BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Trần Thị Ái Liên NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ CỦA LACTOBACILLUS TRONG CHẾ PHẨM PROBIOTIC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Trần Thị Ái Liên NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ CỦA LACTOBACILLUS TRONG CHẾ PHẨM PROBIOTIC Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS TRẦN THANH THỦY Thành phố Hồ Chí Minh - 2012 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến: TS Trần Thanh Thủy, người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tạo điều kiện tốt cho hoàn thành tốt luận văn Sở Giáo dục Đào tạo tỉnh Bình Dương, Ban giám hiệu Trường Trung học phổ thông Bình Phú tạo điều kiện thuận lợi cho suốt khóa học Quý thầy cô Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Tp HCM tận tình dạy dỗ thời gian học cao học Quý thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh – Sinh hóa, Sinh lý trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh Viện Sinh học nhiệt đới Tp Hồ Chí Minh hỗ trợ, động viên giúp đỡ trình thực thí nghiệm đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn bạn Trần Thị Minh Định, người tận tình giúp đỡ trình thực thí nghiệm đề tài chỉnh sửa luận văn Tôi xin cảm ơn anh Phan Văn Giác, anh Nguyễn Xuân Đức, em Đỗ Thị Thu Nga, em Lê Đình Hưng em Đặng Thị Tuyết nhiệt tình hỗ trợ, động viên suốt trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn người thân gia đình, bạn bè, đồng nghiệp bên cạnh, ủng hộ Trần Thị Ái Liên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình Các tài liệu tham khảo trích dẫn có nguồn gốc xác thực Tác giả luận văn Trần Thị Ái Liên DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CFU Colony forming unit (mật độ tế bào) ĐC Đối chứng G- Gram âm G+ Gram dương KS Kháng sinh LAB Lactic Acid Bacteria (Vi khuẩn lactic) L Lactobacillus MT Môi trường MRS De Man - Rogosa - Sharpe OD Optical density (mật độ quang) ST Sinh trưởng VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật MỤC LỤC Trang phụ bìa LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU………………………………………………………………………… Chương - TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC 1.1.1 Lược sử nghiên cứu 1.1.2 Các vi sinh vật probiotic thường gặp 1.1.3 Đặc điểm chung vi sinh vật probiotic 1.1.4 Cơ chế tác động chung probiotic 1.1.5 Tình hình nghiên cứu sử dụng chế phẩm probiotic 11 1.2 VI KHUẨN LACTIC 13 1.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý phân loại 13 1.2.2 Quá trình lên men lactic 18 1.2.3 Tiêu chuẩn chọn chủng LAB sử dụng làm probiotic 20 1.2.4 Vai trò probiotic - lactic người 20 1.2.5 Vai trò probiotic lactic vật nuôi 23 1.2.6 Cơ chế tác động probiotic – lactic 24 1.2.7 Ứng dụng vi khuẩn lactic .27 Chương - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 VẬT LIỆU .29 2.1.1 Nguyên liệu 29 2.1.2 Hóa chất .30 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 30 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.2.1 Xác định khả sinh acid tổng MT cacbonat agar 33 2.2.2 Phân lập từ môi trường MRS .33 2.2.3 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc [14] 33 2.2.4 Phương pháp nhuộm Gram [14] 34 2.2.5 Phương pháp khảo sát khả di động [15] .34 2.2.6 Phương pháp xác định kiểu hô hấp [15] 35 2.2.7 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính catalase [42] 35 2.2.8 Phương pháp xác định hoạt tính protease [15] 35 2.2.9 Phương pháp khảo sát khả sinh acid lactic [3], [11] 36 2.2.10 Phương pháp khảo sát khả sinh bacteriocin 37 2.2.11 Phương pháp khảo sát khả đề kháng chất KS LAB đĩa giấy KS chuẩn 38 2.2.12 Phương pháp khảo sát khả chịu đựng pH thấp [14], [15] 38 2.2.14 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến ST hoạt tính kháng khuẩn 39 2.2.15 Ảnh hưởng pH ban đầu đến ST hoạt tính kháng khuẩn…….40 2.2.16 Ảnh hưởng nhiệt độ đến ST hoạt tính kháng khuẩn 40 2.2.17 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tĩnh, lắc đến ST hoạt tính kháng khuẩn 41 2.2.18 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nguồn cacbon MT nuôi cấy đến ST hoạt tính kháng khuẩn .41 2.2.19 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nồng độ glucose đến ST hoạt tính kháng khuẩn 41 2.2.20 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nồng độ cao nấm men lên ST hoạt tính kháng khuẩn 42 2.2.21 Động thái trình sinh trưởng hoạt tính kháng khuẩn chủng LAB tuyển chọn .42 2.2.22 Bảo quản giống LAB phương pháp đông khô [14] [15] 42 2.2.23 Xác định gián tiếp số lượng tế bào cách đếm số lượng khuẩn lạc mọc MT thạch [17] 43 Chương - KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 46 3.1 Kết phân lập chủng Lactobacillus 46 3.1.1 Xác định khả sinh acid MT cacbonat agar 46 3.1.2 Phân lập vi khuẩn lactic môi trường MRS 46 3.2 Đặc điểm sinh học hai chủng LAB tuyển chọn 51 3.2.1 Các đặc điểm hình thái chủng PA2 PP .51 3.2.2 Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng PA2 PP 51 3.3 Phổ kháng khuẩn chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu 55 3.4 Khả chịu đựng điều kiện bất lợi đường tiêu hóa chủng LAB nghiên cứu 57 3.4.1 Khả chịu đựng pH thấp .57 3.4.2 Khả chịu đựng acid mật…………………………… 3.5 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng hoạt tính kháng khuẩn chủng tuyển chọn 61 3.5.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy .61 3.5.2 Ảnh hưởng pH ban đầu 64 3.5.3 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 67 3.5.4 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tĩnh lắc 69 3.5.5 Nguồn cacbon 71 3.5.6 Nồng độ glucose 74 3.5.7 Nồng độ cao nấm men 77 3.6 Động thái trình tạo sinh khối tế bào chủng LAB điều kiện tối ưu 79 3.7 Khả sống sót chủng vi khuẩn lactic sau đông khô 83 3.8 Định danh đến loài phương pháp sinh học phân tử .84 Chương - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 86 4.1 KẾT LUẬN .86 4.2 KIẾN NGHỊ 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO .88 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 88 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI .89 TÀI LIỆU INTERNET .93 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại Lactobacillus [56] 15 Bảng 1.2 Ảnh hưởng probiotic acid lactic heo heo trưởng thành [15], [54] 23 Bảng 3.1 Tổng hợp đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào khả di động chủng VK môi trường MRS 47 Bảng 3.2 Kết khảo sát số đặc điểm LAB 50 Bảng 3.3 Khả sinh trưởng chủng PA2 PP nồng độ muối (NaCl) khác 52 Bảng 3.4 Khả ST hai chủng PA2 PP theo nhiệt độ khác nhau…53 Bảng 3.5 Khả sinh trưởng chủng PA2 PP pH khác 54 Bảng 3.6 Tổng hợp đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng PA2 PP 55 Bảng 3.7 Phổ kháng khuẩn chủng LAB VK gây bệnh 56 Bảng 3.8 Mật độ tế bào tỷ lệ sống sót chủng Lactobacillus PA2 độ pH khác 58 Bảng 3.9 Mật độ tế bào tỷ lệ sống sót chủng Lactobacillus PP độ pH khác 58 Bảng 3.10 Mật độ tế bào tỷ lệ sống sót chủng Lactobacillus PA2 .59 nồng độ acid mật khác 59 Bảng 3.11 Mật độ tế bào tỷ lệ sống sót chủng Lactobacillus PP nồng độ acid mật khác .60 Bảng 3.12 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến ST, hoạt tính kháng khuẩn chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP 61 Bảng 3.13 Kết khảo sát ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến ST, hoạt tính kháng khuẩn chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP 64 Bảng 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ MT nuôi cấy đến ST, hoạt tính kháng khuẩn chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP 67 Bảng 3.16 Kết khảo sát ảnh hưởng nguồn cacbon đến ST, hoạt tính kháng khuẩn chủng Lactobacillus PA2 chủng Lactobacillus PP .71 Bảng 3.17 Ảnh hưởng nồng độ glucose lên ST, hoạt tính kháng khuẩn chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP 75 Bảng 3.18 Ảnh hưởng nồng độ cao nấm men lên ST, hoạt tính kháng khuẩn chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP 77 Bảng 3.19 Kết khảo sát biến động mật độ tế bào, pH môi trường, hoạt tính kháng khuẩn theo thời gian chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus P 80 Bảng 3.20 Tổng hợp điều kiện tối ưu để thu sinh khối hai chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP .82 Bảng 3.22 Sự biến động số lượng tế bào hai chủng vi khuẩn lactic theo thời gian bảo quản đông khô 83 82 ổn định đến thời điểm 48 Sau 48 giờ, ST hoạt tính kháng khuẩn bắt đầu có xu hướng giảm Ngược lại với tăng lên mật độ tế bào hoạt tính kháng khuẩn pH MT giảm dần từ thời điểm 12 – 48 giờ, sau có xu hướng tăng lên không đáng kể Do vậy, thu sinh khối tế bào tốt thời điểm từ 30 đến 36 giờ, giai đoạn chuyển từ pha logarit sang pha phát triển ổn định Tương tự, chủng Lactobacillus PP, ST hoạt tính kháng khuẩn bắt đầu tăng lên từ thời điểm 12 giờ, tăng nhanh đến thời điểm 36 giờ, đạt cực đại thời điểm 42 ổn định đến thời điểm 54 Bắt đầu có xu hướng giảm từ thời điểm sau 54 Sự thay đổi pH MT tỷ lệ nghịch với ST hoạt tính đối kháng Do vậy, thu sinh khối tế bào thời điểm từ 36 đến 42 Bảng 3.20 Tổng hợp điều kiện tối ưu để thu sinh khối hai chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP Điều kiện MT tối ưu Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP MRS MRS 30 – 36 36 – 42 6,5 6,5 Nhiệt độ (0C) 350C – 370C 350C – 370C Nguồn cacbon glucose Glucose Nồng độ glucose (%) - 2% - 2% Nồng độ cao nấm men 1% 1% Môi trường Thời gian thu sinh khối pH ban đầu 83 3.7 Khả sống sót chủng vi khuẩn lactic sau đông khô Mục đích đông khô chủng VSV phương pháp bảo quản giống lâu dài làm nguồn nguyên liệu để tạo chế phẩm probiotic Chúng tiến hành khảo sát khả sống sót chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP sau trình đông khô, thời điểm 0; 15; 30; 45; 60; 75; 90 ngày phương pháp đếm khuẩn lạc môi trường thạch (như mục 2.2.23) Kết trình bày bảng 3.21 Bảng 3.22 Sự biến động số lượng tế bào hai chủng vi khuẩn lactic theo thời gian bảo quản đông khô Số lượng (CFU/g) Thời gian (ngày) 15 % 30 % 45 % Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP 4,57 x109 4,38x109 95,84 4,29x109 93,87 4,12 x109 90,15 4,39 x109 4,12 x109 93,84 4,03x109 91,80 3,99x109 90,88 Số lượng (CFU/g) Thời gian (ngày) 60 % 75 % 90 % Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP 4,11x109 90,00 3,65x109 79,87 3,45x109 75,49 3,97x109 90,50 3,44x109 78,36 3,26x109 74,26 Nhận xét: Từ kết bảng 3.21 nhận thấy, tỷ lệ sống sót hai chủng sau đông khô là: thời điểm 15 ngày (≥ 93%), 60 ngày (≥ 90%) sau 90 ngày (≥ 74%) Khả sống sót sau đông khô tiêu chuẩn quan trọng VSV sử dụng làm probiotic Nhiều VSV probiotic phát huy vai trò probiotic chúng dạng sống Lúc đó, chúng có khả ST gia tăng số lượng tế bào sản sinh chất kháng khuẩn ức chế VSV gây bệnh, sản sinh vitamin, enzyme,… Do vậy, đặc tính sống sót cao sau đông khô có ý nghĩa quan trọng trình sử dụng để sản xuất chế phẩm probiotic bảo quản chúng thời gian dài 84 Qua kết nhận thấy rằng, khả sống sót chủng sau trình đông khô cao so với kết nghiên cứu tác giả Trần Thị Mỹ Trang (2006), nghiên cứu khả sống sót chủng L acidophilus sau 90 ngày đông khô 20,17% 3.8 Định danh đến loài phương pháp sinh học phân tử Để khẳng định lại hai chủng thuộc loài L acidophilus nhãn chế phẩm, gửi hai chủng PA2 PP đến phòng xét nghiệm Công ty Nam Khoa – Thành phố Hồ Chí Minh, để định danh tiếp đến loài Kết định danh đến loài phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA tra cứu BLAST SEARCH Với chủng tiến hành định danh lặp lại hai lần, với hai lần phân lập độc lập (kết đính kèm phần phụ lục)  Kết giải trình tự gen 16S chủng Lactobacillus PA2: CTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCG AGCAGAACCAGCAGATTTACTTCGGTAATGACGCTGGGGACGCGAGCGGC GGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTGAGATACCACT TGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAATAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTA TAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGC TAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAG AGACTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGA GGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGAGCCAAGTCTGATGGAGCAACG CCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAG AAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGAGCGTAATCAACCAGAAAGT CACGGCTAACTACGTG Kết luận: Chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus suntoryeus với độ tương đồng 100%  Kết giải trình tự gen 16S chủng Lactobacillus PP: TTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTC GAGCGAGCAGAACCAGCAGATTTACTTCGGTAATGAGCCTGGGGACGCGA GCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTAGGAT ACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAATAAAGCAGATCGCATGATC AGCTTATAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGC ATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGA GTTGAGAGACTGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCAACAATGGACGCAAGTCTGATGGAC GAACGCCGCGTGAGTGAAGAGGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGG TGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAG AAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTA 85 Kết luận: Chủng Lactobacillus PP Lactobacillus helveticus với độ tương 99%, Lactobacillus acidophilus với độ tương đồng 97% Như vậy, chủng Lactobacillus PA2: Lactobacillus suntoryeus Chủng Lactobacillus PP: Lactobacillus helveticus Với chủng, tiến hành phân lập độc lập nhiều lần chế phẩm chứa thành phần L acidophilus định danh lặp lại hai lần Kết hai lần định danh chủng giống Thực tế, chế phẩm sử dụng chủng VK khác thuộc chi Lactobacillus mang đặc điểm tương tự thay cho loài Lactobacillus acidophilus nên thành phần VSV nhãn thuốc không Kết cảnh tỉnh việc sử dụng chế phẩm probiotic thị trường thuốc Tác dụng hiệu lâm sàng chế phẩm probiotic phụ thuộc gần hoàn toàn vào đặc tính sinh lý – sinh hóa VSV sử dụng Chỉ loài nghiên cứu lâm sàng đầy đủ bảo đảm an toàn lợi ích sử dụng chứng minh cách khoa học Vì vậy, việc công bố sai danh pháp VSV chế phẩm probiotic điều chấp nhận Để bảo đảm quyền lợi cho người tiêu dùng, cần phải có tiêu chuẩn kiểm tra sản phẩm chức mà tiêu định danh phải quan tâm mức, xây dựng đủ sở khoa học cho công tác kiểm nghiệm 86 Chương - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Từ thực nghiệm thu kết luận sau: - Từ 16 loại chế phẩm probiotic phổ biến thị trường thuốc Thành phố Hồ Chí Minh, phân lập đươc 31 chủng VK sinh acid chọn chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP có đặc điểm sinh học: thuộc chi Lactobacillus, tế bào hình que, G+ , vi hiếu khí, lên men lactic đồng hình, catalase âm tính, không tạo hoạt tính protease, bacteriocin âm tính, sản sinh acid lactic cao (1,46 1,47 g/l) - Cả hai chủng có hoạt tính đối kháng mạnh, phổ kháng khuẩn rộng với VSV kiểm định (gây bệnh đường ruột) Đặc biệt, có khả đối kháng số VK gây bệnh đường ruột kháng thuốc S aureus kháng methicillin, E coli kháng ampicillin - Cả hai chủng có khả sống sót cao điều kiện bất lợi đường ruột người:  Khả chịu đựng pH thấp hai chủng cao: pH 1,5, tỷ lệ sống sót lớn 55% thời điểm 120 phút  Khả chịu acid mật chủng cao: - Ở nồng độ 0,5 – 1,0 % tỷ lệ sống sót cao: thời điểm1 (≥ 95%), thời điểm (≤ 39%), thời điểm 10 (≤ 35%) - Ở nồng độ acid mật 1,5 – 2% tỷ lệ sống sót thấp: thời điểm 10 (≤ 25%) - Đã xác định điều kiện MT nuôi cấy thích hợp cho tạo sinh khối, sinh chất kháng khuẩn chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP là: - Môi trường MRS - pH ban đầu: 6,5 - Nhiệt độ nuôi cấy: 350C – 370C - Nuôi cấy tĩnh - Nguồn cacbon glucose 87 - Nồng độ đường glucose: 2% - Nồng độ cao nấm men: 1% - Thời gian tối ưu thu sinh khối: chủng Lactobacillus PA2 30 – 36 giờ; chủng chủng Lactobacillus PP 36 – 42 - Đã tiến hành thu sinh khối, đông khô kiểm tra độ sống sót chủng theo thời gian 90 ngày với tỷ lệ sống sót cao (lớn 74 % chủng) - Kết nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng PA2 PP, kết hợp kết định danh đến loài Công ty Nam Khoa – Tp Hồ Chí Minh Dựa vào khóa phân loại Bergey’s (1986) Okada (1992) kết luận: chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus suntoryeus; chủng Lactobacillus PP Lactobacillus helveticus Qua kết nghiên cứu nhận thấy rằng, chủng có mang đặc điểm sinh học phù hợp với vai trò probiotic Do vậy, sử dụng chúng để tạo chế phẩm probiotic cho nguời 4.2 KIẾN NGHỊ Xác định chất yếu tố đối kháng LAB với VK kiểm định 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình Vi sinh vật học Công nghiệp, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr 100–108 Lý Kim Bảng, Lê Thanh Bình, Tạ Kim Chỉnh (1998), “Ứng dụng vi khuẩn lactic bảo quản thức ăn xanh cho trâu bò”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp, (10), tr 455-457 Nguyễn Thị Chính, Trương Thị Hòa (2005), Vi sinh vật y học, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, tr 224-230 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Yên Phùng Tiến, Đặng Đức Thạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr 86–178 Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo (1996), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, tr 133-138 Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ (1995), Bệnh đường tiêu hóa lợn, Nxb Nông nghiệp Hà Nội Trần Thanh Lan Hương, Phạm Thị Mai (2005), Hóa sinh y học, Nxb Y khoa Phạm Thị Minh Tâm (2008), “Khảo sát định danh số sản phẩm probiotic có Lactobacillus acidophilus kit API 50CHL”, Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, (20) 10 Nguyễn Hữu Phúc (1998), Các phương pháp lên men thực phẩm truyền thống Việt Nam nước vùng, Nxb Nông nghiệp 11 Hồ Văn Thảo (2006), Phân lập, định danh tuyển chọn chủng enterococcus có tiềm probiotic từ phân trẻ sơ sinh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên Tp HCM, tr 3-16 89 12 Trần Linh Thước, Đặng Thị Phương Thảo, Đỗ Anh Tuấn (2004), Giáo trình thực tập Bioinformatic, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp Hồ Chí Minh, Lưu hành nội 13 Lê Ngọc Tú, La Văn Chú, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982), Enzyme vi sinh vật, Nxb Khoa học Kỹ thuật 14 Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Vũ Tường Vy, Trần Thu Hoa (2007), “Khảo sát khả chịu đựng acid, muối mật kháng sinh số vi sinh vật nguyên liệu sản xuất probiotic đường uống”, Tạp chí dược học, (378) 15 Trần Thị Mỹ Trang (2006), Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất chế phẩm probiotic phòng trị bệnh đường ruột cho heo, Luận văn Thạc sĩ Sinh học Đại học Sư phạm Tp HCM 16 Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục 17 Phạm Hùng Vân (2007), “Bacilulus clausii vai trò probiotics điều chị tiêu chảy”, Hội thảo chuyên đề, Hội nhi khoa Tp HCM TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 18 Bielecki, S., Krystynowics, A., Turkiewicz, M., Kalinowska, H (2005), Bacteria cellulose, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co KGaA, pp 37-46 19 Borriello S.P (1984), “Bacteria and gastrointestinal secretion and motility”, Scand J Gastroenterol, 19, pp 114-121 20 Chuard C., and Reller L.B (1998), “Bile – Esculin test for presiumptive identication of enterococci and streptococci: effect of bile concentration, inoculation technique, and incubation time”, J Clin Microbial, 36, pp 1135– 1136 21 Cai, Y., Kumai, S., Ogawa, M., Benno, Y & Nakase, T (1999), “Characterization and identifycation of Pediococcus species from forage crops and their applcation for silage preparation”, Appl Environ Microbiol, 65, pp 2901-2906 22 Colum Dunne, Liam O,Mahony, Lisa Murphy, Gerardine Thornton, Darrin Morrissey, Sile O’Halloran, Maria Feeney, Sarah Flynn, Fergus Shanahan, and 90 J Kevin Collins (2001), “In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings”, American Society for Clinical Nutrition, pp 386-392 23 Carbonelle, F Denneis, A Marmonier, G Pion, R Vargues (1987), Bacteriologie medicale techniques usuelles, SIMEP SA Paris, France 24 Cabo M.L Murado, Gonzalez M.P and Patstoriza L (1999), “A method for bacteoricin quantification”, Journal of Applied Microbiology, 87, pp 907-914 25 Gusils C., Bujazha M and Gonzalez S (2002), Preliminary studies to desing a probiotic, pp 273 -279 26 Goossens D., Jonkers D., Stobberingh E., Bogaard A., Russel M and Stockburgger R (2003), “Probiotic in gastroenterology: Indications and future perspectives”, Medical Microbiology, pp 15-20 27 Green Edward, Javed Muhammad and Grammell Renia (2003), “Lactic acid production”, World Intellual Property Organization, International Publication Number WO, pp 20-23 28 Frank J C and Nino M (2002), “The Lactic Acid Bacteria: A Literature Survey”, Critical Reviews in Microbiology, 28 (4), pp 281-370 29 FAO/WHO Working Group (2002), “Guideline for the evaluation of probiotic in food”, Food and Agriculture Organizatin of the United Nations 30 Heyman M., Menard S (2002), “Probiotic microorganisms: how they affect intestinal pathphysiology”, Cell Mol Life Sci, 59, pp 1-12 31 Klein G (2003), “Taxonomy, ecology and antibiotic resistance of enterococci from food and the gastro – intestinal tract” International Journal of Food Microbiology, 88, pp 123-131 32 Kos B., Suskovic J., Vukovic S., Simpraga M., Frece J and Matosic S (2003), “Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus M92” Journal of Applied Microbiology, 94, pp 981-987 33 Karimi O and Pena A.S (2003), “Probiotic: isolated bacteria strain or mixture of different strain?”, Drug of Today, 39, pp 565-597 91 34 Kakinuma Y (1998), “Inorganic cation transpost and energy transduction in Enterococcus hirae and other streptococci”, Microbiology and Molecular Biology, 62, pp 1021 -1045 35 Kos B., Suskovic J.,Vukovic S., Simpraga M., Frece J and Matosic S (2003), “Adhesion and aggregation ability of probiotic strains Lactobacillus acidophilus M92”, Journal of Applied Microbiology, 94, pp 981-987 36 Lane, D.J (1991), “16S/23S rRNA sequencing”, Nucleic acid techniques in bacterial systematic, pp 115-175 37 Luc De Vuyst, Fre, dri,c Leroy (2007), “Bacteriocins From lactic acid bacteria: production, and food applications”, J Mol Microbial Biotechnol, pp 194-199 38 Laukova A., Strompfova V and Ouwehand A (2004), “Adhesion properties of Enterococci to intestinal mucus of different hosts”, Veterinary Reseach Communication, 28, pp 647-655 39 Liong Min Tze (2006), In-vivo and in-vitro cholesterol removal by Lactobacilli and Bifidobacteria, A thesis submitted for the degree of Doctor of Philosophy, School of Molecular Sciences Victoria University, Bioscience Microflora, 24 40 Marcinakova M., Simonova M., Laukova A (2004), “Probiotic properties of Enterococcus faecium EF9296 strain isolated from silsge”, Bull Vet Inst Pulawy, 73, pp 513-519 41 Moore M R F., Saratinopoulos P., Tsakalidou E., De Vuyst L (2006), “The role and application of enterococci in food and heath”, International journal of food microbiology, 106, pp.1-24 42 M T Liong and N P Shah (2005), “Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of Lactobacillus strains”, American Dairy Science Association, pp 55-56 43 Mishra V., Prasad D.N (2005), “Application of invitro methods for selection of Lactobacillus casei strains as potential probiotics”, International journal of Food Microbiology, 103, pp.109-115 92 44 Naidu A.S, Bidlack W.R, and Clemens R.A (1999), “Probiotic spectra of lactic acid bacteria”, Critical Review in Food Science and Nutrition, 38, pp 13-126 45 Paula C, Teixeira M (1999), “Lactobacillus: Lactobacillus acidophilus”, Encyclopedia of food Microbiology, Academic Press, San Diego, pp 112 116 46 Raio A., Peluso R., Nesme X.and Zoina A (2004), “Chromosome and plasmid diversity of Agrobacterium strains isolated from Ficus benjamina tumor”, European Journal of Plant Pathology, 110, pp 163-174 47 Seppo Salminen (1997), Lactic acid bacteria, Univerof turku, Finland 48 Stackebrandt E.Frederiksen W., Grarrity G.M., Grimont P.A.D., Kampfer P., Maiden M.C.J., Nesme X., Rossello-Mora R., Swings J, TruperH.G.,Vauterin L.,Ward A C.,Whitman W.B (2002), “Report of the adhoc committee the reevalution of the species definition in bacteriology”, International Journal of Systematic and Evolutionnary Microbiology, 52, pp 1043-1047 49 Saarela M., Mogensen G., Fonde R (2000), “Probiotic bacteria: safety functional and technological properties”, Journal of Biotechnology, 84, pp 197-215 50 Song J., Lee S.-C, Kang J.-W., Beak H.-J, Suh J.-W (2004), “Phylogenetic analysis of Streptomyces spp Isolated from potato scab lesion in Korea on basis of 16S rDNA gen and 16S - 23S rDNA internally transceibed spacer seuqnces”, International Journal of Systermatic and Evolutionnary Microbiology, 54, pp 203-209 51 S Oh, S H Kim, and R W Worobo (2000), “Characterization and purification of a bacteriocin produced by a potential probiotic culture, Lactobacillus acidophilus 30SC”, J Dairy Sci, pp 2747-2752 52 Stackebrandt E.Frederiksen W., Grarrity G.M., Grimont P.A.D., Kampfer P.,Maiden M.C.J., Nesme X., Rossello-Mora R., Swings J, TruperH.G.,Vauterin L.,Ward A C.,Whitman W.B (2002), “Report of the adhoc committee the re-evalution of the species definition in bacteriology”, 93 International Journal of Systematic and Evolutionnary Microbiology, 52, pp 1043-1047 53 Ouwehand A.C., Salminen S.,Isolauri E (2002), “Probiotics: an overview of beneficial effects”, Antonie van Leeuwenhoek, 82, pp 279 -289 54 Young Ju Kim, Ji Hee Kang, Ji Sunlee & Myung Suklee (2001), Study on the bacteriocin produced by Lactobacillus GM 7311, Department of Microbiology college of nature Science Pukyong National University 55 Yuan Kun Lee, Koji Nomoto, Seppo Salminen, Sherwood L Gorbach (1999), Handbook of probiotis, John Wiley & Sons 56 Yeung P.S.M., M E Sanders, C.L Kitts, R Cano and P.S.Tong (2001), “Species- Species-Specific indentification of Commercial Probiotic Strains”, J Dairy Sci pp 1039–1051 57 Wood B.J.B and Holzapfel W.H (1995), The genera of lactic acid bacteria, Blackie Ademic and Professional, London, pp 19-48 TÀI LIỆU INTERNET 58 http:// www.enterococcus.ouhssc.edu 59 http:// www.fao.org/es/ESN/Probio.htm 60 http:// www.mesanders.com (probiotic basics) 61 http:// en.wikipedia.org/wiki/Probiotic.html 62 http:// apresslp.gvpi.net/zpfmicro/lpext.dll/fmicro/a890-Ink 63 http:// www.baomoi.com 64 http:// vietbao.vn/Suc-khoe 65 http:// tintuc.timnhanh.com/xa-hoi/20100802/35AA93FB 66 http://diaglab.vet.cornell.edu/clinpath/modules/chem/bileacids.htm 68 http:// apresslp.gvpi.net/zpfmicro/lpext.dll/fmicro/a890-Ink 69 http:// www.gut.bmjjournals.com PHỤ LỤC Bảng P1 Giá trị tương quan OD 610 với số lượng tế bào chủng Lactobacillus PA2 Stt Mật độ quang (OD 610nm ) Số lượng tế bào 0,1 3541600 0,2 6737500 0,3 9250000 0,4 15075000 0,5 18625000 0,6 24700000 0,7 28250000 Đồ thị P1 Đường tương quan tuyến tính OD 610 với số lượng tế bào chủng Lactobacillus PA2 Bảng P2 Mật độ tế bào hai chủng Lactobacillus PA2 Lactobacillus PP theo thời gian Stt Thời gian nuôi cấy (giờ) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 78 81 84 87 90 93 96 OD 610 Lactobacillus PP Lactobacillus PA2 0,032 0,032 0,033 0,063 0,364 1,050 1,676 1,980 2,224 2,290 2,346 2,378 2,428 2,484 2,515 2,515 2,515 2,516 2,515 2,515 2,488 2,467 2,434 2,401 2,364 2,343 2,311 2,305 2,305 2,299 2,294 2,288 2,277 0,025 0,025 0,032 0,038 0,503 1,415 2,114 2,334 2,448 2,515 2,582 2,612 2,657 2,657 2,656 2,656 2,656 2,648 2,638 2,604 2,558 2,515 2,438 2,412 2,388 2,380 2,372 2,336 2,352 2,344 2,337 2,334 2,230 Đồ thị P2 Đường cong sinh trưởng chủng Lactobacillus PA2 Đồ thị P3 Đường cong sinh trưởng chủng Lactobacillus PP [...]... đề tài nghiên cứu cho mình là: Nghiên cứu đặc điểm và vai trò của Lactobacillus acidophilus trong chế phẩm probiotic Với mục tiêu: Nhằm làm rõ hiệu quả của việc sử dụng probiotic Nhiệm vụ của đề tài: 1 Phân lập, tuyển chọn 2 chủng Lactobacillus từ các chế phẩm probiotic dành cho người 2 Tìm hiểu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng Lactobacillus 3 Khảo sát phổ kháng khuẩn của 2 chủng Lactobacillus. .. quả kiểm nghiệm thuốc của tác giả Phạm Hùng Vân (2007) thì có đến 4/10 chế phẩm probiotic cho người đã sử dụng không đúng chủng được ghi trên nhãn thuốc Đặc biệt, các sản phẩm này đã bổ sung nhầm VK gây hại vào các chế phẩm probiotic Điển hình là chế phẩm Biosubtyl DL (dạng gói bột do Viện Vắc xin Đà Lạt sản xuất) và chế phẩm Subtyl (dạng viên nén, sản xuất tại Việt Nam) Hai chế 12 phẩm đã ghi thành phần... đình chỉ lưu hành và yêu cầu thu hồi trên toàn quốc [63] 13 Tác dụng và hiệu quả lâm sàng của các chế phẩm probiotic phụ thuộc gần như hoàn toàn vào đặc tính sinh lý – sinh hóa của chủng VSV được sử dụng Chỉ những loài nào đã được nghiên cứu lâm sàng đầy đủ mới bảo đảm an toàn và lợi ích sử dụng được chứng minh một cách khoa học Vì vậy, việc công bố sai danh pháp của VSV trong chế phẩm probiotic là một... chế phẩm probiotic như một loại thực phẩm, thuốc phòng và chữa bệnh [58] Nghiên cứu về việc sử dụng VSV probiotic trong chế độ ăn uống đã được tiếp tục suốt cả thế kỷ qua Công việc ở giai đoạn trước của thế kỷ là đề cập đến việc sử dụng sữa lên men để điều trị bệnh lây nhiễm đường ruột Các nghiên cứu gần đây đã tập trung vào lợi ích sức khỏe khác của các VSV này, cũng như về bảo đảm sự sống 4 sót của. .. lactose trong sữa uống và lactose sẽ được đồng hóa, đồng thời canxi cũng được hấp thu [51] 11 1.1.5 Tình hình nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm probiotic Chế phẩm probiotic hiện nay rất đa dạng với nhiều hình thức khác nhau Một trong những chế phẩm probiotic phổ biến được biết đến với tên thường gọi là “men vi sinh” Chúng tồn tại ở các dạng như cốm, bột, lỏng, viên nén,… chứa VSV có thể ở dạng sống, chết... trình tiêu hóa hấp thu các chất của cơ thể vật chủ Trong số các chủng LAB nghiên cứu làm probiotic thì chủng Lactobacillus acidophilus sớm được biết đến và nghiên cứu nhiều nhất Đây là chủng vi khuẩn 2 (VK) được phân lập đầu tiên bởi Moro (1900) từ ruột người và động vật, đặc biệt là từ phân của trẻ sơ sinh nuôi bằng sữa mẹ Mặt khác, VK này có mặt trong hầu hết các chế phẩm probiotic trên thị trường hiện... bệnh đường ruột ở người 4 Nghiên cứu khả năng tồn tại trong điều kiện bất lợi ở đường ruột 5 Xác định các điều kiện ST và sinh chất đối kháng của 2 chủng Lactobacillus được tuyển chọn 6 Nghiên cứu khả năng sống sót sau quá trình đông khô 7 Phân loại đến loài 2 chủng VK nghiên cứu bằng sinh học phân tử Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ chế phẩm probiotic 3 Chương 1 -... khi ở trong vùng dạ dày - ruột và các loại thực phẩm để vận chuyển chúng vào trong cơ thể con người (Lourens - Hattingh và Viljoen, 2001) 1.1.2 Các vi sinh vật probiotic thường gặp VSV được sử dụng làm probiotic gồm nhiều nhóm khác nhau như VK, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc Tuy nhiên, vì những đặc tính ưu việt của LAB phù hợp với việc tạo chế phẩm probiotic cho người cũng như vật nuôi nên thành phần của. .. 3 Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC 1.1.1 Lược sử nghiên cứu Lịch sử nghiên cứu probiotic bắt đầu trong những năm cuối thế kỷ 19, khi các nhà VSV học phát hiện ra sự khác biệt giữa hệ VSV trong ống tiêu hóa của người bệnh và người khỏe mạnh Hệ VSV có ích trong hệ thống ống tiêu hóa được gọi là probiotic Năm 1870, khi nghiên cứu tại sao những người nông dân Bungary có sức khỏe... IgA của cơ thể (IgA là kháng thể sản sinh nhờ tế bào B trong niêm 21 mạc ruột, đường hô hấp và thực hiện chức năng chống VK trên bề mặt niêm mạc) [2], [13], [15], [54]  Vai trò probiotic - lactic đối với sự tiêu hóa lactose và protein trong sữa Vi sinh vật probiotic – lactic có vai trò quan trọng đối với việc đồng hóa lactose và protein trong sữa, nhờ khả năng khả năng sản sinh enzyme lactase và protease ... khác, VK có mặt hầu hết chế phẩm probiotic thị trường Xuất phát từ lí trên, chọn đề tài nghiên cứu cho là: Nghiên cứu đặc điểm vai trò Lactobacillus acidophilus chế phẩm probiotic Với mục tiêu:...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Trần Thị Ái Liên NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ CỦA LACTOBACILLUS TRONG CHẾ PHẨM PROBIOTIC Chuyên ngành: Vi sinh... 1.1.3 Đặc điểm chung vi sinh vật probiotic 1.1.4 Cơ chế tác động chung probiotic 1.1.5 Tình hình nghiên cứu sử dụng chế phẩm probiotic 11 1.2 VI KHUẨN LACTIC 13 1.2.1 Đặc điểm