Đang tải... (xem toàn văn)
Sử dụng NAA để kích thích tạo rễ ở lan Hồ Điệp in vitro, các công thức môi
Đề tài nghiên cứu “Xác định nồng độ nước javel cho quá trình khử mẫu phát hoa lan hồ điệp. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP, TDZ, NAA đến quá trình sinh trưởng, phát triển của lan hồ điệp lai (Phalaenopsis sp.) in vitro” được tiến hành tại phòng di truyền và chọn giống - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam, thời gian thực hiện từ tháng 2/2009 đến tháng 7/2009. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn Đề tài nhằm theo dõi nồng độ javel thích hợp cho quá trình khử mẫu phát hoa lan hồ điệp, quá trình tạo protocorm và sự phát triển rễ của lan hồ điệp in vitro khi thay đổi nồng độ chất điều hoà sinh trưởng BAP, TDZ, NAA trong môi trường nuôi cấy. Phương pháp khử trùng mẫu cấy: Khử trùng mẫu phát hoa lan hồ điệp bằng cách thay đổi nồng độ javel (20%, 40%, 60%, 80%). Khử trùng ở nồng độ 80% cho kết quả tốt nhất. Tạo protocorm trực tiếp từ mô lá: Công thức môi trường có sự kết hợp giữa BAP và TDZ thích hợp cho quá trình tạo protocorm: MS + đường (30 g/lít )+ PVP (100 mg/lít) + NAA (1 mg/lít) + agar (8 g/lít) + TDZ (5 mg/lít) + BAP (3 mg/lít) + than hoạt tính (2 g/lít), pH = 5,8. Kích thích sự ra rễ của chồi: Sử dụng NAA để kích thích tạo rễ ở lan Hồ Điệp in vitro, các công thức môi MS + đường (30 g/lít) + nước dừa (5 ml/lít) + than hoạt tính (2 g/lít) + agar (8 g/lít) + BAP (ĐC) (0,05 mg/lít). MS + đường (30 g/lít) + nước dừa (5 ml/lít) + than hoạt tính (2 g/lít) + agar (8 g/lít) + BAP (0,05 mg/lít) + NAA (0,5 mg/lít) (cho kết quả tốt nhất). MS + đường (30 g/lít) + nước dừa (5 ml/lít)+ than hoạt tính (2 g/lít) + agar (8 g/lít )+ BAP (0,05 mg/lít ) + NAA (1 mg/lít). MS + đường (30 g/lít) + nước dừa (5 ml/lít) + than hoạt tính (2 g/lít) + agar (8 g/lít) + BAP (0,05 mg/lít) + NAA (1,5 mg/lít). Trang tựa: i LỜI CẢM TẠ . ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC . iv DANH SÁCH CÁC HÌNH . vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii Chương 1 MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu và yêu cầu . 2 1.2.1 Mục tiêu 2 1.2.2 Yêu cầu . 2 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô . 3 2.1.1 Một số kết quả tiêu biểu trong lĩnh vực nuôi cấy mô thực vật trên thế giới . 3 2.1.2 Sơ lược quá trình phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam 5 2.2 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 6 2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng . 6 2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo . 6 2.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn . 6 2.2.4 Nuôi cấy protoplast – lai protoplast 7 2.2.5 Nuôi cấy hạt phấn 7 2.3 Quy trình nhân giống in vitro 7 2.3.1 Khử trùng mẫu cấy . 7 2.3.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy 8 2.3.3 Nhân nhanh 8 2.3.4 Tạo cây hoàn chỉnh 8 2.3.5 Đưa cây ra đất 8 2.4 Những vấn đề còn tồn tại trong nhân giống cây trồng . 9 2.4.1 Tính bất định về mặt di truyền . 9 2.4.2 Sự hoại mẫu 9 2.4.3 Sử dụng thuốc kháng sinh 10 2.4.4 Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy 10 2.4.5 Hiện tượng thủy tinh thể . 10 2.5 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong nông nghiệp 11 2.5.1 Vi nhân giống 11 2.5.2 Sản xuất và bảo quản cây sạch bệnh 12 2.5.3 Bảo quản và nhân giống in vitro . 12 2.6 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) . 12 2.6.1 Auxin . 12 2.6.2 Cytokinin . 13 2.7 Sơ lược về lan hồ điệp . 13 2.7.1 Vị trí phân loại . 13 2.7.2 Nguồn gốc, xuất xứ 14 2.7.3 Mô tả hình thái . 14 2.7.4 Trồng trọt và chăm sóc 17 2.7.5 Nhân giống truyền thống . 20 2.8 Vi nhân giống Phalaenopsis . 21 2.8.1 Nhân giống vô tính sử dụng chồi đỉnh . 21 2.8.2 Tái sinh chồi từ phát hoa Phalaenopsis 22 2.8.3 Tái sinh PLB từ mô lá Phalaenopsis . 23 2.8.4 Tăng trưởng PLB thành cây con 23 2.9 Giá trị kinh tế của lan hồ điệp . 24 _Toc241549069Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .26 3.1 Thời gian và địa điểm 26 3.2 Phương tiện thí nghiệm . 26 3.2.1 Đối tượng thí nghiệm . 26 3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ 26 3.3 Tiến hành thí nghiệm . 28 3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ nước javel đến độ sạch của mẫu cấy 28 3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BA,TDZ, điều kiện nuôi cấy tới quá trình tạo protocorm từ lá cây hồ điệp 29 3.3.3 Thí nghiêm 3:Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sinh trưởng, phát triển của cây lan hồ điệp in vitro . 30 3.4 Xử lý số liệu . 31 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ nước javel đến độ sạch của mẫu cấy 32 4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP,TDZ, điều kiện nuôi cấy tới quá trình tạo protocorm từ lá cây hồ điệp in vitro . 35 4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sinh trưởng, phát triển của cây lan hồ điệp in vitro 43 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 5.1 Kết luận 49 5.2 Đề nghị . 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO .50 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT .50 PHỤ LỤC 53 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT : 6 – Benzylaminopurine : Thidiazuron : α - Napthylacetic acid : Đối chứng : Murashige and Skoog (1962) : Môi trường nền : Ngày sau cấy : Nghiệm thức : Protocorm like body : Indol acetic acid : Điều hòa sinh trưởng thực vật : Polyvinylpyrolidone : Lần lặp lại DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Cây và hoa lan hồ điệp (http://www.hcmbiotech.com.vn/technology_detail) . 14 Hình 2.2: Hoa lan hồ điệp . 15 Hình 2.3: Trái lan hồ điệp 3 tháng tuổi (ảnh chụp tại Trại lan, Viện KHNN Miền Nam) 16 Hình 2.4: Keiki của lan hồ điệp (http://www.orchidshome.com) 16 Hình 2.6: Một số giống lan hồ điệp tại Việt Nam 25 Hình 3.1: Phát hoa lan hồ điệp, bộ phận lấy mẫu cấy 28 Hình 3.2: Mẫu lá lan hồ điệp ban đầu (a) và mẫu cấy (b) 29 Hình 4.1: Mẫu nảy chồi và hình thành hoa thứ cấp (20 NSC) . 34 Hình 4.2: Protocorm được tạo ra trong điều kiện tối (80 NSC) . 42 Hình 4.3: Protocorm tạo ra trong điều kiện sáng (80 NSC) . 43 Hình 4.4: Cây lan hồ điệp ở giai đoạn 40 NSC 48 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các chất dùng khử trùng với nồng độ và thời gian khuyến cáo .7 Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ javel đến tỷ lệ nhiễm nấm và vi khuẩn của mẫu .33 Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ javel đến tỷ lệ chết và tỷ lệ sống của mẫu .33 Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ BAP, TDZ, điều kiện nuôi cấy tới tỷ lệ mẫu lá hình thành protocorm .35 Bảng4.4:Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng BAP, TDZ đến phản ứng của mẫu.36 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của BAP, TDZ và điều kiện nuôi cấy tới tỷ lệ sống và tỷ lệ chết của mẫu lá lan hồ điệp in vitro .37 Bảng 4.6: Ảnh hưởng của BAP, TDZ và điều kiện nuôi cấy tới khả năng hình thành protocorm từ mẫu lá lan hồ điệp in vitro 38 Bảng 4.7: Ảnh hưởng của BAP, TDZ, điều kiện nuôi cấy tới kích thước của protocorm .40 Bảng 4.8: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ của cây lan hồ điệp in vitro 44 Bảng 4.9: Ảnh hưởng của NAA đến số lá của lan hồ điệp in vitro .45 Bảng 4.10: Ảnh hưởng của NAA đến kích thước lá và chiều cao của cây lan hồ điệp in vitro 46 Trong quá trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng ngành nông nghiệp thành phố nói riêng và của cả nước nói chung, hoa lan - cây cảnh là một lĩnh vực có rất nhiều tiềm năng đem lại lợi ích kinh tế cho xã hội và phù hợp với hoàn cảnh của ngành nông Hiện nay, thú chơi hoa kiểng không những là nhu cầu thiết yếu của đời sống xã hội, mà còn là một ngành kinh doanh mang lại hiệu quả kinh tế cao. Nghề trồng lan hiện nay không còn là thú vui tiêu khiển mà đã trở thành hàng hoá. Mặt hàng này không chỉ trao đổi trong nước mà đã thâm nhập ra thị trường thế giới, tạo ra nguồn hàng xuất khẩu có giá trị, đem lại nhiều ngoại tệ cho đất nước. Những năm gần đây, ngành trồng lan ở Tp.Hồ Chí Minh có chiều hướng phát triển tốt. Phong trào này lan rộng, không những ở các cơ quan nghiên cứu, cơ sở sản xuất mà còn ở các hộ gia đình. Trong giai đoạn hiện nay, kỹ thuật nhân giống lan thông thường gần như không đủ đáp ứng cho thị trường. Do đó, nhân giống lan bằng phương pháp nuôi cấy in vitro ngày Hơn thế nữa, trên thị trường hoa - cây cảnh hiện nay, lan hồ điệp là loại lan có hoa đẹp, sang trọng, đa dạng, màu sắc phong phú, lâu tàn. Chính vì thế, hoa lan hồ điệp mang ý nghĩa tinh thần và có giá trị kinh tế cao ở trong nước cũng như ở nước ngoài. Do khả năng tự sinh trong tự nhiên rất thấp, nên phương pháp gieo hạt trong môi trường in vitro được sử dụng để tạo số lượng lớn cây con của giống lan này. Tuy nhiên, những cây con mọc từ hạt thường tăng trưởng không đồng đều, lâu trổ hoa, đặc điểm hoa không thuần nhất. Người ta thường áp dụng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của cây để giữ nguyên những tính trạng quý về màu sắc, kích thước hoa, hình dạng cánh, kiểu phân bố hoa trên trục phát hoa. Từ nguồn nguyên liệu này, tùy theo mục đích mà áp dụng các phương pháp nhân nhanh khác nhau để cho ra số lượng lớn cây đồng nhất trong thời gian ngắn. Với lan hồ điệp, hiện nay bộ phận được sử dụng để vô mẫu phổ biến nhất là phát hoa. Nguyên nhân là do khi cắt phát hoa thì cây vẫn sinh trưởng và phát triển bình thường. Ngoài ra trên phát hoa còn chứa nhiều mầm ngủ nên tạo được nguồn vật liệu nhân giống phong phú, mang lại giá trị kinh tế cao. Xuất phát từ những điều trên, đề tài nghiên cứu được tiến hành tại phòng di truyền và chọn giống – Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam gồm 2 nội dung: Xác định nồng độ nước javel và thời gian khử mẫu phát hoa của lan hồ điệp và theo dõi ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP, TDZ, NAA đến quá trình sinh trưởng, phát triển của lan hồ điệp lai (Phalaenopsis sp.) in vitro. Xác định nồng độ javel thích hợp cho việc vào mẫu phát hoa cây lan hồ điệp. Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự hình thành protocorm từ lá cây lan hồ điệp. Xác định tỷ lệ auxin/cytokinin thích hợp cho quá trình sinh trưởng, phát triển Bố trí thí nghiệm với các mức nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (BAP, TDZ, NAA) khác nhau nhằm tìm ra nồng độ thích hợp nhất cho quá trình tạo chồi trực tiếp từ lá và quá trình tạo rễ của lan hồ điệp. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô 2.1.1 Lịch sử nuôi cấy mô thực vật trên thế giới Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức là Shleiden và Schwam đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ, các tế bào hợp thành. Các tế bào phân hóa đều mang các thông tin di truyền ở trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây Năm 1954, Skoog (Hoa Kỳ) tình cờ thấy, nếu thêm một chế phẩm đã để lâu của DNA lấy tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốc lá thì tác dụng kích thích sinh trưởng trở nên rõ rệt. Việc phát hiện vai trò của IAA, NAA, 2,4D và kinetin cùng với việc phát hiện những vai trò của các vitamine và nước dừa là một bước tiến rất quan trọng trong giai đoạn thứ hai của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật, đó là tiền đề kĩ thuật cho việc xây dựng các môi trường xác định về mặt hóa học và cho việc làm các thí nghiệm ổn định dẫn đến các giai đoạn tiếp theo của ngành khoa học này. Năm 1957, Skoog và Miller công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mô sẹo thuốc lá. Khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ, ngược lại nếu tỷ lệ kinetin/auxin tăng thì dẫn đến khuynh hướng tạo chồi ở mô sẹo. Hiện tượng này được xác định trên nhiều cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào điều khiển sinh trưởng, phát triển, phát sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy. Thành công của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn thứ 3 của lịch sử nuôi cấy mô thực vật. Năm 1960, Berman công bố có thể dùng phương pháp lọc đơn giản để thu được huyền phù không có tế bào dính cụm mà hầu hết là tế bào đơn. Các tế bào đơn có thể gieo trên môi trường, tiếp tục sống, phân chia và tái tạo lại mô sẹo. Cùng với kỹ thuật gieo tế bào của Bergman, nhiều tác giả đã thành công trong tạo cây hoàn chỉnh từ một tế bào, chứng minh một cách rất tốt về tính toàn năng của tế bào thực vật. Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật trong các bình lên men dùng trong công nghiệp vi sinh và khả năng tái tạo cây làm hoàn chỉnh tế bào đã mở ra những triển vọng mới trong việc tạo các dòng tế bào đột biến, các dòng tế bào siêu sản xuất một sản phẩm thứ cấp nào đó và khả năng tăng tần suất đột biến trong di truyền đột biến ở Năm 1966, Guha và Mahes Wari công bố thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược (Datura inoxia). Đến nay việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn đã thành công ở rất nhiều cây (bắp, lúa, .) và đóng góp vô cùng lớn vào việc tăng thêm kiến thức di truyền và thực tiễn chọn giống. Người ta thực sự chú ý đến triển vọng của protoplast vào đầu những năm 1970, khi các tác giả Nigata và Takebe (Nhật) thành công trong việc làm cho protoplast tách từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo nên một phần tế bào trong môi trường lỏng. Do các protoplast có khả năng dung hợp với nhau trong các điều kiện nhất định và hấp thu các phân tử lớn hoặc thậm chí các cơ quan từ bên ngoài, các nhà nuôi cấy mô thực vật đặt hy vọng lớn vào kỹ thuật protoplast để chọn giống có kết quả Năm 1965, Ledoux và cộng tác viên đề xướng vấn đề biến tính của tế bào thực [...]... Các chất khác: đường glucose, agar, nước dừa Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh bằng NaOH hoặc HCl để đạt pH = 5,8 3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ nước javel đến độ sạch của Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ javel thích hợp cho việc vô trùng mẫu cấy lan hồ điệp nhằm tạo nguồn mẫu sạch bệnh ban đầu cho quá trình nhân giống tiếp Vật liệu thí nghiệm: các mắt ngủ được cắt từ phát. .. HgCl2, javel, Ca(0Cl)2 đều mang lại hiệu quả cao Trong thí nghiệm này, nước javel được dùng làm chất khử trùng phát hoa của lan hồ điệp vì giá thành rẻ, an toàn và mang lại hiệu quả cao Thí nghiệm được tiến hành với các nồng độ javel khác nhau trong thời gian 30 phút, kết quả khử trùng mẫu được thể hiện ở bảng 4.1: Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ javel đến tỷ lệ nhiễm nấm và vi khuẩn của mẫu Hóa chất Nồng. .. sự biến động đáng kể về nhiệt độ và ẩm độ giữa mùa mưa và mùa khô nơi hồ điệp sinh sống, vì thế cây hồ điệp không có mùa nghỉ mặc dù do sự bất lợi về thời tiết trong mùa khô, cây hồ điệp tăng trưởng chậm hơn chút ít so với mùa mưa (trong điều kiện tự nhiên) Nhiệt độ thích hợp cho lan hồ điệp sinh trưởng và phát triển là 18oC vào ban đêm và 22oC - 25oC vào ban ngày Tuy nhiên hồ điệp là loài lan chịu... số mẫu nhiễm % Tỷ lệ nhiễm = - x 100 Tổng số mẫu cấy Tỷ lệ mẫu chết, mẫu sống Số mẫu chết % Tỷ lệ mẫu chết = - x 100 Tổng số mẫu đưa vào % Tỷ lệ mẫu sống = 100% - tỷ lệ mẫu chết 3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BA ,TDZ, điều kiện nuôi cấy tới quá trình tạo protocorm từ lá cây hồ điệp Mục tiêu thí nghiệm: tìm nồng độ BA, TDZ và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá. .. khối protocorm được tạo ra (%) = - x 100 Tổng số mẫu cấy Đường kính khối protocorm Chiều cao khối protocorm 3.3.3 Thí nghiêm 3:Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sinh trưởng, phát Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ NAA và BAP thích hợp cho cây lan hồ Vật liệu thí nghiệm: mẫu nuôi cấy là cây lan Phalaenopsis in vitro, có 3 lá Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo... và protein, kích thích quá trình trao đổi chất Bao gồm các nhóm chất: 6-Benzylaaminopurin(BAP), 6-furpurin aminoopurin (kinetin), Zeatin, Thidiazuron(TDZ) Họ phụ (Subfamily): Tông phụ (subtribe): Nhóm (Alliance): Giống (Genus): Loài (Species): Tên tiếng việt: lan hồ điệp, tiểu hồ điệp Lan hồ điệp được tìm thấy vào năm 1750, đầu tiên được Rumphius xác định dưới tên Angraecum Đến năm 1753, Linne đồi... trưởng nhanh của cây trong mùa sinh trưởng cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình Để tăng hệ số nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men,…kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp.Tùy thuộc... Tái sinh tế bào thông qua con đường phát sinh phôi cũng làm giảm sự biến dị, nhưng không nhiều cây trồng có khả năng tái sinh qua quá trình phát sinh phôi Loại mô: các bộ phận của cây trồng được sử dụng trong nuôi cấy mô có bộ máy di truyền khác nhau Thông thường nuôi cấy bằng đỉnh sinh trưởng hay chồi bên Có hai tác nhân làm hư mẫu nuôi cấy in vitro: (1) Bị vi sinh vật hủy hoại, có thể khử trùng mẫu. .. hoại của chất kháng sinh lên mô thực vật xảy ra ở plasmid hay mitochondria, xử lí càng lâu hay nồng độ càng cao dễ dàng dẫn đến sự thay đổi gen của tế bào chất hay DNA Chất kháng sinh được sử dụng ngăn chặn sự lây nhiễm hoại mẫu, nhưng sau đó mẫu được cấy sang môi trường 2.4.4 Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy Thường chúng ta hay thấy hiện tượng hóa nâu hay hóa đen mẫu, sinh trưởng của mẫu bị... sâu Cơ sở của phương pháp này là làm chậm hay ngăn chặn khả năng trao đổi chất của mô ở nhiệt độ 196oC Có khoảng 40 loài đã được bảo quản theo phương pháp lạnh sâu như: nuôi cấy tế bào, mô sẹo, phôi, tế bào trần hay đỉnh sinh trưởng (Karth, 1987) 2.6 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) Hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng trong nuôi cấy mô là auxin Tác dụng sinh lý của auxin chủ yếu