Đang tải... (xem toàn văn)
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYM TRONG CHẾ BIẾN MỘT SỐ NÔNG SẢN THỰC PHẨM
B. KH&CN VCNTP B. KH&CN B N . K H & C V C N T P VCNTP Bộ khoa học và công nghệ Viện Công nghệ thực phẩm 301 Nguyễn Trãi, Thanh xuân, Hà nội Báo cáo tổng kết Khoa học và kỹ thuật Đề tài Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym trong chế biến một số nông sản thực phẩm Mã số : KC 04 07 Chủ nhiệm đề tài cấp nhà nớc : PGS. TS. Ngô Tiến Hiển Đề tài nhánh Nghiên cứu phân lập tuyển chọn và tạo chủng giống bằng kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzym -galactosidaza có hiệu suất cao Chủ nhiệm đề tài nhánh cấp nhà nớc : TS. Nguyễn Văn Cách Hà nội, 10 2004 Bàn quyền: Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Viện trởng Viện Công Nghiệp Thực Phẩm, trừ trờng hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu. Bộ khoa học và công nghệ Viện Công nghệ thực phẩm 301 Nguyễn Trãi, Thanh xuân, Hà nội Báo cáo tổng kết Khoa học và kỹ thuật Đề tài cấp nhà nớc Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym trong chế biến một số nông sản thực phẩm Mã số : KC 04 07 Chủ nhiệm đề tài cấp nhà nớc : PGS. TS. Ngô Tiến Hiển Đề tài nhánh cấp nhà nớc Nghiên cứu phân lập tuyển chọn và tạo chủng giống bằng kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzym -galactosidaza có hiệu suất cao Chủ nhiệm đề tài nhánh cấp nhà nớc : TS. Nguyễn Văn Cách Hà nội, 10 2004 Bản thảo viết xong tháng 09 2004 Tài liệu này đợc chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện đề tài cấp nhà nớc, mã số : KC 04 - 07. Danh sách cán bộ tham gia thực hiện đề tài 1. Nguyễn Văn Cách, Tiến sĩ, Chủ nhiệm đề tài nhánh 2. Nguyễn Tú Anh, Thạc sĩ 3. Quản Lê Hà, Tiến sĩ 4. Nguyễn Lan Hơng, Thạc sĩ 5. Nguyễn Phơng Linh, Cử nhân 6. Đặng Minh Hiếu, Kỹ s 7. Trịnh Ngọc Phơng, Kỹ s 8. Nguyễn Thị Hải Yến, Kỹ s Cơ quan chủ trì đề tài nhánh Trờng Đại học Bách khoa Hà nội 1 Đại Cồ Việt Quận Hai Bà Trng Hà nội, Việt nam Tel.: 04.8692764 http://www.hut.edu.vn 2 Mục lục Tóm tắt Báo cáo kết quả thực hiện đề tài nhánh Trang Danh sách cán bộ tham gia đề tài Tóm tắt nội dung Tóm tắt tiến độ thực hiện đề tài nhánh I. Mở đầu II. Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên vật liệu và trang thiết bị 2.1.1. Nguồn phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật 2.1.2. Hoá chất 2.1.3. Trang thiết bị 2.2. Phơng pháp nghiên cứu III. Kết quả và thảo luận 3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn và nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ lên men thu enzym -galactzidaza 3.2. Nghiên cứu quy trình tách tinh chế thu chế phẩm enzym - galactozidaza 3.3. Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và sử dụng nấm mốc để lên men thu nhận enzym -galactozidaza 3.4. Nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng enzym -galactozidaza để thuỷ phân đờng lactoza trong sữa IV. Kết luận V. Tài liệu tham khảo VI. Phụ lục 6.1. Hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ số 02/2001/HĐ-ĐTCT-KC 04-07, ngày 10 tháng 12 năm 2001 6.2. Hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ số 02/2002/HĐ-ĐTCT-KC 04-07, ngày 01 tháng 01 năm 2002 6.3. Hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ số 02/2003/HĐ-ĐTCT-KC 04-07, ngày 01 tháng 01 năm 2003 6.4. Danh sách cán bộ và sinh viên đợc đào tạo liên quan đến hoạt động củađề tài 6.5. Hợp tác quốc tế (liên quan đến đề tài) 2 4 6 8 10 10 10 10 11 12 15 15 20 22 25 27 29 30 31 37 43 49 54 55 3 Tóm tắt nội dung Sữa là nhóm sản phẩm có giá trị dinh dỡng cao và rất tốt cho sức khoẻ. Tuy nhiên, ở đại đa số ngời trởng thành và ngời già thờng xuất hiện hội chứng thiểu năng chuyển hoá lactoza nên sẽ không sử dụng đợc các sản phẩm sữa thờng, do trong sữa vốn đã chứa nhiều lactoza. Đồng thời, lợng đờng lactoza trong nguyên liệu sữa cao cao còn ảnh hởng xấu đến một số chỉ tiêu chất lợng sản phẩm và gây khó khăn cho công nghệ chế biến. Enym -galactosidaza (-D- galactoside-galactohydrolase, E.C.3.2.1.23) là enzym có khả năng xúc tác phản ứng thuỷ phân đờng lactoza thành hai đờng đơn đễ chuyển hoá là galactoza và glucoza, trong khi nớc ta có nguồn tài nguyên vi sinh vật vô cùng phong phú; Với mục tiêu giải quyết vấn đề lactoza bằng phơng pháp vi sinh vật, đề tài Nghiên cứu phân lập tuyển chọn và tạo chủng giống bằng kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzym -galactosidaza có hiệu suất cao đã đợc triển khai. Trên cơ sở khai thác nguồn vi sinh vật từ một số sản phẩm thực phẩm, đề tài đã tiến hành phân lập, tuyển chọn, nghiên cứu và xác định nhiều chỉ tiêu khoa học và công nghệ khác nhau. Tổng hợp kết quả nghiên cứu thu đợc cho phép rút ra một số kết luận sau: 1. Đã phân lập và tuyển chọn đợc 16 chủng vi khuẩn và 4 chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzym -galactozidaza cao từ hệ sinh thái Việt nam, trong đó hai chủng vi khuẩn có hoạt lực sinh tổng hợp cao hơn cả là: Sphingomonas paucimobilis BK16 và Aeromonas sobria BK41; hai chủng nấm mốc có hoạt lực cao đợc lựa chọn là Aspergillus aculeatus BK-M 4 và Penicillium implicatum BK-M 12 . Đã nghiên cứu xác định đợc một số đặc tính sinh lý và sinh hoá của các chủng đã tuyển chọn và một vài đặc tính enzym - galactozidaza đợc tổng hợp . 4 2. Đã xây dựng đợc quy trình công nghệ lên men và quy trình công nghệ tách tinh chế thu chế phẩm enzym -galactozidaza, với các thông số công nghệ chính là: + Sử dụng chủng vi khuẩn S. paucimobilis BK16 , lên men hiếu khí trên môi trờng dịch thải phomat bổ xung thêm đờng lactoza 15,4g/l; bổ xung pepton và NH 4 NO 3 (theo tỉ lệ 3:1,41) để đạt hàm lợng nitơ tổng số 3,022g/l và điều chỉnh pH về giá trị pH=7; tỉ lệ cấp giống 5%, nhiệt độ lên men 30 o C và kết thúc quá trình sau thời gian lên men là 36 giờ. Hiệu quả tích tụ enzym trong thực tế đạt 6420 MU/ml và khả năng tích tụ lý thuyết có thể đạt 7456 MU/ml. + Phơng trình điều chỉnh tối u cho quá trình lên men là: Y = 5317,65 + 126,85.X 1 - 488,72.X 2 + 74,47.X 3 Với : Y là hoạt lđộ enzym tích tụ, MI/ml X1 là hàm lợng lactoza bổ xung vào dịch thải phomat, g/l X2 là hàm lợng pepton + NH 4 NO 3 ( tỉ lệ 3:1,41), g/l Ntổng X3 là pH môi trờng + Kết thúc lên men ly tâm ở 8000v/ph, trong 10 phút để thu sinh khối; nghiền tế bào 10 phút, bằng siêu âm tần số 14kHez, trong đệm photphat pH=7 ở 4 o C; rồi ly tâm thu dịch trong; kết tủa thu enzym bằng (NH 4 ) 2 SO 4 57,5%; loại muối; tách qua cột trao đổi ion cellulose Hiprep 16/10 DEAE; rửa tách bằng dung dịch muối NaCl 2M với gradient nồng độ biến thiên từ 0,0-0,8M thu các phân đoạn tơng ứng nồng độ muối tách trong khoảng 0,08-0,18M; loại muối rồi cô đặc thu chế phẩm enzym. 3. Đã thu đợc hai chủng nấm mốc A. aculeatus BK-M 4 và P. implicatum BK-M 12 có khả năng sinh tổng hợp enzym -galactozidaza bền nhiệt và đã xác định đợc một vài đặc tính của chúng là: pH opt = 4,7-6,0, t opt = 55 o C; bảo tồn >80% hoạt lực ở điều kiện trên sau 7 giờ và nồng độ galactoza cho phép dới 3,0g/l. 4. Đã kết hợp sử dụng kinh phí đề tài vào việc đào tạo 02 thạc sĩ và 4 kỹ s công nghệ sinh học. Đồng thời đã tạo điều kiện hỗ trợ tích cực trong việc thiết lập và triển khai hợp tác quốc tế. 5 Tóm tắt tiến độ thực hiện đề tài nhánh Tên đề tài nhánh: Nghiên cứu phân lập tuyển chọn và tạo chủng giống bằng kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzym -galactosidaza có hiệu suất cao Mã số đề tài : KC- 04-07 Năm Theo hợp đồng Vợt kế hoạch Cha hoàn thành Năm 2001 1. Đã phân lập đợc 5 chủng vi khuẩn có hoạt tính - galactosidaza từ hệ sinh thái vi sinh vật trong nớc 2. Bớc đầu nghiên cứu đặc tính sinh lý của 2 chủng có hoạt lực cao nhất là KC-02-07-BK01 và KC-02-07-BK05 về: đặc điểm hình thái, đặc điểm về sự phát triển trên môi trờng đặc, dải nhiệt độ phát triển thích hợp 3. Đã phân lập đợc 2 chủng nấm mốc có hoạt tính -galactosidaza Không Năm 2002 1. Đã phân lập và tuyển chọn đợc 7 chủng vi khuẩn và 4 chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzym -galactozidaza cao từ hệ sinh thái trong nớc. 2. Đã tuyển chọn đợc 2 chủng vi khuẩn và 2 chủng nấm mốc có hoạt tính và đặc tính enzym cao hơn cho các nghiên cứu tiếp. 3. Đã tiến hành nghiên cứu về điều kiện lên men, tốc độ phát triển sinh khối và tốc độ tích tụ enzym, các yếu tố ảnh hởng đến sự phát triển và năng lực sinh tổng hợp enzym của chủng nh: nhiệt độ, pH, hàng loạt nguồn dinh dỡng cacbon và nitơ khác nhau . 4. Đã xác định đợc một số đặc tính của enzym -galactosidaza từ chủng BK16 1. Tuyển chọn chủng vợt mức đăng ký 2. Đang triển khai nghiên cứu thử nghiệm trong công nghệ sản xuất phomat theo hớng khai thác lợng chất tan trong nớc dịch và xử lý chất thải bảo vệ môi trờng. Hớng nghiên cứu này bớc đầu cho kết quả khả quan và đã lên men đạt nồng độ enzym 7456 MU/ml. 6 Năm 2003 1. Nghiên cứu về điều kiện lên men, tốc độ phát triển sinh khối và tốc độ tích tụ enzym, các yếu tố ảnh hởng đến sự phát triển và năng lực sinh tổng hợp enzym của chủng nh: nhiệt độ, pH, hàng loạt nguồn dinh dỡng cacbon và nitơ khác nhau .(tiếp theo kỳ trớc) 2. Nghiên cứu thử nghiệm trong công nghệ sản xuất phomat theo hớng khai thác lợng chất tan trong nớc dịch và xử lý chất thải bảo vệ môi trờng. Hớng nghiên cứu này bớc đầu cho kết quả khả quan và đã lên men đạt nồng độ enzym 7456 MU/ml. 3. Đã nghiên cứu, đánh giá và lựa chọn sơ bộ về các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp enzym bền nhiệt cho các nghiên cứu sau này. 4. Đã nghiên cứu, xác định đặc tính và định tên 4 chủng vi sinh vật BK16, BK41, M4 và M12. Đã triển khai nghiên cứu tách và tinh chế thu chế phẩm enzym và xác định một số đặc tính của enzym -galactosidaza *** Đề tài đã kết hợp sử dụng kinh phí để đào tạo 02 thạc sĩ khoa học kỹ thuật, 4 sinh viên nghiên cứu khoa học và tạo điều kiện hợp tác và giúp đỡ cho 01 nghiên cứu sinh Ph.D. nớc ngoài cùng tham gia nghiên cứu về enzym -galactozidaza (trong khuôn khổ thoả thuận hợp tác nghiên cứu và hỗ trợ đào tạo song phơng giữa trờng Đại học Bách khoa Hà nội và trờng Đại học BOKU-Vienna, Cộng hoà áo). Đã nghiên cứu, đánh giá và lựa chọn sơ bộ về các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp enzym bền nhiệt cho các nghiên cứu sau này. 7 I. mở đầu Sữa là nhóm sản phẩm có giá trị dinh dỡng cao, đầy đủ các chất khoáng và có hoạt tính kháng thể; Do vậy, sữa rất tốt cho sức khoẻ, nhất là cho trẻ em và cho ngời già. Đờng lactoza là một thành phần rất quan trọng trong sữa với hàm lợng trong sữa tơi dao động trong khoảng 4,5-5,0%. Tuy nhiên, khả năng hấp thu và chuyển hoá đờng lactoza ở ngời thay đổi theo tuổi tác và có sự dao động đáng kể giữa các cộng đồng dân c khác nhau trên thế giới. Trẻ sơ sinh có khả năng đồng hoá rất tốt lactoza nhờ hệ enzym -galactozidaza đợc tổng hợp trên thành ruột non; Tuy nhiên năng lực sinh tổng hợp enzym này sẽ bị mất dần khi trẻ qua tuổi cai sữa. Kết quả ở đại đa số ngời trởng thành và ngời già khi sử dụng nhiều sản phẩm sữa, do bị suy giảm hay không còn năng lực đồng hoá lactoza, thờng bị xuất hiện các triệu chứng nh: đau bụng, đầy hơi, đau bụng quặn, đi ngoài dữ dội (hội chứng thiểu năng chuyển hoá lactoza, lactose maldigestion - hay ở mức trầm trọng hơn không thể sử dụng đợc các sản phẩm sữa có chứa lactoza, lactose instolerance ). Ngoài ra, trong công nghệ chế biến sữa, lợng đờng lactoza cao còn ảnh hởng xấu đến một số chỉ tiêu chất lợng sản phẩm nh làm sẫm màu (làm tăng cờng độ caramen và cờng độ melanoidin) hoặc có thể tái kết tinh đờng khi bảo quản sản phẩm . Chính vì vậy, việc tìm kiếm giải pháp công nghệ để làm giảm hàm lợng đờng lactoza trong sữa là vấn đề có giá trị thực tiễn và khả năng ứng dụng triển khai cao; Đặc biệt ở nớc ta, trong những năm gần đây các sản phẩm sữa có xu hớng đợc sử dụng ngày càng nhiều và ngày càng rộng rãi hơn. Enzym -galactosidaza (-D-galactoside-galactohydrolase, E.C.3.2.1.23) là enzym có khả năng xúc tác phản ứng thuỷ phân đờng lactoza thành hai đờng đơn galactoza và glucoza. Enzym -galactosidaza có mặt trong nhiều tổ chức của động vật, thực vật và rất nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp hệ enzym này. Ưu thế to lớn của công nghệ ứng dụng vi sinh vật trong sinh tổng hợp enzym đã 8 đợc khẳng định trong thực tiễn sản xuất công nghiệp, trong khi nớc ta có nguồn tài nguyên vi sinh vật vô cùng phong phú, là tiền đề thuận lợi để triển khai nghiên cứu và sản xuất nhóm chế phẩm enzym -galactosidaza. Với luận điểm đã nêu, chúng tôi đã triển khai đề tài "Nghiên cứu phân lập tuyển chọn và tạo chủng giống bằng kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp enzym - galactosidaza có hiệu suất cao". Nội dung chính của đề tài tập trung giải quyết bốn nhiệm vụ là: + Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym -galactosidaza cao từ hệ sinh thái vi sinh vật trong nớc; áp dụng các kỹ thuật tuyển chọn và tạo giống tiên tiến (bao gồm cả việc tách dòng gien -galactosidaza và biến nạp tạo chủng siêu tổng hợp enzym để thu chủng sinh tổng hợp -galactosidaza hiệu suất cao. + Nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hoá chủng đã tuyển chọn, đặc tính enzym -galactosidaza của chủng và nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ lên men thích ứng để sản xuất chế phẩm enzym -galactosidaza. + Nghiên cứu thử nghiệm khả năng ứng dụng chế phẩm enzym -galactosidaza thu đợc trong chế biến sữa. Điểm riêng biệt của đề tài là đã định hớng nghiên cứu nhằm sản xuất nhóm chế phẩm enzym -galactosidaza, là hớng nghiên cứu đang đợc triển khai ở một số nớc t bản công nghiệp; qua đó mở ra khả năng tiếp cận xu thế nghiên cứu hiện đại và kết hợp đào tạo, bồi dỡng năng lực cán bộ để hội nhập và hợp tác nghiên cứu khoa học với các đối tác nớc ngoài. 9 [...]... aculeatus BK-M4 và Penicillium implicatum BK-M12 Đã nghiên cứu xác định đợc một số đặc tính sinh lý và sinh hoá của các chủng đã tuyển chọn và một vài đặc tính enzym -galactozidaza đợc tổng hợp 2 Đã xây dựng đợc quy trình công nghệ lên men và quy trình công nghệ tách tinh chế thu chế phẩm enzym -galactozidaza, với các thông số công nghệ chính là: + Sử dụng chủng vi khuẩn S paucimobilis BK16 , lên men... nồng độ sản phẩm cuối galactoza đến hoạt tính enzym -galactozidaza của P implicatum BK-M12 24 3.4 Nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng enzym -galactozidaza để thuỷ phân đờng lactoza trong sữa Khả năng ứng dụng chế phẩm enzym -galactozidaza để thuỷ phân lactoza trong sữa đợc triển khai theo hai phơng án là: Sử dụng chủng vi khuẩn S paucimobilis BK16 làm tác nhân, lên men ở điều kiện đã xác định đợc trong mục... hoá theo hớng tạo sản phẩm galactooligosaccharide Sử dụng chế phẩm enzym -galactozidaza tái tổ hợp có nguồn gốc từ vi khuẩn E coli ATCC 11105 (do nhóm tác giả Viện Công nghệ sinh học, Trung tâm khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia sản xuất) để xử lý sữa tơi trong thời gian 30 phút ở 30oC, với nồng độ enzym khác nhau: 1, 2, 4, 6, 8 và 10 lần nồng độ cơ sở tơng ứng với nồng độ cơ chất trong sữa tơi,... đặc lại để thu chế phẩm lỏng Kết quả nghiên cứu cho thấy enzym -galactozidaza của vi khuẩn S paucimobilis BK16 có nhiệt độ tối thích trong khoảng 40-50oC, cao nhất ở 45oC; pH tối u quanh giá trị pH=7 và hoạt lực enzym vẫn đạt >80% sau thời gian phản ứng 60 phút 3.3 Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và sử dụng nấm mốc để lên men thu nhận enzym -galactozidaza Nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzym -galactozidaza... phản ứng enzym rồi mới bổ sung cơ chất oNPG Hoạt độ enzym trong mẫu dịch phản ứng đợc xác định bằng biểu thức: E = 1000.(OD420 - 1,75.OD550) V.T.OD600 Trong đó: - E là hoạt độ enzym trong mẫu (MU/ml) - V là thể tích dịch mẫu phản ứng (ml), 13 - T là thời gian phản ứng (phút) - OD420, OD550 và OD600 là mật độ quang mẫu sau phản ứng đo ở các bớc sóng tơng ứng 420nm, 500nm (với mẫu trắng đã vô hoạt enzym) ... thị X-Gal trong nghiên cứu trớc hết đợc pha thành dung dịch gốc X-Gal 20mg/ml trong demethylformamide, bảo quản ở 4oC; khi sử dụng bổ xung dung dịch X-Gal vào môi trờng đến nồng độ khoảng 4àg/ml, ở nhiệt độ môi trờng khi bổ xung khoảng 55oC) Thí nghiệm nghiên cứu năng lực sinh tổng hợp và hoạt tính enzym - + galactozidaza của chủng đợc thực hiện bằng lên men trên các điều kiện nghiên cứu tơng ứng (thay... quả và thảo luận 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn và nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ lên men thu enzym -galactzidaza Từ các nguồn sữa chua (Sản phẩm của công ty Vinamilk, Nestle' và sản phẩm thủ công) và các loại nem chua lu hành trên thị trờng Hà nội, phân lập sơ bộ trên môi trờng Lactoza-broth đã tách đợc 64 dạng khuẩn lạc phản ứng dơng tính rõ nét trên môi trờng chứa chỉ thị X-Gal; từ... khô Thực nghiệm từ 1 lít dịch lên men với hoạt độ enzym 6420 MU/ml đã thu đợc 5,2g sinh khối đông khô với hoạt độ 1012MU/mg; nghĩa là khả năng thu hồi enzym khoảng 82% Sữa tơi có đờng, sản phẩm thơng mại của công ty Vinamilk, đợc điều chỉnh đến hàm lợng đỡng xấp xỉ 30g/l; rồi bổ xung chế phẩm sinh khối đông khô 0,5g/500ml sữa (tơng ứng nồng độ enzym xấp xỉ 2000MU/ml) Giữ hỗn hợp phản ứng ở 30oC, trong. .. nghiệm kiểm tra hoạt lực enzym tự do trong dịch lên men, ở dịch nghiền sinh khối vi khuẩn đã cho thấy ở tất cả các chủng kiểm tra hoạt lực enzym 16 nội bào cao hơn nhiều so với enzym ngoại bào và hoạt lực enzym tăng khi kéo dài thời gian xử lý siêu âm Từ kết quả trên cho phép rút ra kết kuận enzym galactosidaza là enzym nội bào liên kết trong tế bào chất Một số thực nghiệm xử lý tạo biến chủng siêu tổng... gian lên men (giờ) Hình 5: Năng lực tích tụ enzym của S paucimobilis BK16 trong môi trờng Kết quả nghiên cứu này rất tích cực vì đây chính là nguồn nguyên liệu rẻ tiền và hiệu quả để định hớng lên men sản xuất chế phẩm enzym galactozidaza (vừa chi phí nguyên liệu rẻ, vừa góp phần giảm tải ô nhiễm môi trờng cho cơ sở chế biến sữa) Quá trình lên men tổng hợp enzym trong môi trờng lỏng phụ thuộc vào nhiều