PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

64 551 2
  • Loading ...
1/64 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 23/04/2013, 15:11

PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR iii BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: VÕ NGỌC THƠ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 iv BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS. TRẦN THỊ BÍCH LIÊN VÕ NGỌC THƠ BSTY. HOÀNG THANH HẢI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 iii LỜI CẢM ƠN  Chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Các Thầy Cô anh chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ bảo tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Thầy Hải, Cô Hà các Thầy Cô Bộ Môn Vi Sinh-Truyền Nhiễm đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Anh Lê Hồng Phong ở Cục Thú Y vùng 6 đã rất tận tình chỉ bảo giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khoá luận. Anh Uyên đã động viên chia sẻ vấn đề của tôi. Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 (nhất là các bạn trong phòng 14A, cƣ xá B) đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Đặc biệt tôi xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến Cô Trần Thị Bích Liên Anh Hoàng Thanh Hải đã rất tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu thực hiện khóa luận. Con xin gởi lòng mang ơn đặc biệt nhất đến với cha mẹ, những ngƣời sinh thành, nuôi dƣỡng, dạy dỗ luôn cho con một tinh thần thoải mái để luôn chú tâm vào chuyện học. lời cám ơn đặc biệt nhất tôi xin gởi đến ngƣời bạn thân thiết nhất, Nguyễn Minh Khôi, đã luôn luôn bên tôi, an ủi động viên để tôi làm tốt nhất. Xin cám ơn, cám ơn từ tận đáy lòng tôi. Thủ Đức, tháng 8 năm 2007 iv Võ Ngọc Thơ TÓM TẮT Đề tài: “Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC-145 xác định virus bằng kỹ thuật RT-PCR”. Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 tại phòng Vi Sinh Truyền Nhiễm Khoa Chăn Nuôi Thú Y tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh. Mục tiêu của đề tài là phân lập virus từ các loại mẫu khác nhau xác định sự hiện diện của virus bằng kỹ thuật RT-PCR. Nội dung nghiên cứu gồm: Hồi phục tế bào xác định thời gian một lần cấy chuyển (thời gian tế bào phát triển đầy bề mặt nuôi cấy tạo thành tế bào một lớp) trên bình nuôi cấy 25cm 2 với những lƣợng tế bào là 7.10 5 10 6 . Khảo sát bệnh tích tế bào MARC-145 sau khi nuôi cấy phân lập từ các loại mẫu khác nhau: huyết thanh, hạch amiđan, phổi, hạch phổi. Xác định sự hiện diện của virus PRRS từ bệnh tích tế bào MARC-145 sau gây nhiễm bằng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction). Sau thời gian thực hiện, chúng tôi có các kết quả sau: o Thời gian một lần cấy chuyển ở lọ 25cm 2 với những lƣợng tế bào: 7.10 5 , 10 6 lần lƣợt là 72,56 giờ 46 giờ. o Tế bào MARC-145 sau khi đƣợc hồi phục từ nitơ lỏng vẫn phát triển bình thƣờng. o Phân lập virus PRRS từ hạch phổi, phổi, huyết thanh trên môi trƣờng tế bào MARC-145. Ghi nhận đƣợc 3 mẫu có biểu hiện bệnh tích tế bào là 2 mẫu hạch phổi 1 mẫu phổi chiếm tỷ lệ 27,27% (3/11). o Bằng kỹ thuật RT-PCR, trong 3 mẫu có bệnh tích tế bào có 1 mẫu cho kết quả dƣơng tính chiếm tỷ lệ 33,33% trên mẫu xét nghiệm. v SUMMARY Graduating thesis: " Isolating PRRS virus by MARC-145 cell and confirming the virus by RT-PCR technology". The thesis have been done from March to August, 2007 at Microbiology And Infectious Diseases Dept. of Faculty Of Animal Science Veterinary and Center For Chemical And Biological Analysis And Experiment of Nong Lam university Hồ Chí Minh city. Purpose of this reseach: Isolate PRRS virus from different specimens and determine its appearance by RT-PCR technology. The contain is concerned about: Reviewing the cell and determine how long once transfer, length of time for cells grows to make monolayer, in flash with the amount of 7.10 5 and 10 6 . Observating MARC-145 cell`s pathology after infecting the cells with different specimens such as: serum, lung, lympho nodes. Determine virus` appearance from MARC-145 cell's pathology after days postinfection by RT-PCR technology (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction). Finally, we have results: o The average period of one transfer with the amount of 7.10 5 cells is 72,565 hours, 10 6 cells is 46 hours. o MARC-145 after reviewing from liquid nitrogen grow normally. o Isolating PRRS virus from lung, lympho nodes, serum in MARC-145 cell invironment. 3 specimens have MARC-145 cell's pathology postinfection: 2 lymphonotes, 1 lung (3/11 specimens). o We detect the positive form of PRRS RNA by RT-PCR: lympho node. vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT iv SUMMARY . v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x DANH SÁCH CÁC BẢNG . xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xii Chƣơng 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích - Yêu cầu 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN 3 2.1. Tổng quan về nuôi cấy tế bào 3 2.1.1. Một số đặc điểm của tế bào động vật 3 2.1.2. Thành phần cơ bản của môi trƣờng nuôi cấy 4 2.1.3. Điều kiện nuôi cấy 6 2.1.4. Sự tạp nhiễm cách hạn chế . 6 2.2. Phƣơng pháp PCR 6 2.2.1. Nguyên tắc 7 2.2.2. Thực nghiệm . 7 2.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 8 2.2.4. Phƣơng pháp RT-PCR 9 2.3. Sơ lƣợc về căn bệnh, bệnh do virus . 10 2.3.1. Lịch sử bệnh 10 2.3.2. Căn bệnh học . 11 2.3.2.1. Phân loại . 11 2.3.2.2. Một số đặc điểm về hình thái cấu trúc 12 vii 2.3.2.3. Đặc điểm nuôi cấy 14 2.3.2.4. Sức đề kháng 16 2.3.3. Dịch tễ học bệnh PRRS . 16 2.3.3.1. Loài mắc bệnh 16 2.3.3.2. Phƣơng thức lây lan . 16 2.3.3.3. Đƣờng xâm nhập 17 2.3.3.4. Cơ chế sinh bệnh 17 2.3.4. Triệu chứng lâm sàng 20 2.3.5. Chẩn đoán 20 2.3.5.1. Chẩn đoán lâm sàng . 20 2.3.5.2. Chẩn đoán phi lâm sàng . 21 2.3.5.2.1. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể 21 2.3.5.2.2. Các phƣơng pháp phát hiện kháng nguyên 22 2.3.5.2.3. Phát hiện gen của virus PRRS 23 2.3.5.2.4. Phân lập virus trên môi trƣờng tế bào 23 Chƣơng 3: NỘI DUNG PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH . 25 3.1. Thời gian địa điểm . 25 3.2. Đối tƣợng số lƣợng mẫu 25 3.3. Nội dung nghiên cứu 25 3.4. Vật liệu dụng cụ 26 3.4.1. Thiết bị dụng cụ dùng cho nuôi cấy tế bào phân lập virus 26 3.4.2. Vật liệu dùng cho nuôi cấy tế bào MARC-145 . 26 3.4.3. Thiết bị dụng cụ dùng cho phản ứng PCR . 27 3.4.4. Vật liệu hoá chất cho chiết tách RNA 27 3.4.5. Vật liệu hoá chất sử dụng cho RT-PCR . 27 3.4.6. vật liệu hoá chất cho điện di sản phẩm RT-PCR . 28 3.5. Phƣơng pháp tiến hành . 28 3.5.1. Phƣơng pháp lấy mẫu 28 3.5.2. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào MARC-145 28 viii 3.5.2.1. Hồi phục tế bào 28 3.5.2.2. Cấy chuyển tế bào 29 3.5.3. Phƣơng pháp phân lập virus 30 Chƣơng 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 34 4.1. Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145 . 34 4.2. Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trƣờng tế bào MARC-145 . 35 4.3. Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145 37 4.4. Kết quả RT-PCR 40 Chƣơng 5: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ . 44 5.1. Kết luận 44 5.2. Tồn tại 44 5.3. Đề nghị . 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 45 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Sơ đồ cơ chế sinh bệnh của virus PRRS 19 Sơ đồ 3.1. Sơ đồ phân lập xác định virus PRRS 31 Sơ đồ 3.2. Sơ đồ thực hiện phản ứng RT-PCR . 33 x DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Virus PRRS . 12 Hình 2.2. Đại thực bào bình thƣờng 15 Hình 2.3. Đại thực bào bị nhiễm virus PRRS . 15 Hình 2.4. Triệu chứng bệnh tai xanh . 20 Hình 2.5. Sảy thai do virus PRRS . 20 Hình 3.1. Buồng đếm Neubauer 30 Hình 4.1. Đối chứng âm . 40 Hình 4.2. Mẫu không có bệnh tích tế bào . 40 Hình 4.3. Đối chứng dƣơng 40 Hình 4.4. Bệnh tích tế bào vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu HP 41 Hình 4.5. Bệnh tích tế bào vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu P2 . 41 Hình 4.6. Kết quả RT-PCR mẫu ly trích từ dịch nuôi cấy tế bào . 42 [...]... của virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC- 145 bằng kỹ thuật RT- PCR góp phần hoàn thiện dần quá trình chẩn đoán bệnh PRRS trên heo lấy đó làm cơ sở cho những nghiên cứu sau này 1.2.2 Yêu cầu Khảo sát đặc tính của tế bào MARC-145 bằng cách hồi phục tế bào xác định thời gian một lần cấy chuyển Phân lập virus PRRS từ huyết thanh, phổi, hạch phổi của heo nghi ngờ bệnh trên môi trƣờng tế bào MARC-145. .. của virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MA104 (MARC-145) , hiệu giá virus có thể đạt tối đa 108,5 TCID50/0,1ml sau 48- 72 giờ nuôi cấy Khi gây nhiễm tế bào, hầu hết các chủng virus PRRS đều gây bệnh tích tế bào nhƣng vẫn có một số chủng virus PRRS thì không (Christianson Joo, 1994; Yoon cs, 1992) Bệnh tích tế bào do virus PRRS gây ra là: tế bào co tròn, tập trung lại, sau đó dày lên, nhân co lại và. .. bệnh các nghiên cứu sau này 2 Xuất phát từ thực tế trên, đƣợc sự phân công của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp HCM, dƣới sự hƣớng dẫn tận tình của ThS Trần Thị Bích Liên BSTY Hoàng Thanh Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC- 145 xác định virus bằng kỹ thuật RT- PCR” 1.2 Mục đích – Yêu cầu 1.2.1 Mục đích Xác định sự... bệnh tích tế bào sau 7 ngày nuôi cấy Dùng kỹ thuật RT- PCR (Reverse Trascriptase - Polymerase Chain Reaction) để xác định sự hiện diện của virus PRRS từ dịch tế bào nuôi cấy 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan về nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào kỹ thuật duy trì phát triển các tế bào ở ngoài cơ thể sống nhƣng vẫn thực hiện đầy đủ các chức năng biến dƣỡng chức năng chuyên biệt của tế bào Quá trình... tễ-Cục Thú y) Virus xâm nhập vào tế bào bằng con đƣờng nhập nội bào (endocytosis) qua trung gian receptor Ngƣời ta đã xác định heparan sulfate là thụ thể của đại thực bào phế nang đối với virus( Delputte cs, 2001; Nathalie cs, 2003) trên MARC-145 là vimentin, vimentin là một yếu tố quan trọng trong việc làm ổn định cấu trúc của tế bào chất trong nhiều loại tế bào khác nhau (Jeong-Ki Kim cs, 2005)... phục Ngoài ra tế bào còn có các đặc tính khác nhƣ: kém thích nghi với môi trƣờng, nhạy cảm với các ion kim loại đa số tế bào động vật cần huyết thanh, hormone tăng trƣởng để phân chia (Phan Kim Ngọc, 2002) 2.1.2 Thành phần dinh dƣỡng của môi trƣờng nuôi cấy tế bào Môi trƣờng nuôi cấy tế bào phức tạp giàu chất dinh dƣỡng để tạo điều kiện tốt nhất cho sự phát triển của tế bào Môi trƣờng có thể... gắn vào bề mặt rắn Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt dụng cụ nuôi Tuy vậy một số tế bào nhƣ tế bào ung thƣ có thể sinh trƣởng phân chia ở trạng thái lơ lửng không cần giá đỡ 4 Tế bào động vật có thể đƣợc bảo quản trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -1960C, ở nhiệt độ này tế bào có thể giữ đƣợc khả năng sống không hạn định sẽ phát triển trở lại trên môi trƣờng. .. bào Quá trình nuôi cấy tế bào cho phép mỗi tế bào đóng vai trò nhƣ những tế bào độc lập, nó có thể phân chia nhờ quá trình nguyên phân quần thể tế bào tiếp tục phát triển cho đến khi bị giới hạn bởi bề mặt nuôi cấy hay sự cạn kiệt dinh dƣỡng Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đƣợc tiến hành lần đầu tiên vào năm 1907 bởi Harrison Ngày nay kỹ thuật này đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong y học thú y học để nghiên... cứu tác động của các chất lên tế bào hay nghiên cứu virus để phân lập, giám định, chuẩn độ virus, xác định tính chất huyết thanh học, quan sát hình thái siêu cấu trúc của virus đặc biệt là sản xuất vaccine Quá trình nuôi cấy thƣờng gồm những tế bào thuộc cùng một loại 2.1.1 Một số đặc điểm của tế bào động vật Tính cơ học yếu: tế bào động vật không vách kích thƣớc tế bào khá lớn (khoảng 10 µm) nên... nuôi cấy, tế bào động vật rất dễ vỡ do các lực tác động khi thao tác trên tế bào nhƣ khuấy trộn để tách tế bào, di chuyển mẫu tế bào Tăng trƣởng phân chia chậm: thời gian tăng trƣởng gấp đôi của tế bào trung bình là 30 giờ Trong khi đó thời gian này của vi khuẩn chỉ khoảng 30 phút Tính cần giá đỡ: hầu hết tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống phân chia Thông thƣờng, tế bào phát triển . Võ Ngọc Thơ TÓM TẮT Đề tài: Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC-145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT-PCR . Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng. tiến hành thực hiện đề tài: Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC- 145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT- PCR”. 1.2. Mục đích
- Xem thêm -

Xem thêm: PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR, PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR, PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR, Một số đặc điểm của tế bào động vật Thành phần dinh dƣỡng của môi trƣờng nuôi cấy tế bào, Nguyên tắc Thực nghiệm, Phƣơng pháp RT-PCR, Một số đặc điểm về hình thái và cấu trúc, Đặc điểm nuôi cấy, Phƣơng thức lây lan Đƣờng xâm nhập Cơ chế sinh bệnh, Lịch sử bệnh Triệu chứng lâm sàng, Phản ứng IPMA Immuno peroxidase Monolayer Assay Phản ứng IFA Indirect Immunhofloresence Assay Phản ứng SN Serum Neutralizing, Các phƣơng pháp phát hiện kháng nguyên Phát hiện gen của virus PRRS, Phân lập virus trên môi trƣờng tế bào, Vật liệu dùng cho ni cấy tế bào MARC- 145 Thiết bị và dụng cụ dùng cho phản ứng PCR Vật liệu và hố chất cho chiết tách RNA Vật liệu và hố chất sử dụng cho RT-PCR Vật liệu và hố chất cho điện di sản phẩm RT-PCR, Phƣơng pháp phân lập virus, Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145 Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trƣờng tế bào MARC-145, Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145

Từ khóa liên quan

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn