 Sơ đồ chế sinh tổng hợp α- aminoadipic GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT Hình 3.8 Sơ đồ chế sinh tổng hợp valin 3.5 Kỹ thuật lên men chìm GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 10 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT  Pellet xốp (fluffy loose pellets) dạng pellet có phần bên hệ sợi cuộn thành khối mịn, lớp sợi phía bên cuộn lỏng lẻo tạo thành cấu trúc xốp  Pellet mịn (compact smooth pellets) có đặc điểm phần sợi phía bên pellet cuộn tương đối chặt chẽ đến gần sát lớp sợi phía ngoài, lớp sợi phía cuộn đủ thành lớp sợi mịn  Pellet rỗng (hollow pellets) dạng pellet có phần sợi bên bị tự phân tạo thành khoảng rỗng, hệ sợi phía bên cuộn chặt thành lớp sợi mịn chắn - Hiệu chung trình lên men có quan hệ hữu với số lượng, kích thước cấu trúc pellet nấm Trong thực tiễn sản xuất công nghiệp, người ta thường điều chỉnh thông số công nghệ theo hướng ưu tiên tạo dạng pellet đủ nhỏ mịn, hạn chế tạo pellet xốp ngăn ngừa hình thành pellet rỗng Điều kiện công nghệ tương ứng với mục tiêu thường áp dụng : tỉ lệ giống 10%, với mật độ dịch giống (210).1011 bào tử /m3; phối hợp điều chỉnh sục khí khuấy trộn để đảm bảo cung cấp oxy hòa tan dư so với nhu cầu tương ứng với thời điểm lên men, để tạo pellet mịn nhỏ (kích thước pellet thích hợp khoảng 0,2 - 0,5mm), điều kiện cân nhu cầu tiết kiệm mức tiêu tốn lượng khuấy trộn 3.6.2 Đặc tính nhiệt động dịch lên men: Trong thiết bị lên men dung tích lớn có sục khí khuất trộn, thực tế xác lập đồng khắp vùng thể tích làm việc thiết bị Tại vùng chảy rối (vùng gần cánh khuấy), tốc độ trao đổi nhiệt, tốc độ chuyển khối xảy mạnh mẽ Còn vùng chảy màng (vùng sát thành thiết bị, vùng gần ống xoắn trao đổi nhiệt, vùng hiệu hay vùng chết thiết bị…) tốc độ chuyển khối hay tốc độ truyền nhiệt giảm Ngoài ra, khu vực định thiết bị xuất vùng xoáy cục hay dòng chảy thứ cấp làm thiếu hụt hàm lượng oxy hòa tan Các yếu tố nêu tác động trực tiếp đến lực sinh tổng hợp chủng, hiệu chuyển hóa tạo sản phẩm hiệu kinh tế chung toàn trình lên men Thực tế thường chọn chế độ khuấy trộn dư mức yêu cầu 3.6.3 Thành phần môi trường lên men: GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 13 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT Môi trường sở để lên men penicillin, vào thời kỳ đầu năm 40 - 50, môi trường lactoza - nước chiết ngô, với thành phần nêu bảng 2.1 Nguồn chất chính: lactoza thay phần toàn chất khác như: loại đường hexoza, đường pentoza, disaccarit, dextrin hay thay dầu thực vật Trong chất nêu trên, hiệu cao glucoza Ngoài ra, sử dụng dầu thực vật làm chất phá bọt phải xét đến hiệu ứng nấm mốc sử dụng phần dầu thực vật làm nguồn cung cấp thức ăn cacbon, để tính toán điều chỉnh nồng độ glucoza môi trường lên men (và cản trở trình chuyển khối ảnh hưởng dầu phá bọt) Nguồn cung cấp thức ăn nitơ: sử dụng bột đậu tương, bột hạt bông, loại dầu cám Nhu cầu thức ăn nitơ đáp ứng cách cung cấp liên tục (NH4)2SO4, trì nồng độ thấp, khoảng 250 - 340g/l (nếu dư thừa hiệu sinh tổng hợp penicillin giảm, thiếu xảy tượng tự phân hệ sợi) Hàm lượng chất khoáng bổ sung: tính toán, phụ thuộc vào lượng dịch chiết ngô sử dụng; pH môi trường điều chỉnh trước trùng, sau suốt trình lên men giám sát chặt chẽ điều chỉnh theo yêu cầu công nghệ Nồng độ tiền chất tạo nhánh:Trong trình sinh tổng hợp penicillin, việc kết gắn mạch nhánh phân tử penicillin không mang tính đặc hiệu chặt chẽ Nhờ vậy, trì nồng độ tiền chất tạo nhánh cần thiết phenylacetat (hoặc henooxyacetat) cho phép thu nhận chủ yếu loại penicillin G dịch lên men (hoặc penicillin V) Theo lý thuyết, nhu cầu phenylaceta 0,47g/gam penicillin G (hoặc phenooxyacetat 0,50g/gam penicillin V ) Cần ý hai cấu tử thực chất gây độc cho nấm nên người ta thường lựa chọn giải pháp bổ sung liên tục cấu tử khống chế chặt chẽ nồng độ theo yêu cầu, để không làm suy giảm lực lên men chủng sản xuất GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 14 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT Bảng 3.1 : Thành phần môi trường lên men để lên men sản xuất penicillin 3.6.4 Điều kiện tiến hành lên men: Nhiệt độ thông số có ảnh hưởng lớn đến phát triển nấm mốc, khả sinh tổng hợp lực tích tụ penicillin chúng Nhìn chung nấm mốc phát triển thuận lợi dải nhiệt độ khoảng 30 0C Tuy nhiên, ở dải nhiệt độ tốc độ phân huỷ penicillin xảy mạnh mẽ Trong thực tế, giai đoạn nhân giống sản xuất người ta thường nhân dải nhiệt độ 300C; sang giai đoạn lên men thường áp dụng hai chế độ nhiệt :  Lên men dải nhiệt độ: Thường trì nhiệt độ suốt trình lên men dải nhiệt độ 25 - 270C  Lên men hai chế độ nhiệt độ: Giai đoạn lên men bắt đầu tiến hành 30 0C hệ sợi phát triển đạt yêu cầu hàm lượng sinh khối điều chỉnh nhiệt độ sang chế độ lên men penicillin dải nhiệt độ 22 - 250C (có công nghệ điều chỉnh xuống 22 230C, giữ nhiệt độ tiếp hai ngày chuyển sang lên men tiếp 25 0C kết thúc trình lên men) GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 15 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT pH môi trường thuận lợi cho phát triển hệ sợi cho trình sinh tổng hợp penicillin thường dao động khoảng pH = 6,8 - 7,4 Tuy nhiên điều kiện pH cao xu hướng phân huỷ penicillin tăng lên Vì vậy, sản xuất pH môi trường thường khống chế chặt chẽ giá trị lựa chọn khoảng pH = 6,2 - 6,8 Nồng độ oxy hoà tan cường độ khuấy trộn dịch lên men: Với nhiều chủng nấm mốc, nồng độ oxy hòa tan thuận lợi cho trình sinh tổng hợp penicillin dao động quanh mức 30% nồng độ oxy bão hòa Nồng độ CO dịch lên men mức định cần thiết cho trình nảy mầm bào tử nấm mốc; nhiên nồng độ CO2 cao làm cản trở trình hấp thu chuyển hoá chất chủng, nghĩa làm làm cản trở trình sinh tổng hợp penicillin 3.6.5 Sự tích tụ phân huỷ penicillin: Trong trình lên men, nhiều nguyên nhân khác nhau, có ảnh hưởng nồng độ penicillin tích tụ môi trường ngày tăng, làm cho lực sinh tổng hợp penicillin chủng có xu hướng giảm dần theo thời gian lên men Đồng thời, phụ thuộc vào nhiệt pH môi trường, phần lượng penicillin tích tụ bị phân huỷ theo thời gian Nhằm giảm tổn thất trên, sau kết thúc trình lên men cần xử lý thu sản phẩm sớm có giải pháp hạ thấp nhanh nhiệt độ dịch lên men PHẦN :QUI TRÌNH SẢN XUẤT PENICILLIN TRONG CÔNG NGHIỆP GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 16 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT CHƯƠNG IV QUI TRÌNH LÊN MEN PENICILLIN 4.1 Đặc điểm chung Công nghệ lên men sản xuất penicillin mang nét đặc thù riêng sở sản xuất thông tin hạn chế cung cấp công khai, sáng chế thường giới hạn công đoạn định; khó đưa công nghệ tổng quát chung Theo công nghệ lên men hãng Gist-Brocades (Hà Lan), toàn dây chuyển sản xuất thuốc kháng sinh penicillin phân chia làm bốn công đoạn sau (xem sơ đồ hình 2.8) − Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thường thu penicillin V penicillin G) − Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên − Sản xuất penicillin bán tổng hợp (từ nguyên liệu penicillin tự nhiên) − Pha chế loại thuốc kháng sinh penicillin thương mại Hình 4.1 Sơ đồ dây chuyền sản xuất penicillin (theo Gist-Brocades Copr (Hà Lan)) 4.2 Qui trình lên men GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 17 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT BÀO TỬ/HỆ SỢI BÌNH LẮC BỂ NHÂN GIỐNG NỒI LÊN MEN Sinh khối DỊCH LỌC TỦA ACID HÓA,CHIẾT DUNG MÔI TỦA CHIẾT LẠI-KẾT TỦA PENICILLIN THÀNH PHẨM LOẠI AXYL TỰ NHIÊN TỦA CÁC CHẾ PHẨM BÁN TỔNG HỢP 4.2.1 Lên men Hình 4.2 Qui trình sản xuất penicillin TỦA 4.2.1.1 Chuẩn bị lên men Giống, bảo quản nhân giống cho sản xuất: Giống công nghiệp P.chrysogenum bảo quản lâu dài dạng đông khô, bảo quản siêu lạnh 70 0C bảo quản nitơ lỏng Giống từ môi trường bảo quản cấy chuyền môi trường thạch hộp để hoạt hoá nuôi thu bào tử Dịch huyền phù bào tử thu từ hộp petri cấy chuyển tiếp sang môi trường bình tam giác, sang thiết bị phân giống nhỏ, qua thiết bị nhân giống trung gian cuối thiết bị nhân giống sản xuất Yêu GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 18 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT cầu quan trọng của công đoạn nhân giống phải đảm bảo cung cấp đủ lượng giống cần thiết, với hoạt lực cao, chất lượng đảm bảo thời điểm có công đoạn nhân giống cuối cung cấp đủ lượng giống đạt yêu cầu kỹ thuật cho lên men sản xuất Trong thực tiễn, để đảm bảo cho trình lên men thuận lợi người ta thường tính toán lượng giống cấp cho mật độ giống dịch lên men ban đầu khoảng - 5.109 bào tử / m3 Thành phần môi trường nhân giống cần tính toán để đảm bảo cung cấp đủ nguồn thức ăn C, N, chất khoáng thành phần khác, đảm bảo cho hình thành phát triển thuận lợi pellet Chuẩn bị môi trường lên men thiết bị: - Chuẩn bị môi trường lên men: - Cân đong, pha chế riêng rẽ thành phần môi trường lên men thùng chứa phù hợp - Thanh trùng gián đoạn 121 0C ( hay trùng liên tục khoảng 140-146 0C) lọc qua vật liệu siêu lọc bơm vào thùng lên men Nếu đặc tính công nghệ thiết bị lên men cho phép, pha chế trùng đồng thời dịch lên men thiết bị Tất cấu tử bổ sung vào môi trường lên men phải xử lý khử khuẩn trước sau bổ sung theo chế độ vận hành vô khuẩn - Thiết bị lên men: Phải vô khuẩn trước đưa vào sử dụng Thường trùng nhiệt 2,5 – 3,0 at thời gian Đông thời khử khuẩn nghiêm ngặt tất hệ thống ống dẫn, khớp nối, van, phin lọc tất thiết bị phụ trợ khác…Trong trình lên men luuôn cố gắng trì áp suất dư thiết bị nhằm hạn chế rũi ro nhiễm tạp - Không khí thường khử khuẩn sơ nén đoạn nhiệt, sau qua màng lọc vô khuẩn hay màng siêu lọc 4.2.1.2 Hiệu kinh tế chung trình lên men Năng lực sinh tổng hợp tích tụ penicillin dịch lên men kết mối tương tác đồng thời hàng loạt yếu tố công nghệ như: hoạt tính sinh tổng hợp GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 19 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT chúng, công nghệ lên men áp dụng, chất lượng nguyên liệu, đặc tính thiết bị lực đáp ứng yêu cầu công nghệ thiết bị, chế độ giám sát điều chỉnh thông số công nghệ, lực kỹ vận hành công nhân Với nguồn chất glucoza lên men theo phương pháp chìm, hệ số phân bổ nguyên liệu dự tính khoảng 25% glucoza nấm mốc sử dụng để tổng hợp hệ sợi, 65% đường sử dụng để trì sống sót hệ sợi, lại khoảng 10% nấm mốc sử dụng để tổng hợp penicillin Hệ số sử dụng thức ăn nitơ lưu huỳnh để tổng hợp penicillin tương ứng 20% 80% Nồng độ penicillin G dịch lên men năm 80 - 90 kỷ XX đạt khoảng 80.000 UI/ml (tương ứng suất khoảng 40 50 kg penicillin G/ m3 dịch lên men ) 4.2.2 Xử lý dịch lên men tinh chế thu penicillin Công đoạn xử lý dịch lên men tinh chế thu penicillin tự nhiên tóm tắt sơ đồ hình 4.3 , bao gồm công đoạn sau đây: Hình 4.3 Sơ đồ tóm tắt công đoạn xử lý dịch lên men thu penicillin tự nhiên 4.2.2.1 Lọc dịch lên men Mục đích: Penicillin sản phẩm lên men ngoại bào Vì vậy, sau kết thúc trình lên men người ta thường tiến hành lọc để giảm tổn hao phân huỷ penicillin giảm bớt khó khăn tinh chế, tạp chất tạo hệ sợi nấm tự phân GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 20 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT Thiết bị lọc: phổ biến thiết bị lọc hút kiểu băng tải kiểu thùng quay Thông thường, người ta cần lọc lần làm lạnh dịch để chuyển sang công đoạn Chỉ trường hợp đặc biệt cần phải xử lý kết tủa phần protein lọc lại dịch lần thứ hai Hiện tượng tự phân hệ sợi nấm thường kéo theo hậu làm cho dịch khó lọc Thu hồi sinh khối nấm: Phần sinh khối nấm rửa sạch, sấy khô sử dụng để chế biến thức ăn gia súc 4.2.2.2 Trích ly Penicillin thường trích ly dạng axít khỏi dịch lọc dung môi amylacetat butylacetat pH = 2,0 - 2,5, nhiệt độ - 0C Nhằm hạn chế lượng penicillin bị phân huỷ, trình trích ly thực thời gian ngắn thiết bị trích ly ngược dòng liên tục kiểu ly tâm nhiều tầng cánh Đồng thời, thời gian trích ly cần giám sát chặt chẽ thông số công nghệ như: nhiệt độ pH, độ vô khuẩn để hạn chế tổn thất phân huỷ penicillin Dịch lên men sau lọc bơm trộn đồng thời với dung dịch H 2SO4 H3PO4 loãng có bổ sung thêm chất chống tạo nhũ bơm song song với dung môi trích ly vào thiết bị Tỉ lệ dịch lọc: dung môi thường chọn khoảng - 10V dịch lọc /1V dung môi Trong số công nghệ, nhằm cải thiện chất lượng sản phẩm, người ta áp dụng phương pháp trích ly hai lần dung môi, với lần đầu trích ly penicillin amylacetat butylacetat; penicillin lại trích ly ngược sang dung dịch đêm pH = 7,2 7,5, thường dung dịch KOH loãng dung dịch NaHCO 3; sau penicillin lại trích ly sang dung môi lần thứ 2, với lượng dung môi hơn.(hình 4.4) GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 21 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT Hình 4.4 Sơ đồ công nghệ trích ly lần dung môi tinh chế penicillin 4.2.2.3 Tẩy màu Để tẩy màu loại bỏ số tạp chất khác, người ta thường bổ sung trực tiếp chất hấp phụ vào dung môi chứa penicillin sau trích ly, sử dụng phổ biến than hoạt tính Sau than hoạt tính tách rửa lại sử dụng thiết bị lọc hút băng tải thiết bị lọc hút kiểu thùng quay Phần than sau lọc đưa chưng thu hồi dung môi xử lý hoàn nguyên, phục vụ cho mẻ sau 4.2.3 Kết tinh sấy thu penicillin tự nhiên Việc kết tinh penicillin V hay penicillin G dạng muối thực đơn giản, cách bổ sung trực tiếp vào dung môi sau tẩy màu lượng nhỏ kali acetat (hay natri acetat) người ta trích ly lại sang dung dịch KOH loãng (hay NaOH loãng), tiến hành cô chân không nhiệt độ thấp, sau bổ sung BuOH để penicillin tự kết tinh Các thông số công nghệ có ảnh hưởng lớn đến hiệu qủa kết tinh : nồng độ penicillin, nồng độ muối acetat, pH dung môi hay pH dung dịch cô đặc, nhiệt độ kết tinh Sau kết tinh, tinh thể penicillin lọc tách máy lọc hút thùng quay Để đảm bảo độ tinh khiết cao hơn, tiến hành hòa tan kết tinh lại penicillin Khi sản phẩm đạt độ tinh theo yêu cầu, thường độ tinh khiết không 99,5%, chúng lọc tánh tinh thể; rửa làm khô sơ dung môi kỵ nước izopropanol hay butylalcohl; hút chân không tách dung môi máy lọc băng tải sấy không khí nóng đến dạng sản phẩm bột muối penicillin Sản phẩm này, phần sử dụng trực tiếp để pha chế thuốc kháng sinh penicillin; GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 22 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT lại, phần lớn sử dụng làm nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất sản phẩm penicillin cephalosporin bán tổng hợp khác Ngoài ra, để sản xuất sản phẩm penicillin có độ tinh khiết cao, người ta cần phải sử dụng phối hợp thêm số giải pháp công nghệ khác CHƯƠNG V SẢN XUẤT CÁC CHẾ PHẨM BETA-LACTAM BÁN TỔNG HỢP TỪ PENICILLIN G 5.1 Sản xuất - APA sản xuất penicillin bán tổng hợp Axit 6- aminopenicillanic hoạt tính kháng khuẩn, sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợp nhiều loại penicillin khác cephalosporin Để sản xuất axit 6- aminopenicillanic, đường hiệu lên men sản xuất penicillin G (hoặc penicillin V); sau áp dụng phương pháp hóa học hay sử dụng enzym acylaza để phân cắt mạch nhánh bên xem sơ đồ hình 5.1 Hình 5.1 Sơ đồ tổng hợp axit 6- aminopenicillanic từ penicillin G Phương pháp hóa học có hiệu suất chuyển hóa cao, tới 90-95%, tốc độ phản ứng nhanh, song lại tiêu hao nhiều lượng, nhiều dung môi chứa đựng nguy ô nhiễm môi trường cao Trong đó, phương pháp enzym, hiệu chuyển hóa thấp điều kiện phản ứng êm dịu mang lại hiệu kinh tế cao nên GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 23 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT triển khai phổ biến thực tiễn sản xuất công nghiệp Đồng thời, nhờ ưu trên, phương pháp enzym hoàn thiện liên tục ngày đạt ưu vượt trội so với phương pháp hóa học 5.2 Sản xuất axit 7- deminodeaxetoxy-cephalosporin (7-ADCA) sản xuất cephalosporin bán tổng hợp Cephalosporin họ chất kháng sinh thuộc nhóm β -lactam với đặc tính quý nhờ bị kháng thuốc penicillin đánh giá an toàn cho người bệnh Các sản phẩm Cephalosporin bán tổng hợp khác tổng hợp từ sản phẩm trung gian axit 7- deminodeaxetoxy-cephalosporin (7-ADCA xem mục 3) Sản phẩm 7ADCA tổng hợp từ penicillin G , từ axit 6- aminopenicillanic hay từ cephalosporin C (một sản phẩm lên men tự nhiên), đến cuối kỷ XX đường hiệu kinh tế tổng hợp từ penicillin G theo sơ đồ 2.12 Từ sản phẩm 7-ADCA người ta dễ dàng acyl hóa mạch nhánh tương ứng để sản xuất cephalosporin bán tổng hợp, bao gồm theo hai hướng thay nhánh tai vị trí C7 (thí dụ cephalecin,cephadrin, cephadroxil ), hay thay đồng thời mạch nhánh hai vị trí C 3, C7 (như: cephazolin, cephatrizin, cefoperazon,cephamadol,cefotiam ) 5.3 Sản xuất β -lactam bán tổng hợp hoạt tính kìm hãm β -lactamaza Beta-lactam gắn lên làm bất hoạt transpeptidase (Penicillin Binding Protein) vi khuẩn, enzyme có vai trò gắn chuỗi peptidoglycan (chủ yếu tạo thành N-acetyl glucosamine N-acetyl muranic acid) lại với Như vậy, vi khuẩn không gắn kết chuỗi peptidoglycan lại để tạo thành vách được, vi khuẩn chết chủ yếu High internal osmotic pressure Vách tế bào vi khuẩn Gram(-) Gram(+ )nhau khác điểm nào? Giống chỗ vách hai loại có góp mặt peptidoglycan khác chỗ vi khuẩn Gram (+) có lớp peptidoglycan dày vi khuẩn Gram(-).Ở Gram(-), có thêm lớp outer membrane, lớp lipopolysaccharide protein Do Gram(-) Gram(+ )đều có cấu tạo vách peptidoglycan nên penicillin tác động đến trình hình thành vách làm vi khuẩn chết Tuy nhiên, vi khuẩn Gram(-) có thêm lớp outer GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 24 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT membrane xem lớp bảo vệ nên tác dụng penicillin lên Gram(-) lên Gram(+) Axit 6- aminopenicillanic sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất số chế phẩm penicillin bán tổng hợp có hoạt tính kĩm hãm B-lactamaza (thí dụ oxacillin,cloxacillin,dicloxacyllin, flucloxacillin ), hay kết hợp sử dụng axit clavunic olivanic làm mạch nhánh để làm tăng hiệu điều trị (hai axit có hoạt tính kháng sinh yếu có hoạt tính kìm hãm B-lactamaza (thí dụ axit bromopenicillanic) Hình 5.2 Sơ đồ tổng hợp hóa học axit 7-ADCA từ penicillin G 5.4 Các sản phẩm penicillin thị trường Sentram Chỉ định: Dự phòng nhiễm khuẩn phẫu thuật, nhiễm khuẩn ổ bụng, đường hô hấp, đường tiểu, da mô mềm, xương khớp, lậu Amoxycillin Chỉ định: Nhiễm trùng đường niệu-sinh dục kể bệnh lậu, nhiễm trùng phụ khoa, nhiễm trùng đường hô hấp, nhiễm trùng đường tiêu hoá GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 25 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT Mekopen-1000000 IU Chỉ định: Trị liệu đặc biệt bệnh liên cầu khuẩn A, viêm họng, chốc nở, viêm tai giữa… Điều trị dự phòng thấp khớp cấp, viêm nang màng tim, viêm nang màng não tuỷ Unasyn Chỉ định: Nhiễm khuẩn đường hô hấp gồm viêm xoang, viêm tai viêm amidan.Viêm đường hô hấp gồm viêm phổi phế quản vi khuẩn Nhiễm khuẩn đường tiểu viêm đài bể thận Nhiễm khuẩn da mô mềm Nhiễm khuẩn lậu cẩu Sultamicilin dùng cho bệnh nhân cần điều trị hợp chất sulbactam ampicilin sau điều trị khởi đầu UNASYN tiêm Dodacin (sultamicillin 375mg) Chỉ định: Sultamicillin định trường hợp nhiễm khuẩn vi khuẩn nhạy cảm với thuốc: Nhiễm khuẩn đường hô hấp gồm viêm xoang, viêm tai viêm amiđan.Nhiễm khuẩn đường hô hấp gồm viêm phổi phế quản vi khuẩn Nhiễm khuẩn đường tiểu viêm đài bể thận Nhiễm khuẩn huyết viêm màng não Nhiễm khuẩn da, mô mềm xương khớp Nhiễm khuẩn lậu cầu Penicilin V Kali Chỉ định: Nhiễm khuẩn liên cầu, phế cầu số chủng tụ cầu chịu tác dụng Bệnh lậu, bệnh viêm màng não Meginococcus, bệnh than, hoại thư sinh hơi, uốn ván, bệnh Leptospirae, giang mai… TÀI LIỆU THAM KHẢO GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 26 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT [1] Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men chất kháng sinh, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 2005 [2] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Tỵ, Vi sinh vật học, Nhà xuất giáo dục1997 [3] Bài giảng kháng sinh, trường Đại học Dược Hà Nội [4] Erick j Vandamme, Marcel Dekker, Biotechnology of industrial Antibiotic, Inc., New York 1984 [5] McKane, Larry, McGraw-Hill, Microbiology, Inc.1996 [6] Harvey W Blanch, Stephen Drew and Daniel I C Wan, Comprehensive Biotechnology, Pergamon Press, 1985 [7] H Weide, J Páca und W A Knorre,, Biotechnology, VEB Gustav Fischer Verlag Jena, 1987 GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 27 [...]... lý thu sản phẩm sớm hoặc có giải pháp hạ thấp nhanh nhiệt độ dịch lên men PHẦN 2 :QUI TRÌNH SẢN XUẤT PENICILLIN TRONG CÔNG NGHIỆP GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 16 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT CHƯƠNG IV QUI TRÌNH LÊN MEN PENICILLIN 4.1 Đặc điểm chung Công nghệ lên men sản xuất penicillin mang nét đặc thù riêng của từng cơ sở sản xuất và các thông tin này rất hạn chế cung cấp công khai,... không khí nóng đến dạng sản phẩm bột muối penicillin Sản phẩm này, một phần được sử dụng trực tiếp để pha chế thuốc kháng sinh penicillin; còn GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 22 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT lại, phần lớn được sử dụng làm nguyên liệu phục vụ cho vi c sản xuất các sản phẩm penicillin và cephalosporin bán tổng hợp khác Ngoài ra, để sản xuất ra các sản phẩm penicillin có độ tinh... penicillin tự nhiên − Sản xuất các penicillin bán tổng hợp (từ nguyên liệu penicillin tự nhiên) − Pha chế các loại thuốc kháng sinh penicillin thương mại Hình 4.1 Sơ đồ dây chuyền sản xuất penicillin (theo Gist-Brocades Copr (Hà Lan)) 4.2 Qui trình lên men GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 17 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT BÀO TỬ/HỆ SỢI BÌNH LẮC BỂ NHÂN GIỐNG NỒI LÊN MEN Sinh khối DỊCH LỌC TỦA...CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 11 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT 3.6 Tác động của các thông số công nghệ đến quá trình lên men 3.6.1 Sự phát triển hệ sợi và đặc điểm hình thái hệ sợi nấm: Sự phát triển hệ sợi nấm trong quá... Trang 25 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT 3 Mekopen-1000000 IU Chỉ định: Trị liệu đặc biệt các bệnh do liên cầu khuẩn A, vi m họng, chốc nở, vi m tai giữa… Điều trị dự phòng thấp khớp cấp, vi m nang màng trong tim, vi m nang màng não tuỷ 4 Unasyn Chỉ định: Nhiễm khuẩn đường hô hấp trên gồm vi m xoang, vi m tai giữa và vi m amidan .Vi m đường hô hấp dưới gồm vi m phổi và phế quản do vi khuẩn... quá trình lên men Năng lực sinh tổng hợp và tích tụ penicillin trong dịch lên men là kết quả của mối tương tác đồng thời của hàng loạt yếu tố công nghệ như: hoạt tính sinh tổng hợp GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 19 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT của chúng, công nghệ lên men áp dụng, chất lượng nguyên liệu, đặc tính thiết bị và năng lực đáp ứng các yêu cầu công nghệ của thiết bị, chế độ giám... Leptospirae, giang mai… TÀI LIỆU THAM KHẢO GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 26 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT [1] Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men các chất kháng sinh, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 2005 [2] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Tỵ, Vi sinh vật học, Nhà xuất bản giáo dục1997 [3] Bài giảng về kháng sinh, trường Đại học Dược Hà Nội [4] Erick j Vandamme, Marcel Dekker,... Lượng Trang 23 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT được triển khai phổ biến trong thực tiễn sản xuất công nghiệp Đồng thời, cũng nhờ ưu thế trên, phương pháp enzym được hoàn thiện liên tục và ngày nay đã đạt được ưu thế vượt trội so với phương pháp hóa học 5.2 Sản xuất axit 7- deminodeaxetoxy-cephalosporin (7-ADCA) và sản xuất cephalosporin bán tổng hợp Cephalosporin là họ chất kháng sinh thuộc... không làm suy giảm năng lực lên men của chủng sản xuất GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 14 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT Bảng 3.1 : Thành phần môi trường lên men cơ bản để lên men sản xuất penicillin 3.6.4 Điều kiện tiến hành lên men: Nhiệt độ là thông số có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của nấm mốc, khả năng sinh tổng hợp và năng lực tích tụ penicillin của chúng Nhìn chung nấm mốc phát... những công đoạn nhất định; vì vậy rất khó đưa ra được công nghệ tổng quát chung Theo công nghệ lên men của hãng Gist-Brocades (Hà Lan), toàn bộ dây chuyển sản xuất thuốc kháng sinh penicillin có thể phân chia làm bốn công đoạn chính như sau (xem sơ đồ hình 2.8) − Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thường thu penicillin V hoặc penicillin G) − Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm penicillin ... CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT Hình 3.8 Sơ đồ chế sinh tổng hợp valin 3.5 Kỹ thuật lên men chìm GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang 10 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT GVHD:... giết vi khuẩn hạn chế sinh trưởng chúng Hình 3.1: Sản phẩm penicillin lên men tự nhiên nhờ P.chrysogenum GVHD: Nguyễn Đức Lượng Trang CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT 3.2 Cơ sở công nghệ. ..CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT biến chủng công nghiệp có lực "siêu tổng hợp" chất kháng sinh cao gấp hàng ngàn vạn lần chủng ban đầu Triển khai thành công công nghệ lên