Tuyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất bị nhiễm quặng ở khu vực Trại Cau - Đồng Hỷ - Thái Nguyên

Tìm ra thuốc để chữa bệnh cho người, từ lâu đã là mơ ước của nhân loại. MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Tìm ra thuốc để chữa bệnh cho người, từ lâu đã là mơ ước của nhân loại. Năm 1928, A. Fleming phát hiện ra Penicillin - một chất kháng sinh (CKS) có nguồn gốc từ nấm Penicillium. Nhưng phải hơn 10 năm sau, vào năm 1940, một nhóm các nhà khoa học mới tách chiết thành công được Penicillin. Kể từ đó, Penicillin mới chính thức được dùng để chữa bệnh cho người. Đây là một trong những thành tựu vĩ đại nhất của nhân loại trong thế kỷ XX. Sự ra đời của CKS có vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực sản xuất và đời sống. Trong y học, CKS được sử dụng để phòng và chữa bệnh cho người. Trong chăn nuôi, CKS được sử dụng để chữa bệnh và tăng trọng cho vật nuôi. Trong nông nghiệp, CKS được sử dụng để thay thế thuốc hóa học và dùng làm chất kích thích sinh trưởng. Ngoài ra, CKS còn được sử dụng để bảo quản thực phẩm…[1]. Tuy nhiên, việc sử dụng các CKS không hợp lý đã dẫn đến sự xuất hiện ngày càng nhiều các VSV gây bệnh có khả năng kháng lại các thuốc kháng sinh hiện có, đặc biệt là nhiều loài VSV có khả năng kháng chéo nhiều CKS có cấu trúc tương tự nhau. Do đó việc tìm ra những CKS mới, nhất là các CKS có cấu trúc hóa học tự nhiên do chính VSV tiết ra cần được quan tâm nhiều hơn. Hàng năm có khoảng vài trăm CKS mới được phát hiện và cho đến nay, người ta đã phát hiện khoảng 17000 CKS có nguồn gốc VSV, hơn 30000 CKS bán tổng hợp, nhưng trong số các CKS này chỉ có 1 - 2% là được sử dụng trong y học [15, 21]. Trong số các VSV có khả năng sinh CKS thì xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng hàng đầu, chiếm 80% các CKS được mô tả [18]. XK là nhóm sinh vật nhân sơ (Prokaryote) với số lượng loài lớn và phân bố ở nhiều vùng sinh thái khác nhau trên thế giới. Nhóm VSV này được biết đến với nhiều ứng dụng thực tế thông qua việc tạo ra các sản phẩm trao đổi thứ cấp có giá trị sử dụng cao như các enzym thủy phân hợp chất cao phân tử, chất kháng sinh và nhiều hợp chất y dược khác. 1 Thái Nguyên là một tỉnh rất giàu tiềm năng về nông, lâm, ngư nghiệp nên có khu hệ VSV khá phong phú. Đồng thời, Thái Nguyên cũng nằm trong vùng sinh khoáng, có nhiều loại hình khoáng sản phân bố tập trung. Các hoạt động khai thác khoáng sản đã có những tác động đáng kể đến môi trường đất và qua đó chắc chắn sẽ có ảnh hưởng đến hệ VSV đất ở những khu vực này mà hiện vẫn chưa được nghiên cứu. Xuất phát từ những yêu cầu thực tế trên, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay và cũng như để góp phần khai thác nguồn VSV vô cùng phong phú của Thái Nguyên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Tuyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất bị nhiễm quặng ở khu vực Trại Cau - Đồng Hỷ - Thái Nguyên”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế. - Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzym ngoại bào. 3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập và thuần khiết XK từ các mẫu đất. - Kiểm tra HTKS của các chủng XK đã phân lập được với các VSVKĐ để tuyển chọn ra các chủng có HTKS cao. - Kiểm tra khả năng sinh enzym ngoại bào để chọn ra các chủng có hoạt tính enzym cao. - Xác định khả năng chịu nhiệt của dịch enzym. 2 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn 1.1.1. Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên Theo hệ thống phân loại hiện nay, XK thuộc ngành Tenericutes (gồm vi khuẩn G (+) và XK), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) và siêu giới nhân sơ (Prokaryota) [32]. Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài trong đó có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại được xếp vào nhóm XK hiếm [11, 36]. Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể tìm thấy trong hầu hết các môi trường: đất, nước, không khí, thậm chí cả những môi trường mà cả vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. XK phân bố nhiều nhất ở trong đất, và đóng vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Chúng sử dụng acid humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong đất [36]. Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm XK, chiếm 9 - 45% tổng số VSV [34]. Sự phân bố của XK phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật. Sự phân bố của XK còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5. XK có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng XK trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm. Một trong những đặc tính quan trọng nhất của XK là khả năng hình thành chất kháng sinh, 60 - 70% XK được phân lập từ đất có khả năng sinh CKS [15]. Ngoài ra, XK tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp chất trong đất, nước. Dùng để sản xuất nhiều enzym như proteaza, amylaza, cellulaza… một số axit amin và axit hữu cơ. Một số XK có thể gây bệnh cho người, động vật [8]. 3 1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn * Cấu tạo tế bào xạ khuẩn Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn G (+), toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập. Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng dày khoảng 60 ÷ 120A 0 , khi già có thể đạt tới 150 ÷ 200A 0 , lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50A 0 , lớp trong dày khoảng 50A 0 . Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N - axetyl glucozamin liên kết với N - axetyl muramic bởi các liên kết 1,4 - β glucozit. Thành tế bào XK không chứa cellulose và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào. Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào XK được chia thành 4 nhóm chính [5, 9]. Bao gồm: Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic (L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này. Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic (meso - ADP) và glyxin. Thuộc nhóm này gồm các giống: Micromonospora, Actinoplanes, Ampullarriella… Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -diaminopimelic. Thuộc nhóm này có các giống: Dermatophilus, Geodermatophilus, Frankia… Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -diaminopimelic, arabinose và galactose. Thuộc nhóm này gồm các giống: Mycobacterium, Nocardia, Pseudonocardia…[10]. Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của XK. 4 Tế bào chất của XK có chứa mezoxom, thể nhân, và các vật thể ẩn nhập gồm các hạt poliphotphat và polixacarit. Nhân của tế bào XK không có cấu trúc điển hình, chỉ là những nhiễm sắc thể không có màng. Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có 1 nhiễm sắc thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty [25]. * Khuẩn lạc, khuẩn ty xạ khuẩn Xạ khuẩn có hệ sợi rất phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ sợi XK có đường kính thay đổi trong khoảng 0,2 ÷ 1 µm đến 2 ÷ 3 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [11]. XK phát triển theo kiểu mọc chồi, phân nhánh theo kiểu 30 µm một nhánh. Độ dài khuẩn ty XK trong giai đoạn phát triển là 11µm [35]. Khuẩn ty XK bắt màu gram dương, hiếu khí, hoại sinh, không hình thành nha bào, không có lông và giáp mô, đa hình thái như dạng hình chùy, dạng phân nhánh hay dạng sợi dài, dạng phân nhánh thành chùm, thành bó gọi là khuẩn ty thể (mycelium). Kích thước và khối lượng khuẩn ty thường không ổn định và phụ thuộc vào từng loại điều kiện nuôi cấy [31]. Hệ sợi của XK có màu sắc rất đa dạng: xanh, đỏ, trắng, vàng, lục, lam, tím, hồng… Các khuẩn ty non và các khuẩn ty có mang bào tử thường lớn hơn các khuẩn ty già và khuẩn ty không mang bào tử. Các loài XK khác nhau đều có cùng một kiểu cấu tạo hệ sợi, chỉ khác nhau ở chỗ có loài có hệ sợi dài, thẳng hay làn sóng hoặc rất ít phân nhánh, có loài lại có hệ sợi ngắn, thường phân nhánh, thẳng hoặc xoắn. Khi nuôi cấy trên môi trường đặc khuẩn ty của XK phát triển thành 2 loại. Một loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất - substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh - aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản [28]. Một số XK không có sợi khí sinh mà chỉ có sợi cơ chất, làm cho bề mặt XK nhẵn và khó tách ra khi cấy truyền. Loại chỉ có sợi khí sinh thì ngược lại, rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc khỏi môi trường [25]. 5 Hệ sợi của XK phát triển rất mạnh tạo thành các khuẩn lạc. Hình thái của khuẩn lạc XK rất khác nhau, kích thước và hình dạng của chúng có thể thay đổi phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy như: thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Khuẩn lạc thường có đường kính 0,5 ÷ 2 mm, nhưng cũng có khuẩn lạc có đường kính đạt tới 1 cm hoặc lớn hơn nữa. Khuẩn lạc XK thường rắn chắc, không trơn ướt như của vi khuẩn hay nấm men mà thường có dạng thô ráp, không trong suốt, xù xì, có dạng vôi, dạng nhung tơ hay màng dẻo… với nhiều màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, trắng, xanh… [8], có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ và bám sâu vào thạch. Khuẩn lạc thường có cấu tạo 3 lớp: lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như CKS, độc tố, enzym… có thể được tích lũy trong sinh khối tế bào XK hay được tiết ra môi trường lên men. Hệ sợi cơ chất có thể tiết vào môi trường các loại sắc tố, thường có màu xanh, tím, hồng, nâu, đen… có sắc tố chỉ tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ [38]. * Bào tử của xạ khuẩn Bào tử XK được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh (gọi là cuống sinh bào tử). Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho XK. Trên mỗi cuống sinh bào tử mang từ 30 ÷ 100 bào tử, đôi khi có thể mang tới 200 bào tử, nhưng cũng có khi chỉ mang một bào tử hoặc hai bào tử. Sự hình thành bào tử ở XK có thể xảy ra do sự kết đoạn (fragmenlation) hoặc do sự cắt khúc (segmentation) của cuống sinh bào tử. Bào tử XK có nhiều hình dạng khác nhau, thường có hình trụ, ovan, hình cầu, hình que với kích thước trung bình khoảng 0,7 ÷ 0,9 × 0,7 ÷ 1,9 µm. Kích thước của bào tử thay đổi khác nhau tùy loài, tùy cá thể trong loài thậm chí ngay trên cùng một chuỗi bào tử. Bề mặt bào tử XK có thể nhẵn (Sm - Smooth), có gai (Sp - Spiny), khối u (Wa - Warty), nếp nhăn (Ru - Rugose) hay dạng tóc Ha - Hair like [10]. Bào tử XK được bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 ÷ 400A 0 gồm có 3 lớp, các lớp này giúp cho bào tử 6 tránh được những ảnh hưởng bất lợi của ngoại cảnh như: nhiệt độ, độ ẩm, pH… Hình dạng, kích thước của chuỗi bào tử và cấu trúc màng có thể thay đổi khi nuôi cấy trên những môi trường có nguồn nitơ khác nhau [14]. * Đặc điểm sinh lý, sinh hóa XK thuộc nhóm sinh vật dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, axit hữu cơ, lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacbon, muối nitrat, muối amôn, urê, amino axit, pepton để làm nguồn nitơ. Tuy nhiên khả năng hấp thụ các chất này không giống nhau ở các loài hay các chủng khác nhau. Phần lớn XK là nhóm VSV hiếu khí, ưa ẩm, một số ít ưa nhiệt, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng là 25 - 30 0 C. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp CKS thường chỉ nằm trong khoảng 18 - 28 0 C. Độ ẩm thích hợp đối với XK dao động trong khoảng 40 - 50%, giới hạn pH trong khoảng 6,8 - 7,5. XK không có giới tính [28]. XK có khả năng hình thành enzym và các CKS nên được ứng dụng vào trong nhiều lĩnh vực của đời sống. 1.2. Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của XK là khả năng hình thành CKS. Trong số 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc từ XK [5]. Một trong những tính chất của các CKS có nguồn gốc từ VSV nói chung và từ XK nói riêng là có tác dụng chọn lọc. Mỗi CKS chỉ có tác dụng với một nhóm VSV nhất định. Hầu hết CKS có nguồn gốc XK đều có phổ kháng khuẩn rộng. Khả năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc điểm quan trọng để phân loại XK. Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS, nhưng có hai giả thuyết được ủng hộ hơn cả là: - Việc tổng hợp CKS nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh có lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay kìm hãm được sự phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái cục bộ đó. 7 - Việc tổng hợp CKS là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho khả năng sống sót cao của chủng sinh ra CKS trong tự nhiên, nhất là các loài có bào tử [2]. Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định. - CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp duy nhất như chloramphenicol, các kháng sinh thuộc nhóm nucleoside. - CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một khác nhau như lincomycin, novobiocin. - CKS được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất trao đổi bậc một, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác. Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau. Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài các gen chịu trách nhiệm tổng hợp CKS, còn có cả các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và cofactor [15]. 1.3. Phương pháp phân loại xạ khuẩn 1.3.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống Cũng như đối với vi khuẩn, việc phân loại xạ khuẩn hiện nay chủ yếu dựa vào phân tích trình tự gen mã hóa cho 16S rRNA. Bên cạnh đó các đặc điểm về hóa phân loại, hình thái, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa thường được kết hợp để định danh xạ khuẩn một cách chính xác đến tên loài. Trong các đặc điểm hóa phân loại, thành phần hóa học của thành tế bào được coi là đặc điểm quan trọng nhất. Các đặc điểm hóa phân loại khác như thành phần đường, menaquinone, photpholipit, axit béo của tế bào và tỷ lệ GC trong ADN genom cũng mang tính đặc trưng cho loài và có ý nghĩa quan trọng trong phân loại xạ khuẩn. Các đặc điểm sinh lý, sinh hoá thường được kết hợp sử dụng trong phân loại xạ khuẩn là khả năng đồng hoá các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu 8 các chất kích thích sinh trưởng, khả năng phân hủy các chất khác nhau nhờ hệ thống enzym. Bên cạnh đó, các chỉ tiêu khác như mối quan hệ với pH, nhiệt độ, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với CKS, khả năng tạo thành CKS và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của XK cũng được tiến hành phân tích đồng thời [10]. 1.3.2. Phân loại theo phương pháp hiện đại Các nhà khoa học trên thế giới đều cho rằng mức độ tương đồng về trình tự rRNA phản ánh mối quan hệ tiến hóa giữa các cá thể VSV. Tất cả các loài VSV trong sinh giới đều sử dụng cùng một cách tổng hợp protein nhờ các riboxom. Vì vậy người ta đã tiến hành so sánh trình tự nucleotit của gen mã hoá rRNA ở các VSV khác nhau để xác định mối quan hệ giữa chúng. rRNA là phân tử lý tưởng cho các nghiên cứu về tiến hoá của VSV vì: - Phân tử này có mặt trong mọi tế bào VSV. - Thực hiện cùng một chức năng là cấu thành nên riboxom, bộ máy tổng hợp protein của tế bào. - Có kích thước vừa phải (1500 bp) để tiến hành các nghiên cứu phả hệ. - Là một trong những cao phân tử xuất hiện sớm nhất trong lịch sử tiến hóa. Cấu trúc của rRNA thay đổi rất chậm theo thời gian, hay nói cách khác các gen mã hoá cho chúng được bảo tồn rất tốt trong quá trình tiến hoá. Mặc dù mang tính bảo thủ cao, các gen mã hoá cho rRNA cũng chứa những vùng có mức độ bảo thủ thấp hơn, dễ có sự sai khác giữa các loài sinh vật khác nhau. Dựa vào những vùng bảo thủ trong gen mã hoá cho rRNA, các nhà khoa học đã thiết kế các cặp mồi vạn năng để có thể khuếch đại toàn bộ chiều dài của gen, bao gồm cả các vùng biến đổi. So sánh sự khác biệt giữa các vùng này, người ta có thể chỉ ra được những sự khác biệt giữa các loài gần gũi [26]. Hiện nay phân loại XK cũng như vi khuẩn nói chung được tiến hành dựa trên so sánh trình tự gen mã hóa cho phân tử 16S rRNA kết hợp với các 9 đặc điểm khác theo phân loại cổ truyền. Các nhà phân loại học thường lấy ngưỡng 98% trong độ tương đồng về trình tự 16S rRNA để phân biệt hai loài khác nhau. Bên cạnh đó, phép lai ADN genom cũng thường được tiến hành như một thí nghiệm bổ sung để khẳng định vị trí phân loại tới mức độ loài. Hai chủng XK (hay vi khuẩn nói chung) được coi là hai loài riêng biệt nếu chúng có độ tương đồng về ADN genom thấp hơn 70%. Dựa trên mức độ tương đồng về trình tự 16S rRNA người ta có thể dựng cây phát sinh chủng loại (cây phả hệ) thể hiện mối tương quan của các loài đang nghiên cứu với các loài có họ hàng gần và tổ tiên của chúng. Trong đa số trường hợp, các phân tích về hóa phân loại và sinh lý, sinh hóa có sự tương đồng cao so với phân loại theo trình tự 16S rRNA [27]. 1.4. Ứng dụng của chất kháng sinh 1.4.1. Ứng dụng trong y học Kể từ khi CKS được sử dụng và đã cứu sống được bệnh nhân bị nhiễm trùng máu năm 1941 [21], đến nay hàng loạt CKS đã được phát hiện và ứng dụng trong y học đã đóng góp một phần không nhỏ trong công tác phòng và điều trị bệnh tật, nhất là các bệnh nhiễm khuẩn của con người. Nhờ có CKS mà y học đã làm giảm bớt mối lo cho nhân loại về căn bệnh nhiễm trùng, điều trị loại bỏ những mối nguy hiểm của một số bệnh thường gặp như thương hàn, dịch hạch, dịch tả, thấp khớp, các bệnh về răng miệng, mắt, mũi. Hiện nay các loại bệnh phổ biến do nấm gây ra như nấm da, nấm tóc, móng chân, móng tay… đều sử dụng kháng sinh để điều trị bằng cách bôi trực tiếp lên da bị nhiễm bệnh hoặc bằng cách uống. Có nhiều loại thuốc được sử dụng để điều trị bệnh này như: nystatin, natamicin, hamicin, rimocyclin… Phần lớn các CKS được sử dụng trong y học có nguồn gốc từ XK, trong đó có tới 1/3 các CKS là do XK hiếm sinh ra. Trong y học, kháng sinh có thể được dùng kết hợp cùng lúc nhiều loại kháng sinh nhằm mang lại hiệu quả cộng hợp - tăng liều gấp hai của mỗi loại kháng sinh (khi kết hợp hai kháng sinh hãm khuẩn) [21]. 10 [...]... LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Các mẫu đất được lấy ở những địa điểm khác nhau thuộc khu vực Trại Cau - Đồng Hỷ - Thái Nguyên Từ đó phân lập được 92 chủng xạ khu n 2.2 Đối tượng nghiên cứu 2.2.1 Xạ khu n 92 chủng xạ khu n được phân lập từ các loại đất khác nhau thuộc khu vực Trại Cau - Đồng Hỷ - Thái Nguyên 2.2.2 Vi sinh vật kiểm định 7 chủng VSVKĐ nhận từ Viện Bảo tàng giống... 0.5 - pH = 6,8 - 7 - KNO3 - 1 * Môi trường MPA (g/l) (môi trường nuôi vi khu n) - Cao thịt - 5 - Thạch - 20 - Pepton - 10 - Nước cất vừa đủ 1 lít - NaCl - 5 - pH = 7 -7 ,2 * Môi trường khoai tây (PDA - Potato Dextrose Agar) (g/l) (môi trường phân lập và giữ giống nấm) - Khoai tây - 200 - Nước cất vừa đủ 1 lít - Đường - 20 - pH = 7 - 7,4 - Thạch - 20 18 * Môi trường xác định hoạt tính enzym ngoại bào -. .. công thức cơ bản của toán thống kê trong đó có công thức: - Giá trị trung bình ( X ): 1 n X = ∑Xi n i =1 n - Độ lệch chuẩn ( δ ): - Sai số m: m =± δ = ∑ (X i =1 i − X )2 n −1 δ n 24 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập xạ khu n 3.1.1 Phân bố của xạ khu n ở trong đất Từ 19 mẫu đất thu từ các loại đất khác nhau thuộc khu vực Trại Cau, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 92 chủng XK thuộc chi... VTCC-B-481 3.3 Tuyển chọn xạ khu n có hoạt tính enzym 3.3.1 Hoạt tính enzym của xạ khu n Trong quá trình sinh trưởng, các enzym được hình thành trong tế bào và một số được tiết ra môi trường xung quanh Trong sản xuất enzym từ xạ khu n chủ yếu là thu nhận các enzym ngoại bào Không phải tất cả các VSV 33 đều có khả năng sinh enzym như nhau và ngay cả những chủng trong cùng một loài cũng không có hoạt tính. .. Streptomyces Số lượng và sự phân bố của XK trong đất được trình bày trên bảng 3.1 Bảng 3.1 Sự phân bố của xạ khu n từ các mẫu đất khác nhau Loại đất lấy mẫu Số Tính chất của đất lượng Thảm thực vật mẫu pH của đất Số lượng XK/g (CFU/g) Số chủng phân lập được Đất trồng chè 3 Cây chè 4.15 2 × 106 6 Đất trồng keo 6 Cây keo 4.88 6,83 × 106 22 Đất trồng màu 4 Ngô, khoai, mía 6.83 17 × 106 36 Đất trồng lúa... nhiên của nơi lấy mẫu và cách lấy mẫu đất 27 Như vậy theo kết quả trên thì không thể đưa ra một quy luật chung nào cho sự phân bố của XK theo nhóm màu Nhưng nhiều nghiên cứu về XK ở các vùng khác nhau trong cả nước đã cho thấy XK thuộc nhóm màu xám và nhóm màu trắng thường chiếm tỷ lệ cao hơn 3.2 Tuyển chọn xạ khu n có hoạt tính kháng sinh 3.2.1 Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khu n phân lập Sau... Loan) - Box cấy vô trùng Nuaire (Mỹ) - Máy đo pH 151 Martini (Nhật) - Máy ly tâm Hettich (Đức) - Máy cất nước Hamilton - Tủ lạnh - Lò vi sóng Sharp - Các dụng cụ thủy tinh của Trung Quốc, Đức, Việt Nam… 2.3.3 Môi trường nghiên cứu * Môi trường gause 1 (g/l) (môi trường phân lập xạ khu n) - Tinh bột tan - 20 - FeSO4 - 0.01 - NaCl - 0.5 - Thạch - 20 - K2HPO4 - 0.5 - Nước cất vừa đủ 1 lít - MgSO4.7H2O - 0.5... 10 Đất vườn 2 Cây ăn quả, đất rau 6.53 12 × 106 15 Đất đồi trọc 2 Bụi cỏ 4.06 1,5 × 106 3 Tổng 19 92 Từ kết quả trên bảng 3.1 cho thấy sự phân bố của xạ khu n trong các mẫu đất là khá phong phú và phụ thuộc nhiều vào đặc điểm, tính chất của từng loại đất Xạ khu n thường phân bố nhiều ở các loại đất tơi xốp, thoáng khí, giàu chất hữu cơ, có pH trung tính và độ ẩm thích hợp Số lượng XK gặp nhiều nhất ở. .. Phổ kháng sinh của các chủng XK đã phân lập Số chủng Số chủng Số chủng Số chủng Số chủng XK XK XK kháng XK kháng XK kháng có HT có HT nấm mốc cả 2 nhóm cả 3 nhóm kháng VK kháng VK VK G(+) và VSVKĐ G+ GVK G (-) Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ lượng % lượng % lượng % lượng % lượng % 30 76,92 25 64,10 31 79,49 22 56,41 17 43,60 Kết quả trên bảng 3.4 và 3.5 cho thấy các chủng XK phân lập được... loại đất trồng màu và đất vườn Đất trồng màu và đất vườn là những loại đất thường xuyên được cuốc xới, bổ sung nguồn dinh dưỡng và pH thích hợp Tất cả các đặc tính này là điều kiện rất thuận lợi cho sự phân bố 25 của XK Vì vậy, số lượng XK phân lập được từ hai loại đất này cũng nhiều nhất Kết quả này hoàn toàn phù hợp với đặc điểm sinh học của XK 3.1.2 Phân bố của xạ khu n theo nhóm màu Từ 92 chủng . tài: Tuyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khu n phân lập từ đất bị nhiễm quặng ở khu vực Trại Cau - Đồng Hỷ - Thái Nguyên .. tiêu nghiên cứu - Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khu n có hoạt tính kháng sinh có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế. - Tuyển chọn và nghiên