KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH ENZYME UREASE TRÊN ALGINATE, PARAFFIN VÀ LAC MÔN: KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH ENZYME VÀ TẾ BÀO NGÀY BÁO CÁO: T7 11/05/2013 – P.303 B6 HỌC VIÊN THỰC HIỆN: 1/ BÙI THỊ THU THẢO 12310751 2/ NGUYỄN TẤN ĐỨC 12310726 TỔNG QUAN Hiện nay, enzyme urease (u-rê-a) ứng dụng nhiều lĩnh vực quan trọng như: + Nông nghiệp: xúc tác trình thủy phân urea (u-rê) thành NH3, cung cấp đạm cho trồng + Môi trường: phân tích hàm lượng kim loại chất thải rắn nước + Thực phẩm: dùng để phát tồn urea thịt, cá, nước giải khát, sản phẩm lên men sản phẩm từ sữa + Cảm biến sinh học: dùng làm điện cực urease để xác định hàm lượng urea dòng liên tục Để tăng hiệu sử dụng enzyme urease, người ta nghiên cứu cố định enzyme nhằm: + tăng tính bền nhiệt + tăng phổ hoạt động pH rộng + tăng thời gian bảo quản + tăng khả tái sử dụng TỔNG QUAN + Enzyme urease có tên đầy đủ: carbamine amidohydrolase, enzyme xúc tác trình thủy phân urea thành ammonia khí carbonic + Bình thường urease tồn dạng tinh thể cạnh, suốt không màu, khối lượng phân tử 420 - 540 kDa + Urease enzyme có cấu trúc protein bậc 4, phân tử có từ – tâm hoạt động Trong tâm hoạt động có diện liên kết –SH ion Ni2+ với vai trò tạo liên kết enzyme chất giai đoạn tạo phức chất trung gian, cofactor urease Một số liên kết cộng hóa trị giữa urease và chất mang: + Titanium (IV) chloride + Silica === Urease + Chitosan + glutaraldehyde === Urease + Sợi tổng hợp: acrylamide + ethylene terephthalate, hoạt hóa glutaraldehyde === Urease + Polymethylglutamate (PMG) === Urease TỔNG QUAN Các loại chất mang dùng để cố định urease: + PVC + Cellulose + Alginate + Vỏ loại hạt (đậu phộng) hình ảnh tương ứng + Paraffin wax (sáp) + Lac film: một loại nhựa côn trùng tiết Sau cố định vào chất mang, người ta khảo sát tiêu sau để đánh giá hiệu cố định: + Hiệu suất cố định (tỷ lệ hoạt tính urease tự dung dịch với urease cố định chất mang) + Khả tái sử dụng + Độ ổn định hoạt tính thời gian bảo quản + Mức độ thay đổi hệ số phản ứng xúc tác trước sau cố định + Độ bền chất mang sau lần phản ứng GIỚI THIỆU NGHIÊN CỨU + Bài báo: “Cố định enzyme urease alginate, paraffin lac” - Kespi pithawala cộng sự, Ấn Độ, 2009 + Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát thay đổi hoạt tính urease cố định loại chất mang trên, để tìm chất mang phù hợp với urease Enzyme urease thu nhận từ đậu jackbean được cố định lên alginate, paraffin và lac với matrix là vải muslin, so sánh với enzyme tự VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Các loại vật liệu chính: + Enzyme urease thu nhận từ đậu Jackbean + Cơ chất urea mua từ hãng Loba Chem, Ấn Độ + Sodium alginate, thuốc thử Nessler, tris buffer (0,2 M) và những hóa chất khác đều đạt chuẩn phân tích + Paraffin wax (sáp), nhiệt độ nóng chảy 58-60oC mua của hãng Ranbaxy + Lac thu nhận từ nhựa sâu cánh kiến bồ kết Albizzia lebbeck, được tinh sạch và trích ly bằng methanol Cố định urease vào paraffin và lac đều sử dụng thêm vải cotton (muslin cloth) để làm matrix tăng độ bám VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Phương pháp cố định urease vào hạt gel calcium alginate: + Hòa tan 200 mg sodium alginate với 10 mg urease 10 ml nước, trộn đều đến dung dịch sánh lại + Tạo gel bằng cách nhỏ giọt vào dung dịch CaCl2 (2% w/v), khuấy nhẹ nhàng hạt gel 20 phút, sau đó loại bỏ dung dịch, rửa gel bằng buffer Phương pháp cố định urease vào màng sáp paraffin: + Làm nóng chảy g paraffin wax ở bể ổn nhiệt 65oC, hòa tan g bột enzyme vào hỗn hợp trên, khuấy đều ở tốc độ thấp + Vải muslin được rửa sạch bằng nước cất, phơi khô dưới nắng mặt trời, cắt nhỏ thành từ miếng cm2 rồi cho vào dịch sáp paraffin để hấp phụ enzyme vào mạng lưới cotton bên + Sau đến giây ta dùng kẹp gắp những miếng vải này ra, lắc nhẹ nhàng để dịch sáp bên ngoài rơi xuống, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng + Như vậy enzyme đã được cố định vào vải với sự kết dính bởi sáp paraffin VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Thànlàh gì Lac phầ : n lac: + Lac Nhựa là 4%: một Gồm loại nhự nhựa a sinh mềm họtan c đượ c tạether o bở (25%) i nhữvà ngnhựa sâu cứng cákhông nh kiếntan cái khôngether di chuyể (75%) n cóNhựa tên khoa hỗn họchợp Laccifier poliester lacca nhằ dẫn mchất bảo vệ chú cácngacid khỏbéo i tác độnnhóm có g củaOH điềuvàkiệ n bấ acid t lợhữ i củuacơ môi trường xung quanh -+ Chất Con sâu màucá (2-3%): nh kiếnGồm này sốngchất ở nhiề đỏ u tan loạtrong i cây,nước tronglàđóphức có hợpbồcủa kếtnhiều + Rệp loại acid son laccaic, cánh kiến chấtlàmàu mộtvàng côn trùng khôngrất tannhỏ, dàinước, vào khoảng erytrolaccin 0,6-0,7mm, (1, 2, 5,rộng 0,3 tetrahydroxy-4-methylantraquinon) đến 0,35 mm hình trông giống thuyền nhỏ, đầu có râu, miệng có vòi -nhỏ Sápđể(6,6%): hút nhựa Trong Con đócái phần mớitan sản xuấtcồn nhựa nóng cánh chiếmkiến 80% (lac), phần đực tan tạo nhựa benzen chiếm tổ nhỏ 20% Các mỏng muối, Tổ nhựa đườngcủa (glucose, đựcarabinose, hình thoi, fructose) tổ -nhựa Tạp chất: Xáccái sâu hình kiến, tròn đất, cát VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Phương pháp thu nhận lac: + Lac được lấy từ những cành bị sâu cánh kiến bám vào, tạo tổ Cắt nhuyễn các cành này, nung lên rồi lọc qua vải lấy dịch Hỗn hợp sau đó được hòa tan methanol, giữ ngày + Ly tâm dịch này ở tốc độ cao 20 phút để loại cặn Ta lấy phần dịch cho vào chén sứ rồi cho bay methanol ngày Phần cặn còn lại chính là tinh thể lac được dùng cho thí nghiệm Phương pháp cố định urease vào lac: + Cân g lac hòa tan ml methanol Bổ sung g bột urease vào hỗn hợp rồi khuấy đều Cắt vải muslin ở phần cố định với paraffin, cho vào hỗn hợp để hấp phụ dịch enzyme + Để biết lượng enzyme hấp phụ được vải muslin tẩm lac này là thì ta sẽ rửa sạch enzyme này ra, đo dịch thu được bằng phương pháp Lowry với thuốc thử BSA để xác định hàm lượng protein được cố định VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Phương pháp đo hoạt tính urease tự do: + Để đo hoạt tính urease thì ta sẽ đo lượng ammonia tạo thành ở điều kiện ủ enzyme này với chất một khoảng thời gian nhất định Dùng thuốc thử Nessler để phản ứng màu, đo OD + Một đơn vị hoạt tính urease được định nghĩa là mol ammonia tạo thành phút từ 0,1 M urea ở điều kiện tiêu chuẩn Phương pháp đo hoạt tính urease cố định: + Gel alginate: + ta NH3 cân khoả ng 17 hạt cho(NH2)Hg-O-HgI vào ml dung dịch phosphate 2(2KIHgI2) + 3KOH + 7KI + 2H2O buufer 0,2 M ở pH 7, hỗn hợp này sẽ phản ứng với 1ml dung dịch urea 3% 15 phút Sau đó lấy hạt gel ra, làm lạnh dung dịch rồi cho H2SO4 vào để dừng phản ứng Lúc này đo ammonia dung dịch theo phương pháp + Màng paraffin wax và màng lac cũng được làm tương tự với gel alginate, cho phản ứng 30 phút Quy trình được lặp lại tương tự Tất cả thí nghiệm được lặp lại lần để đảm bảo tính ổn định của số liệu VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Phương pháp khảo sát cách thức bảo quản: + Enzyme cố định được giữ ở nhiệt độ phòng Hoạt tính theo dõi tháng, so sánh với hoạt tính enzyme cố định ở thời điểm mới tạo thành để xác định hiệu suất hoạt tính xem còn lại + Riêng enzyme cố định màng paraffin được khảo sát thêm nghiệm thức là: bảo quản buffer, nước cất và ở điều kiện khô + Enzyme được cố định alginate được bảo quản dung dịch CaCl2 hạt gel ướt sẽ bền hạt gel khô Phương pháp khảo sát nhiệt độ phản ứng thích hợp: + Enzyme tự và enzyme cố định được ngâm phosphate buffer 0,2 M pH 7, và ủ ở nhiệt độ 30 đến 80oC 30 phút để xác định hoạt tính VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Phương pháp xác định các thông số động học: + Để xác định các thông số động học, nồng độ chất được thay đổi và giá trị pH tối ưu của enzyme tự và enzyme cố định được xác định dựa vào sự thay đổi các giá trị pH của dung dịch đệm + Hoạt tính tương đối của enzyme ở từng mức pH khác được xác định bằng phản ứng với thuốc thử Nessler Tốc độ phản ứng được đo bằng mmole ammonia sản xuất một phút một mg enzyme + Giá trị Kmax và Vmax xác định dựa giản đồ Lineweaver-Burke KẾT QUẢ THỰC HIỆN Hoạt tính enzyme thay đổi theo thời gian bảo quản 1: Màng paraffin khô 2: Màng paraffin buffer 3: Màng paraffin nước cất 4: Enzyme tự 5: Ca-alginate 6: Lac film KẾT QUẢ THỰC HIỆN Hoạt tính enzyme thay đổi theo số lần tái sử dụng 1: Ca-alginate 2: Màng paraffin khô 3: Lac film KẾT QUẢ THỰC HIỆN Hoạt tính enzyme nhiệt độ khác 1: Enzyme tự 2: Ca-alginate 3: Lac film KẾT QUẢ THỰC HIỆN Hoạt tính enzyme pH khác nhau: 1: Enzyme tự 2: Ca-alginate 3: Paraffin wax 4: Lac film KẾT QUẢ THỰC HIỆN Tương quan tốc độ giải phóng NH3 nồng độ chất: 1: Paraffin wax 2: Enzyme tự 3: Ca-alginate 4: Lac film KẾT LUẬN + Enzyme cố định thể hiện hoạt tính tốt enzyme tự + Sau nhiều lần tái sử dụng, hạt gel alginate chuyển sang màu nâu và dễ bị phân hủy, đó thời gian bảo quản kém cố định paraffin và lac + Màng paraffin dạng khô cố định enzyme bảo quản tốt dạng ướt, màng trở nên dẻo và protein ít bị rửa trôi + Màng lac có đặc tính học dai màng paraffin, đó sẽ bền các điều kiện phản ứng + Tốc độ phản ứng Kmax với chất ở alginate và lac tỏ thấp so với paraffin, đó paraffin thì thấp so với enzyme tự Nguyên nhân là cố định alginate ta dùng CaCl2 và lac ta dùng methanol đã ức chế tâm hoạt động của urease Trong đó cố định paraffin thì trung tâm hoạt động giảm khả gắn với chất Qua đề tài này, ta rút được những điều sau: + Khảo sát hiệu quả cố định của enzyme và chất cần theo các bước trên, từ chất đến lựa chọn phương pháp cố định + Sau khảo sát sẽ đánh giá hiệu quả hoạt tính cố định + Ghi nhận các giá trị thu được để làm tiền đề cho các thí nghiệm tiếp theo liên quan đến enzyme đó XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN [...]... Màng paraffin trong nước cất 4: Enzyme tự do 5: Ca-alginate 6: Lac film KẾT QUẢ THỰC HIỆN 1 3 2 Hoạt tính enzyme thay đổi theo số lần tái sử dụng 1: Ca-alginate 2: Màng paraffin khô 3: Lac film KẾT QUẢ THỰC HIỆN 2 3 1 Hoạt tính enzyme ở nhiệt độ khác nhau 1: Enzyme tự do 2: Ca-alginate 3: Lac film KẾT QUẢ THỰC HIỆN 1 2 3 4 Hoạt tính enzyme ở pH khác nhau: 1: Enzyme tự do 2: Ca-alginate 3: Paraffin. .. 4: Lac film KẾT QUẢ THỰC HIỆN 1 2 3 4 Tương quan giữa tốc độ giải phóng NH3 và nồng độ cơ chất: 1: Paraffin wax 2: Enzyme tự do 3: Ca-alginate 4: Lac film KẾT LUẬN + Enzyme cố định thể hiện hoạt tính tốt hơn enzyme tự do + Sau nhiều lần tái sử dụng, hạt gel alginate chuyển sang màu nâu và dễ bị phân hủy, do đó thời gian bảo quản kém hơn cố định trên paraffin và lac. .. của enzyme ở từng mức pH khác nhau được xác định bằng phản ứng với thuốc thử Nessler như trên Tốc độ phản ứng được đo bằng mmole ammonia sản xuất ra trên một phút trên một mg enzyme + Giá trị Kmax và Vmax xác định dựa trên giản đồ Lineweaver-Burke KẾT QUẢ THỰC HIỆN 6 1 2 3 5 4 Hoạt tính enzyme thay đổi theo thời gian bảo quản 1: Màng paraffin khô 2: Màng paraffin. .. lac + Màng paraffin dạng khô cố định enzyme bảo quản tốt hơn dạng ướt, màng trở nên dẻo hơn và protein ít bị rửa trôi + Màng lac có đặc tính cơ học dai hơn màng paraffin, do đó sẽ bền hơn trong các điều kiện phản ứng + Tốc độ phản ứng Kmax với cơ chất ở alginate và lac tỏ ra thấp hơn so với paraffin, trong khi đó paraffin thì thấp hơn so với enzyme tự do... Nguyên nhân là khi cố định trên alginate ta dùng CaCl2 và trên lac ta dùng methanol đã ức chế trong tâm hoạt động của urease Trong khi đó cố định trên paraffin thì trung tâm hoạt động giảm khả năng gắn với cơ chất Qua đề tài này, ta rút ra được những điều sau: + Khảo sát hiệu quả cố định của enzyme và cơ chất cần theo các bước như trên, đi từ cơ chất đến lựa... bảo quản: + Enzyme cố định được giữ ở nhiệt độ phòng Hoạt tính theo dõi trong 1 tháng, so sánh với hoạt tính enzyme cố định ở thời điểm mới tạo thành để xác định hiệu suất hoạt tính xem còn lại bao nhiêu + Riêng enzyme cố định trên màng paraffin được khảo sát thêm 3 nghiệm thức là: bảo quản trong buffer, trong nước cất và ở điều kiện khô + Enzyme được... ứng thích hợp: + Enzyme tự do và enzyme cố định được ngâm trong phosphate buffer 0,2 M pH 7, và ủ ở nhiệt độ 30 đến 80oC trong 30 phút để xác định hoạt tính VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Phương pháp xác định các thông số động học: + Để xác định các thông số động học, nồng độ cơ chất được thay đổi và giá trị pH tối ưu của enzyme tự do và enzyme cố định được... chọn phương pháp cố định + Sau khi khảo sát sẽ đánh giá hiệu quả hoạt tính cố định + Ghi nhận các giá trị thu được để làm tiền đề cho các thí nghiệm tiếp theo liên quan đến enzyme đó XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN ... Bài báo: Cố định enzyme urease alginate, paraffin lac - Kespi pithawala cộng sự, Ấn Độ, 2009 + Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát thay đổi hoạt tính urease cố định loại chất mang trên, để tìm... (sáp) + Lac film: một loại nhựa côn trùng tiết Sau cố định vào chất mang, người ta khảo sát tiêu sau để đánh giá hiệu cố định: + Hiệu suất cố định (tỷ lệ hoạt tính urease tự dung dịch với urease. .. + Cảm biến sinh học: dùng làm điện cực urease để xác định hàm lượng urea dòng liên tục Để tăng hiệu sử dụng enzyme urease, người ta nghiên cứu cố định enzyme nhằm: + tăng tính bền nhiệt + tăng