VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - QUÁCH NGỌC TÙNG PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI CỘNG SINH TRÊN CÂY QUẾ TẠI TỈNH HÒA BÌNH Chuyên ngành: Vi sinh vật học Hà Nội - 2014 Quách Ngọc Tùng - K16 MỞ ĐẦU Vi khuẩn gây bệnh cókhả kháng thuốc kháng sinh làvấn đề nghiêm trọng vàthu hút mối quan tâm lớn cộng đồng Vìvậy, việc nghiên cứu, lựa chọn tác nhân kháng khuẩn từ tự nhiên ưu tiên hàng đầu nhà khoa học công ty dược phẩm giới Cho đến nay, nhà khoa học không ngừng tìm kiếm nguồn hợp chất tự nhiên khác để phát triển loại thuốc kháng sinh loại thuốc khác nhằm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, giảm thiểu tác dụng phụ tới sức khỏe người bệnh số thuốc tổng hợp hóa học gây [3] Nhiều nghiên cứu chứng minh thực vật làmột nguồn tự nhiên quan trọng điều trị bệnh gây vi sinh vật vàcác bệnh khác Chẳng hạn, quế (Cinamomum loureiri) chứa dược chất tinh dầu lá, vỏ với 90% cinnamaldehyde có hoạt tí nh kháng khuẩn cao vi khuẩn Gram (+) vàvi khuẩn Gram (-) [5] Carvacrol tinh dầu bạc hàphá hủy màng tế bào vi khuẩn Gram (-) làm tăng tính lưu động màng tế bào, dẫn đến thay đổi tí nh thẩm thấu màng tế bào [24] Ngoài giátrị khoa học, thành phần mang lại, dược liệu làmôi trường cho xạ khuẩn nội cộng sinh (sống loại môthực vật) cókhả sinh tổng hợp chất kháng sinh [49] Theo nghiên cứu Berdy, 2005 ước tí nh khoảng 70% kháng sinh cónguồn gốc tự nhiên sử dụng y học lâm sàng sản sinh xạ khuẩn [11] Gần đây, số công bố cho thấy hợp chất chuyển hóa thứ cấp xạ khuẩn nội cộng sinh tạo dược liệu không cósố lượng phong phúmàcòn cósự đa dạng chức tính kháng vi sinh vật, chống ôxi hóa, chống sốt rét vàkiểm soát sinh học Các dược liệu Việt Nam phong phú đa dạng [3] Trong số đó, quế loài dược liệu cónhiều công dụng kháng nấm, chống dị ứng, ung thư dày, chống oxy hóa Ngoài giátrị khoa học thành phần mang lại, qua khảo sát ban đầu cho thấy quế môi trường cho xạ Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Quách Ngọc Tùng - K16 khuẩn nội cộng sinh cókhả sinh tổng hợp chất kháng sinh, chất chống ung thư Tuy nhiên, số lượng nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh quế nói riêng dược liệu nói chung Việt Nam hạn chế Xuất phát từ định hướng trên, thực nghiên cứu đề tài: “Phân lập, đánh giá đa dạng vàkhả sinh kháng sinh xạ khuẩn nội cộng sinh quế tỉnh HoàBì nh” Đề tài đươ ̣c thực hiê ̣n ta ̣i phòng Công nghê ̣ lên men, Viê ̣n Công nghê ̣ sinh học, Viê ̣n Hàn lâm Khoa ho ̣c và Công nghê ̣ Viê ̣t Nam, gồm nội dung chiń h: - Phân lập đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh mẫu quế thu thập tỉnh Hòa Bình - Đánh giá khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng xạ khuẩn nội cộng sinh xác định có mặt ba gen mãhóa enzyme tham gia vào trình tổng hợp kháng sinh gồm polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) vànonribosomal peptide synthetase (NRPS) - Tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp kháng sinh cao - Nghiên cứu tách dòng phân tích trình tự gen mã hóa PKS-I, PKS-II chủng xạ khuẩn tuyển chọn Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Quách Ngọc Tùng - K16 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xạ khuẩn nội cộng sinh thực vật dƣợc liệu 1.1.1 Khái niệm xạ khuẩn nội cộng sinh Hiện nay, nhiều công trì nh nghiên cứu giới công bố tương tác thực vật vàvi sinh vật (VSV), VSV đóng vai trò tác nhân ức chế sinh vật gây bệnh, tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật, phân giải phospho khó hoàtan, cố định nitơ tự do, tăng độ phìcủa đất [17, 51] Phần lớn VSV bao gồm vi khuẩn, nấm mốc vàxạ khuẩn phân lập từ đất, vùng rễ, bề mặt môthực vật Khái niệm xạ khuẩn nội cộng sinh đưa Smith cộng (1957) phân lập thành công xạ khuẩn Micromonospora sp có khả ức chế nấm gây bệnh Fusarium oxysporum mô càchua không nhiễm bệnh [57] Từ đó, có nhiều định nghĩa khác VSV nội cộng sinh định nghĩa Bacon vàWhite (2000): ‘‘VSV nội cộng sinh lànhững VSV sinh trưởng mô tế bào thực vật, không gây hiệu ứng xấu tới chủ’’ nhàVSV học thừa nhận [10] Theo tài liệu, định nghĩa hàm chứa ýrất quan trọng: VSV nội cộng sinh không gây ảnh hưởng mà tăng cường khả trao đổi chất, kích thích sinh trưởng, miễn dịch cho vật chủ cách tổng hợp sản phẩm trao đổi chất [8] Trong số VSV nội cộng sinh, xạ khuẩn chúýbởi khả tổng hợp kháng sinh ức chế VSV gây bệnh [38] Song song với tác dụng dược lýthu nhận từ xạ khuẩn nội cộng sinh, số nhà sinh vật học nghiên cứu khả kiểm soát sinh học (biocontrol) xạ khuẩn nội cộng sinh suốt hai thập kỷ qua [59, 60] Xạ khuẩn chứng minh khả tăng cường, thúc đẩy tăng trưởng chủ, giảm nguy nhiễm mầm bệnh tăng cường khả sống sót chủ điều kiện khác [4] Những hiểu biết sinh lývàmối tương tác phân tử xạ khuẩn vàthực vật lànhững đặc tính quan trọng để khai thác đặc tí nh cólợi xạ khuẩn nội cộng sinh kích thích sinh trưởng thực vật lĩnh vực khác Nhiều nghiên cứu giới khẳng định vai trò quan trọng xạ khuẩn sinh tổng hợp chất kháng sinh Sự đa dạng xạ khuẩn cộng sinh môthực vật làrất phong phú, hứa hẹn tiềm khai thác hợp chất có Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Quách Ngọc Tùng - K16 hoạt tính sinh học chủng xạ khuẩn sinh nhiều lĩnh vực đời sống Các hợp chất có hoạt tí nh sinh học từ xạ khuẩn nội cộng sinh chứng minh làrất đa dạng mặt số lượng vàhoạt tính sinh học như: chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV, kháng ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng [10, 49] Vìvậy, nghiên cứu sàng lọc hợp chất có hoạt tính sinh học nói chung vàhoạt tí nh kháng sinh nói riêng từ xạ khuẩn cộng sinh dược liệu tự nhiên hướng nghiên cứu triển vọng nhàkhoa học giới 1.1.2 Các phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh Xạ khuẩn cư trú mô thực vật bị ảnh hưởng lớn yếu tố môi trường như: pH đất, thành phần chất vô chất hữu đất, lượng mưa, cường độ ánh sáng mặt trời, không khí,nhiệt độ Thêm vào đó, mật độ xạ khuẩn nội cộng sinh nhì n chung thấp vàphụ thuộc vào loại mô khác thực vật [49] Theo công trì nh công bố, quátrì nh phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh cần xử lý bề mặt thực vật nhằm loại bỏ vi khuẩn, vi nấm bề mặt Do đó, phải khử trùng bề mặt mẫu vàcắt mẫu thành mảnh dụng cụ khử trùng trước phân lập Sodium hypochlorite (NaOCl) làmột tác nhân oxy hóa phổ biến sử dụng để khử trùng bề mặt Mẫu thực vật ngâm ethanol 70-99% từ 1-5 phút 1-5% NaOCl khoảng 3-20 phút, rửa nhiều lần nước vôtrùng nhằm loại bỏ lượng NaOCl dư Ngoài ra, hydro peroxide vàclorua thủy ngân sử dụng chất khử trùng bề mặt hiệu [42] Năm 1992, Sardi vàcộng công bố sử dụng propylen oxit để khử trùng bề mặt thay vìhóa chất khử trùng dạng lỏng [60] Qua nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy xử lýbề mặt với ethanol không hiệu với qua trì nh phân lập VSV nội cộng sinh Nếu tăng gấp hai ba lần bước khử trùng bề mặt hỗn hợp ethanol vàmột số chất khử trùng khác thìkhông phân lập xạ khuẩn nội sinh Hiệu khử trùng bề mặt tăng cường việc sử dụng chất hoạt hóa bề mặt Tween 20 Tween 80, làm tăng hiệu tác động chất khử trùng với bề mặt thực vật [12] Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Quách Ngọc Tùng - K16 Phần mẫu khử trùng đặt vào môi trường thạch thích hợp, nuôi cấy nhiệt độ thích hợp từ 25-30°C Trong trình phân lập, nhà nghiên cứu thường gặp phải làVSV phát triển mạnh hai tuần làvi khuẩn nấm tạp nhiễm phần mẫu thực vật Để ngăn chặn sinh trưởng vi khuẩn nấm không mong muốn tìm kiếm loài xạ khuẩn mới, số môi trường chọn lọc sử dụng như: môi trường thạch humic acid-vitamin, môi trường thạch casein tinh bột, cao nấm men, môi trường S… [14, 35, 38] Ngoài ra, bổ sung hợp chất kháng sinh acid nalidixic vàtrimethoprim, nystatin cycloheximide để ức chế vi khuẩn, nấm nội cộng sinh vànâng cao khả phát triển chọn lọc xạ khuẩn vìxạ khuẩn phát triển chậm so với vi khuẩn vànấm [29, 49] 1.1.3 Ứng dụng xạ khuẩn nội cộng sinh thực vật Phần lớn xạ khuẩn nội công sinh sống mô thực vật không gây bệnh tác động bất lợi tới quátrì nh phát triển bình thường Ngoài ra, xạ khuẩn nội sinh nhiều nhàkhoa học nghiên cứu khả sinh kháng sinh, chất kháng ung thư, enzyme, chất kích thích sinh trưởng thực vật, ức chế vàkiểm soát bệnh thực vật 1.1.3.1 Kháng ung thư, kháng viêm Trong năm gần đây, nhu cầu tìm kiếm chất cóhoạt tính kháng, ức chế tế bào ung thư từ xạ khuẩn nội cộng sinh hướng nghiên cứu nhàkhoa học giới Nhiều công bố khẳng định, xạ khuẩn nội cộng sinh cómối quan hệ phức tạp, chặt chẽ với chủ Một số giả thuyết nhận định gen liên quan tới tổng hợp hợp chất có hoạt tí nh sinh học tiếp nhận từ trình trao đổi chất VSV vàthực vật thông qua hệ thống chuyển gen ngang (horizontal gene transfer, HGT) Nhờ nhàVSV học mở triển vọng sản xuất hợp chất sinh học có nguồn gốc từ thực vật nhờ trì nh nuôi cấy VSV, vídụ chất kháng tế bào ung thư paclitaxel phổ biến thông đỏ (Taxus sp.) tách chiết từ xạ khuẩn Kitasatospora sp số nấm cộng sinh khác [38] Một số nghiên cứu gần cho thấy, tỷ lệ phát kháng sinh xạ khuẩn nội cộng sinh cótỷ lệ khácao so với xạ khuẩn phân lập từ đất bề mặt thực vật Chẳng hạn kháng sinh có tên naphthomycin K (dẫn xuất kháng sinh ansamycin có gắn thêm nhóm chức chlorine) phát Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Quách Ngọc Tùng - K16 lần từ Streptomyces sp CS nội cộng sinh mỹ đăng mộc (Maytenus hookeri) - loại thuốc có tác dụng điều trị ung thư, hoạt huyết Kết kiểm tra hoạt tính sinh học naphthomycin K cho thấy, hoạt tính gây độc ức chế dòng tế bào P388 vàA-549 nồng độ ức chế là0,07 và3,17 µM, hoạt tính kháng Staphylococcus aureus vi khuẩn lao [39, 68] Ngoài ra, năm chất thuộc phân lớp 16 nhóm macrolide tách chiết vàcho kết ức chế mạnh dòng tế bào MDA-MB-435 điều kiện in vitro [68]; hai chất thuộc nhóm macrolide thu nhận từ Streptomyces sp ls9131 gần phân lập mỹ đăng mộc (M hookeri), hợp chất dimeric dinactin có tác động kháng ung thư mạnh vàhoạt tí nh kháng nhiều loại vi khuẩn gây bệnh cao [39] Trước đây, hai hợp chất 5, 7-dimetoxy-4-phenylcoumarin 5, 7dimetoxy-4-p-methoxylphenylcoumarin có hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh, thường thu nhận từ nhiều loài thực vật khác Nhưng gần đây, nhiều công trì nh công bố hai hợp chất tì m thấy S aureofaciens CMUAc130 nội cộng sinh [61, 62] Hoạt tí nh kháng ung thư hai chất không hì nh thành nhóm nitric oxide, prostaglandin E2 vàtác nhân hoại tử khối u (TNF-α), mà cảm ứng nitric oxide synthase cyclooxygenase-2 lipopolysaccharide gây đại thực bào tế bào RAW 264,7 Tác dụng ức chế phụ thuộc vào nồng độ chất vàức chế hì nh thành TNF-α [61] Do vậy, xạ khuẩn nội cộng sinh lànguồn tiềm cần quan tâm nhằm khai thác chất có hoạt tí nh sinh học thúc đẩy tìm kiếm loại thuốc 1.1.3.2 Kiểm soát sinh học Trong năm gần đây, xạ khuẩn nội cộng sinh thu hút ý nhàVSV khả kiểm soát sinh học mầm bệnh đặc tí nh cộng sinh vàtổng hợp sản phẩm trao đổi chất kháng VSV gây bệnh Nhiều nghiên cứu chứng minh đặc tí nh bảo vệ chủ xạ khuẩn nội cộng sinh chống lại VSV gây bệnh từ đất Rhizoctonia solani, Verticillium dahliae, Plectosporium tabacinum, Gaeumannomyces graminis var tritici, F Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Quách Ngọc Tùng - K16 oxysporum, Pythium aphanidermatum vàColletotrichum orbiculare [12, 18, 22, 23] Cơ chế kiểm soát sinh học tập trung chủ yếu vào sản phẩm trao đổi chất chất kháng sinh, enzyme thủy phân, phytohormone Ngoài ra, chủng xạ khuẩn giúp tăng cường hệ thống miễn dịch thực vật nhờ kí ch thích thụ thể tế bào Vídụ chủng S galbus R-5 không sinh cellulase, pectinase màcòn sản xuất actinomycin X2 fungichromin giúp tăng cường sức đề kháng đỗ quyên, tăng cường sản sinh jasmonate kích thích hệ thống miễn dịch [55] Conn cộng (2008) công bố kết nghiên cứu gây nhiễm Streptomyces sp EN27 Micromonospora sp EN43 hạt giống Arabidopsis thaliana nhằm làm tăng sức đề kháng chống lại nấm bệnh Erwinia carotovora vàF oxysporum; kích hoạt biểu gen tổng hợp acid jasmonic, acid salicilic vàetylen [16] Mối liên hệ xạ khuẩn nội cộng sinh với chủ sản phẩm tự nhiên có hoạt tí nh sinh học sinh xạ khuẩn nội cộng sinh giúp tìm loại thuốc đặc hiệu cótiềm ứng dụng bảo vệ tăng suất trồng 1.1.3.3 Một số dược chất khác từ xạ khuẩn nội cộng sinh Ngoài đóng vai trò quan trọng chu trì nh tuần hoàn vật chất thông qua enzyme thủy phân ngoại bào vàkhả sinh chất kháng sinh khoa học biết đến từ lâu Gần đây, nghiên cứu xạ khuẩn phát nhiều sản phẩm trao đổi chất nhóm VSV có ý nghĩa quan trọng sức khỏe người Một số chủng xạ khuẩn có khả sinh chất pháhủy tế bào hồng cầu động vật (như haemolysin Rhodococcus equi) Các nhàkhoa học phát tiềm lớn hợp chất xạ khuẩn cótác dụng làm tan phần máu đông tụ người bị bệnh tim mạch Trong phòng thí nghiệm, việc sàng lọc chất cóhoạt tí nh chống đông máu (phá hủy hồng cầu) từ xạ khuẩn tiến hành mẫu máu động vật máu ngựa, máu thỏ [51] Một vídụ khác làviệc tạo hợp chất cókhả chống lại tác nhân gây oxy hóa, làm tăng tuổi thọ tế bào Nguyên lý hoạt động Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Quách Ngọc Tùng - K16 chất chống ôxy hóa tìm thấy xạ khuẩn tương tự axit ascorbic (vitamin C) hay tocopherol (vitamin E), tức làtrung hòa thể oxy hóa cao hợp chất oxy hóa (được tạo trình trao đổi chất tế bào hay tác dụng tia cực tím) vàlàm giảm tác dụng oxy hóa chúng [60] Năm 2011, nhóm nghiên cứu Sri phân lập 65 xạ khuẩn nội cộng sinh 13 dược liệu chữa bệnh tiểu đường lô hội (Alloe vera), dây ký ninh (Tinospora crispa), xuyên tâm liên (Andrographis paniculata), nghệ xanh (Curcuma aeruginosa), rau má (Centela asiatica) Trong đó, chủng thể hoạt tính alpha glucosidase ức chế quátrì nh thủy phân tinh bột thành glucose thẩm thấu vào ruột non Kết nghiên cứu tuyển chọn chủng BWA65 có hoạt tính ức chế alpha glucosidase gấp hai lần so với chất cóhoạt tính tương tự thu từ dịch chiết dây kýninh [58] Mặc dù ý nghĩa khoa học hợp chất trao đổi chất kể sinh trưởng vàcạnh tranh xạ khuẩn môi trường tự nhiên chưa rõ ràng tác dụng mà chúng mang lại lĩnh vực y dược, dược phẩm, nông nghiệp chứng minh Chính vìlý này, nhàkhoa học quan tâm tới việc sàng lọc hợp chất cóhoạt tí nh sinh học cao từ xạ khuẩn nói chung vàxạ khuẩn nội cộng sinh nói riêng 1.1.4 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh 1.1.4.1 Tì nh hì nh nghiên cứu giới Trong vài thập kỷ qua chứng kiến nhiều thành tựu tìm kiếm loài xạ khuẩn vàcác hợp chất cóhoạt tí nh sinh học từ xạ khuẩn môtế bào thực vật Do tiềm ứng dụng lớn xạ khuẩn nội cộng sinh nên đối tượng VSV quan tâm vànghiên cứu nhiều nước giới như: Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản… Sơ lược tì nh hì nh nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh thực vật 10 năm gần thể bảng 1.1 [49] Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Quách Ngọc Tùng - K16 Bảng 1.1 Tổng hợp số nghiên cứu giới loài xạ khuẩn nội cộng sinh thực vật Loài thực vật Chi xạ khuẩn Tài liệu tham khảo Cây trồng Lúa mì (Triticum aestivum) Dưa leo (Cucumis sativus) Ngô(Zea mays) Streptomyces, Microbispora, Micromonospora, Nocardioides Streptomyces [18] [55] Microbispora, Streptomyces, Streptosporangium [9] Cơm cháy (Sambucus adnata) Riềng nếp (Alpinia galangal) Glycomyces [49] Streptomyces, Nocardia, Microbispora, Micromonospora [62] Mộc lan (Kennedia nigricans) Sầu đâu Streptomyces [14] Streptomyces, Streptosporangium, Microbispora, Streptoverticillium, Saccharomonospora, Nocardia [30] Cây dƣợc liệu (Azadirachta indica) Sự đa dạng xạ khuẩn cộng sinh môthực vật phong phúhứa hẹn tiềm ứng dụng hợp chất có hoạt tí nh sinh học chủng xạ khuẩn sinh nhiều lĩnh vực đời sống Tuy nhiên, so với đa dạng giới thực vật, số lượng nghiên cứu xạ khuẩn nội cộng sinh thực vật hạn chế Trong 10 năm gần (2001-2012), nhà khoa học thuộc Viện VSV học Vân Nam, Trung Quốc không ngừng nghiên cứu, cải tiến, tối ưu hóa điều kiện phân lập đưa vào bảo tàng giống 5.000 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh phân lập từ 100 loài thực vật [49] Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp chủng xạ khuẩn sinh chứng minh làrất đa dạng mặt số lượng vàhoạt tí nh sinh học chất kiểm soát sinh Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Quách Ngọc Tùng - K16 Bảng 3.10 So sánh độ tương đồng trình tự amino acid PKS-I vàPKS-II từ chủng S angustmyceticus HBQ19 với vài trì nh tự tương ứng GenBank Trình tự amino acid đƣợc so sánh Acyl tranferase (Streptomyces wadayamensis A23) Acyl tranferase (Streptomyces sp S4) Acyl tranferase (Streptomyces sp SM8) pks-II Beta-ACP synthase (Streptomyces decoyicus NRRL 2666) Beta-ACP synthase (Streptomyces sp NRRL S-337) Beta-ACP synthase (Streptomyces sp FxanaC1) Trình tự gen pks-I Mãsố truy cập GenBank Độ tƣơng đồng (%) KDR59688.1 99 WP010639290.1 99 WP008414560.1 97 WP030083349.1 97 WP030811870.1 97 WP018091670.1 97 Theo tổng hợp Kim Yi (2012), đến thời điểm công bố năm 2012 sở liệu lưu giữ khoảng 350 trì nh tự gen mãhóa cho PKS-I 280 trì nh tự gen mãhóa PKS-II từ nguồn vi sinh vật khác nhau, chủ yếu từ vi khuẩn xạ khuẩn [32] Để tổng hợp polyketide làm cấu trúc khung kháng sinh, quátrì nh tổng hợp liên tục khung polyketide từ modul ban đầu với hỗ trợ bắt buộc AT vàACP synthase (Hì nh 3.12) Kết phân tí ch cho thấy, trình tự amino acid PKS-I vàPKS-II tương đồng với trì nh tự AT vàBeta-ACP synthase Đây hai loại enzyme tham gia vào bước khác tổng hợp nên cấu trúc polyketide tạo khung kháng sinh 51 Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Quách Ngọc Tùng - K16 Hình 3.12 Các enzym thiết tham gia (màu xanh) enzym không thiết tham gia (màu đỏ) vào quátrì nh tham gia tổng hợp cấu trúc polyketide AT: Acyltransferase; ACP: Acyl carrier protein; KS: Ketosynthase; KR: Ketoreductase; DH: Dehydratase; ER: Enoyl reductase; TE: Thioesterase [31] Khi phân tí ch trì nh tự amino acid mã hóa AT, Beta-ACP synthase chủng S angustmyceticus HBQ19 cổng thông tin điện tử hỗ trợ tìm kiếm protein domain tham gia hình thành cấu trúc sản phẩm tự nhiên (Natural Product Domain Seeker, NaPDos) cho kết bảng 3.11 vàhình 3.13 Bảng 3.11 Cơ chế tổng hợp kháng sinh dựa trình tự amino acid PKS-I vàPKS-II từ S angustmyceticus HBQ19 Trình tự Mãsố truy amino acid cập GenBank PKS-I Q9L4X2 PKS-II NP629237 Độ tƣơng đồng (%) Sản phẩm tổng hợp Phân loại nhóm 76 70 Nystatin Actinorhodin Polyene macrolide Anthracycline 52 Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Quách Ngọc Tùng - K16 Hình 3.13 Cây phát sinh chủng loại thể mối quan hệ suy diễn trì nh tự amino acid PKS-I vàPKS-II với trì nh tự enzyme liên quan đến tổng hợp kháng sinh khác sở liệu NaPDos Giátrị bootstrap (%) thể tỷ lệ sai khác di truyền Kết bảng 3.9 cho thấy, trình tự amino acid PKS-I từ S angustmyceticus HBQ19 có độ tương đồng trung bình [...]... nguồn xạ khuẩn phong phú và đa dạng hơn nhiều so với các khu vực khác vàhứa hẹn lànguồn phát hiện các chủng xạ khuẩn mới Xạ khuẩn nội cộng sinh rất đa dạng và mức độ đa dạng cóthể thay đổi giữa các vùng lấy mẫu vàcác loài thực vật khác nhau Sự đa dạng về chi và số lượng xạ khuẩn nội cộng sinh phần lớn phụ thuộc vào phương pháp phân lập 1.3 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây. .. ảnh khuẩn lạc Quách Ngọc Tùng - K16 3.2 Sự đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế 3.2.1 Đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh theo bộ phận của cây quế Trên cơ sở 111 chủng xạ khuẩn đã thu nhận được, tiến hành phân tích, đánh giá mức độ đa dạng sinh học theo tỷ lệ xạ khuẩn trên bộ phận cây quế (Hình 3.2) Tỷ lệ xạ khuẩn (%) 70 60.4 60 50 40 30 26.1 13.5 20 10 0 Rễ Thân Lá Bộ phận của cây Hình 3.2 Tỷ lệ xạ. .. về xạ khuẩn nội sinh, cũng như về đánh giá đa dạng xạ khuẩn trên cây quế 1.2 Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh trên thực vật Xạ khuẩn sống trong các cơ quan khác nhau (rễ, thân, lá, hoa, quả vàhạt) của cây chủ vàchủ yếu cư trú trong khoảng không giữa các mô hoặc nội bào Đáng chú ý, thực vật có khoảng 300.000 loài trên trái đất, mỗi loài thực vật là nơi cư trú của rất nhiều loài xạ khuẩn nội cộng. .. vào thành phần môi trường dinh dưỡng, tuổi của chủng và các điều kiện vật lý khác như pH và nhiệt độ Kết quả phân lập và đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh theo bộ phận cây, môi trường phân lập, nhóm màu chứng tỏ quế là cây chủ cho nhiều loài xạ khuẩn nội sinh tồn tại và phát triển Kết quả nghiên cứu trong luận văn cũng chỉ ra đây là những khảo sát đầu tiên về xạ khuẩn nội sinh trên cây quế tại. .. thái và Tài nguyên sinh vật Quách Ngọc Tùng - K16 Nhiều loài xạ khuẩn nội cộng sinh, đặc biệt lànhững loài được phân lập từ cây dược liệu c khả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loại VSV gây bệnh như vi khuẩn, nấm và virus Như vậy, xạ khuẩn nội cộng sinh cótiềm năng để phát triển các loại thuốc kháng sinh mới (Bảng 1.3) Bảng 1.3 Các kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội cộng sinh Xạ khuẩn Cây dƣợc liệu Kháng sinh. .. tại Xishuangbanna, tỉnh Vân Nam, Trung Quốc, nhóm nghiên cứu của Li tại Viện vi sinh vật học Vân Nam đã phân lập 228 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh [36] So sánh với hai nghiên cứu trên thìkết quả phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây quế trong nghiên cứu tương đối cao Nhiều nghiên cứu trên thế giới khẳng định, mức độ đa dạng của các chủng xạ khuẩn trên mẫu phần lớn phụ thuộc vào phương pháp phân lập,. .. phân lập Theo các nghiên cứu về xạ khuẩn nội cộng sinh, phương pháp xử lýmẫu vàthành phần môi trường làyếu tố chí nh quyết định đến kết quả phân lập, đánh giásự đa dạng của xạ khuẩn nội cộng sinh vàtìm ra các loài xạ khuẩn mới [45] Kết quả đánh giá đa dạng các chủng xạ khuẩn phân lập dựa trên 9 loại môi trường đặc hiệu được thể hiện trên hình 3.3 30.0 Tỷ lệ xạ khuẩn (%) 25.2 25.0 20.0 18.0 18.0 16.2... trong tủ cấy vôtrùng [61] Bổ sung các hợp chất kháng sinh như acid nalidixic (15 mg/mL) và nystatin (15 mg/mL) vào 9 loại môi trường phân lập để nâng cao tí nh chọn lọc xạ khuẩn và c chế phát triển của vi khuẩn vànấm cộng sinh 2.2.3 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn nội cộng sinh được xác định bằng phương pháp đục lỗ... cộng sinh tạo nên sự đa dạng sinh học [59] Tuy nhiên, chỉ cómột phần nhỏ thực vật liên quan đến xạ khuẩn nội cộng sinh đã được nghiên cứu nên cơ hội để tì m ra các loài mới vàsản phẩm cóhoạt tí nh sinh học cónguồn gốc từ tự nhiên làrất lớn Những nghiên cứu gần đây đã khẳng định sự đa dạng vàphong phú của xạ khuẩn nội cộng sinh vàcác hợp chất có hoạt tí nh sinh học [12] Xạ khuẩn nội cộng sinh đã và đang... nhau của cây quế (rễ, thân, lá), đã phân lập được 111 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh cómàu sắc hệ khuẩn ty đa dạng và được kýhiệu từ HBQ1 đến HBQ111 Nghiên cứu trước đây của Gangwar v cộng sự (2011) đã phân lập được 40 chủng xạ khuẩn nội cộng sinh từ các mẫu rễ, thân, lá trên cây cây lô hội (Aloe vera), bạc hà(Metha sp.) và hương nhu tía (Ocimum sanctum) [24] Năm 2012, với 4 mẫu cây thanh hao hoa vàng ... lượng xạ khuẩn nội cộng sinh phần lớn phụ thuộc vào phương pháp phân lập 1.3 Khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn nội cộng sinh dƣợc liệu 1.3.1 Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội cộng sinh Chất kháng sinh. .. hồi, quế, atiso, sâm Ngọc Linh Cho đến nay, giới Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh, đánh giá đa dạng xạ khuẩn quế 1.2 Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh thực vật Xạ khuẩn. .. nội cộng sinh, phương pháp xử lýmẫu vàthành phần môi trường làyếu tố chí nh định đến kết phân lập, đánh giásự đa dạng xạ khuẩn nội cộng sinh vàtìm loài xạ khuẩn [45] Kết đánh giá đa dạng chủng xạ