BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thùy Dương NGHIÊN CỨU SỰ TỔNG HỢP CẢM ỨNG CELLULASE Ở MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VƯỜN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thùy Dương NGHIÊN CỨU SỰ TỔNG HỢP CẢM ỨNG CELLULASE Ở MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VƯỜN Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS TRẦN THANH THỦY Thành phố Hồ Chí Minh – 2012 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS TRẦN THANH THỦY – Người hết lòng dạy dỗ, quan tâm, giúp đỡ động viên suốt trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn tất Thầy, Cô khoa Sinh học đặc biệt cô Tuyến Ths Minh Định phụ trách phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh hết lòng hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian theo học tiến hành đề tài Tôi xin cảm ơn Sở Giáo dục – Đào tạo tỉnh Tiền Giang, Trường THPT Vĩnh Bình – Tiền Giang tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học Tôi xin cảm ơn người thân gia đình, bạn bè giúp đỡ, động viên bên cạnh ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu trình bày phần kết luận văn thân thực chưa công bố công trình Tác giả luận văn Nguyễn Thùy Dương iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Lời cam đoan ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn Bacillus 1.1.1 Đặc điểm chung 1.1.2 Hệ enzyme Bacillus 1.1.3 Một số ứng dụng quan trọng Bacillus 1.2 Cellulose enzyme cellulase 1.2.1 Cellulose 1.2.2 Sơ lược enzyme cellulase 10 1.2.3 Phương pháp nuôi cấy VSV để thu nhận enzyme cellulase 20 1.3 Sự cảm ứng sinh tổng hợp enzyme 22 1.3.1 Hiện tượng cảm ứng 22 1.3.2 Mô hình cảm ứng operon Lac 23 1.3.3 Sinh tổng hợp enzyme cảm ứng 27 1.3.4 Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzyme 28 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Nguyên vật liệu 31 2.2 Hóa chất, thiết bị 31 2.2.1 Hóa chất 31 2.2.2 Thiết bị 31 2.3 Các môi trường sử dụng 31 iv 2.4 Các phương pháp nghiên cứu 33 2.4.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus 33 2.4.2 Phương pháp bảo quản giống 34 2.4.3 Quan sát hình thái khuẩn lạc 34 2.4.4 Phương pháp nhuộm Gram 34 2.4.5 Phương pháp nhuộm bào tử 35 2.4.6 Phương pháp xác định hoạt tính catalase 36 2.4.7 Phương pháp định danh đến loài sinh học phân tử 36 2.4.8 Phương pháp chiết dung dịch enzyme thô từ canh trường nuôi cấy VK 37 2.4.9 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cách đo đường kính vòng thủy phân 38 2.4.10 Xác định hoạt độ cellulase theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS39 2.4.11 Phương pháp định lượng cellulose 41 2.4.12 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nguồn chất cảm ứng 42 2.4.13 Phương pháp khảo sát số điều kiện môi trường nuôi cấy để thu nhận cellulase 42 2.4.14 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme cellulase thô 43 2.4.15 Phương pháp khảo sát vài đặc điểm cellulase chủng Bacillus chọn 43 2.4.16 Phương pháp xử lí số liệu 44 Chương KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 45 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng VK có hoạt tính cellulase 46 3.1.1 Phân lập 46 3.1.2 Tuyển chọn sơ 47 3.1.3 Tuyển chọn lần hai 48 3.1.4 Tuyển chọn lần ba 50 3.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học hai chủng ĐM19.1 ĐM20.2 52 3.3 Khảo sát ảnh hưởng nguồn chất cảm ứng đến khả sinh tổng hợp cellulase hai chủng Bacillus 54 3.3.1 Ảnh hưởng loại chất cảm ứng 54 v 3.3.2 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng 56 3.4 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện MT lên khả sinh tổng hợp cellulase hai chủng Bacillus 58 3.4.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 58 3.4.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 59 3.4.3 Ảnh hưởng pH ban đầu 63 3.4.4 Ảnh hưởng nhiệt độ 65 3.5 Định danh chủng ĐM19.1 đến loài sinh học phân tử 68 3.6 Thu nhận cellulase thô từ canh trường nuôi cấy B amyloliquefaciens ĐM19.1 69 3.7 Khảo sát vài đặc điểm CPE cellulase B amyloliquefaciens ĐM19.1 70 3.7.1 Khảo sát giá trị pH thích hợp cho hoạt động enzyme 70 3.7.2 Khảo sát nồng độ chất thích hợp cho hoạt động enzyme 72 3.7.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ enzyme 73 3.7.4 Khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng lên lượng glucose tạo thành75 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77 4.1 Kết luận 77 4.2 Kiến nghị 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 PHỤ LỤC 89 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CPE Chế phẩm enzyme CPE B Chế phẩm enzyme chủng B amyloliquefaciens CMC Carboxymethyl cellulose DNS Acid 3,5 – dinitrosalicylic KL Khuẩn lạc KHV Kính hiển vi MT Môi trường NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth NXB Nhà xuất OD Mật độ quang TB Tế bào STT Số thứ tự VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số enzyme ngoại bào Bacillus Bảng 1.2 Thuộc tính enzyme cellulase từ B subtilis 14 Bảng 2.2 Xây dựng đường chuẩn glucose theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS 40 Bảng 3.1 Vòng phân giải CMC 69 chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulase 48 Bảng 3.2 Tóm tắt khả sinh cellulase chủng vi khuẩn phân lập 50 Bảng 3.3 Hoạt độ cellulase chủng VK chọn 51 Bảng 3.4 Kết lần tuyển chọn chủng VK có hoạt tính cellulase cao 52 Bảng 3.5 Đặc điểm sinh học hai chủng ĐM19.1 ĐM20.2 52 Bảng 3.6 Hàm lượng cellulose loại chất 54 Bảng 3.7 Ảnh hưởng loại chất cảm ứng đến hoạt độ cellulase chủng Bacillus 55 Bảng 3.8 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến hoạt độ cellulase chủng Bacillus 56 Bảng 3.9 Ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ cellulase chủng Bacillus 57 Bảng 3.10 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến hoạt độ cellulase chủng Bacillus 60 Bảng 3.11 Ảnh hưởng hàm lượng nitơ đến hoạt độ cellulase chủng Bacillus 62 Bảng 3.12 Ảnh hưởng pH ban đầu đến hoạt độ cellulase chủng Bacillus64 Bảng 3.13 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ cellulase chủng Bacillus 66 Bảng 3.14 Các điều kiện MT thích hợp cho sinh tổng hợp cellulase chủng Bacillus 67 Bảng 3.15 Kết thu nhận enzyme thô từ Bacillus amyloliquefaciens ĐM19.1 69 Bảng 3.16 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính CPE B 70 Bảng 3.17 Ảnh hưởng nồng độ chất lên hoạt tính CPE B 71 Bảng 3.18 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính CPE B 73 Bảng 3.19 Ảnh hưởng thời gian lên hoạt tính CPE B 74 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơ chế hoạt động exoglucanase 11 Hình 1.2 Cơ chế hoạt động endoglucanase 11 Hình 1.3 Cơ chế hoạt động β –glucosidase 12 Hình 1.4 Cơ chế thủy phân cellulose theo Erikson 12 Hình 1.5 Cấu trúc operon lac 23 Hình 1.6 Promoter operon lac 24 Hình 1.7 Hoạt động operon lac MT nuôi cấy chất cảm ứng 25 Hình 1.8 Hoạt động operon lac MT nuôi cấy có chất cảm ứng 26 Hình 1.9 Sự điều hòa enzyme theo nguyên tắc liên kết ngược 29 Hình 3.1 Hình thái KL số chủng VK phân lập 46 Hình 3.2 Vòng phân giải CMC số chủng VK phân lập phương pháp cấy chấm điểm 47 Hình 3.3 Vòng phân giải CMC số chủng VK phân lập phương pháp đo đường kính vòng thủy phân 49 Hình 3.4 Vòng phân giải CMC chủng VK có hoạt tính cellulase cao 50 Hình 3.5 Hoạt độ cellulase chủng vi khuẩn có đường kính vòng phân giải lớn 51 Hình 3.5 Hình thái KL hai chủng ĐM19.1 ĐM20.2 53 Hình 3.6 Hình thái tế bào hai chủng ĐM19.1 ĐM20.2 53 Hình 3.7 Bào tử hai chủng ĐM19.1 ĐM20.2 53 Hình 3.9 Ảnh hưởng loại chất cảm ứng đến hoạt độ cellulase chủng Bacillus 55 Hình 3.10 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến hoạt độ cellulase chủng Bacillus 57 Hình 3.11 Ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ cellulase chủng Bacillus 58 Hình 3.12 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến hoạt độ cellulase chủng Bacillus 60 Hình 3.13 Ảnh hưởng hàm lượng nitơ đến hoạt độ cellulase chủng Bacillus 62 83 soil”, Minerva Biotechnological, Islamabad, Pakistan 39 Azzaz, H.H., (2009), “Effect of cellulolytic enzymes addition to diets on the productive performance of lactating goats” M.Sc Thesis, Faculty of Agriculture, Cario University, Egypt, pp: 141 40 Aronson A I and Fitz J (1976), “Structure and morphogenesis of the bacterial spore coat”, Bacterial, Rev 40: 360 – 402 41 Amtul, J S., (1989) “Purification and Characterization of Microbial Cellulolytic Enzymes” Ph.D Thesis, Institute of Chemistry, University of the Punjab Lahore – 1, Pakistan, pp: 176 42 Badre Halimi, Carine Dortu, Anthong Argwelles Arias philippe Thonart, Bernard joris Patrick Pakes (2010), “Antilisterial Activity on Poultry Meat of Amylosin, a Bacteriocin from B amyloliquefaciens GA1”, Probiotic & Antimicro Prot, DOI10.1007/s 12602-00-9040-9 43 Bakare, M.K, I.O Adewale, A Ajayi and O.O Shonukan (2005), “Purification and characterization of cellulase from the wild – type and two improved mutants of Pseudomonas fluorescens”, African J of Biotech., (9): 898-904 44 Baumann P, Clark A M, Baumann L, Broadwell H A (1991) “Bacillus sphaericus as a mosquito pathogen”, Properties of the organisms and its toxins Microbiol, Rev.55: 425 – 436 45 Bourret R.B, Borkovich K A, Simon M I (1991), “Signal transduction pathways involving protein phosphorylation in prokaryotes”, Annu Rev Biochem 60 : 401-422 46 Bulla J.A, Costilow R, Sappe E.S (1978), “Biology of Bacillus popippiae”, Adv Appl Microbiol 23: 1-18 47 Carlo N Hamelinck et al (2003), “Prospets for ethanol from lignocellulosic biomas : techno-economic performance as development progresses”, University Utrecht Copernicus Institute, Science Technology Society 84 48 Edwards D L, Payner J, Soares G G (1990), “Novel isolates of Bacillus thuringensis having activity against Nematodes”, U S Patent 4: 734 – 948 49 Fukumori, F., T Kudo and K Horikoshi (1985), “J Gen Microbiol” , 131, 3339-3345 50 Garcia-Martinez D.V., Shinmyo A., Madia A., Deman A.L ( 1980), “ Studies on cellulase production by Clostridium thermocellum”, European Journal Applied Microbiology and Biotechnology 9: 189–197 51 Gokhale DV, Patil SG, Bastawde KB (1991), “ Optimization of cellulase production by A niger NCIM 1207”, Appl Biotechnol, 30 (2), pp, 99-109 52 Helle Outtrup and Steen T Jorggensen (2002), “The Importance of Bacillus Species in the Production of Industrial Enzymes”, Applications and Systematics of Bacillus and relatives, Blackwell Publishing, pp 207-211 53 Howell, J.A and M Mangat, (1978) “Enzyme deactivation during cellulose hydrolysis”, Biotechnol Bioeng, 20: 847-863 54 Huilin Yang, Yuling Liao, Bin Wang, Ying Lin and Liban (2011), “Complete genome sequence of B amyloliquefaciens XH7, which exhibits production of purine nucleosides”, Journal of Bacteriology, pp 5395-5594 55 Idris SE, Iglesias DJ, Talon M, Borriss R (2007), “Truptophan – dependen production of Indoles-3-Acetic (AIA) affects level of plant growth promotion by B amyloliquefaciens FZB42”, Molecular-Microbe Interactions, 20 (6), pp 619-626 56 Ikram-ul-Haq, Muhammad Mohsin javed, Tehmina Saleem Khan and Zafar Siddiq (2005), “Cotton Saccharifying of Cellulases produced by Co-culture of A niger and T viride”, Research Journal of Agriculture and Biological Sciences 1(3): 241-245 57 Koh M, Hanagata H, Ebisu S, Morihara K, Takasi H (2000), “Use of Bacillus brevis for Synthesis and Secretion of Des-B30 Single-Chain Human Insulin Precursor”, Biosci Biotechnol Biochem, 64, pp 1079-1081 58 Krishna, C., (1999), “Production of bacterial cellulases by solid state 85 bioprocessing of banana wastes”, Bioresour Technol, 69, 231-239 59 Laurent P., L Buchon, J.F.G Michel, N Orange (2000) “Production of pectate lyases and cellulases by Chyrseomonas luteola strain MFCL0 depends on the growth temperature and the nature of the culture medium: evidence for two critical temperatures”, App and Env Micro, 66 (4) 15381543 60 Lee B H and T H Blackburn (1975), “Cellulase Production by a Thermophilic Clostridium Species”, App Micro 30 (3) 346-353 61 Lisbeth Olsson, Kim P Hansen (2003), “Influence of the carbon source on production of cellulase, hemicellulase and pectinase by Trichoderma reesei Rut C – 30”, Enzyme and Microbial Technology, 33, pp.612 –619 62 Mandels, M.; Reese, E.T (1960), “Induction of cellulase by fungi cellobiose”, J Bacteriol, 79, pp 816-826 63 Matsuzaki, H., K Yamane, K Yamaguchi, Y Nagata, and B Maruo (1974), Hydro α-amylases produced by transformants of Bacillus subtilis I Purification and characterization of extracellular α-amylases produced by the parental strains and tranformants”, Biochim Biophys Acta 356:235-247 64 Magdi A.M Younis, Francis F.Hezayen, Moustafa (2010), “ World Applied Sciences Journal”, Microbiology and Biotechnology, 7(1), 31-37 65 Meadow N D, Fox D K, Roseman S (1990), “The bacterial phosphoenolpyruvate glucose phosphotransferase system”, Annu Rev Biochem 59 : 497-592 66 M.A Milala, A Shugaba, A Gidado, A.C Ene and J.A Wafar (2005), “Studies on Use of Agricultural Wastes for cellulose Enzyme production by A niger”, Rresearch journal of Agricultural and Biological Sciences, 1(4), pp: 325-328 67 Panmide, S.C: devinder, S.C.; Gerard, A (1991), “ Cellulase production profile of T reesei on diferent cellulosic subtrates at various pH levels”, J fermentation Bioeng.,74, pp 126-128 86 68 Parsad MP and Manjunath K (2011), “Comparative study on biodegradadation of lipid-rich wasterative using lipase product bacterial species”, Indian Jounal of Biodeggradation, pp 121-124 69 Peter H von Hippel (2004), “Completing the view of transcriptional Regulation”, Science, 35, pp 350 – 352 70 Priest G.F.Fellow G M, Tood C (1998) “A Numerical classification of the genus Bacillus”, J Microbiol, 134: 1847-1882 71 Philip G Vankek, John F Connaughton, William D Kaloss and Jack G Chirikjan (1990), “The complete sequence of the B amyloliquefaciens strain H, cellular BamHI Methylase gene”, Nucleic Acids Reseach, 18 (20), pp 615-616 72 Prasetsan P., Doelle H.W (1987), “Nutrient optimization for cellulase biosynthesis by a newly isolated Cellulomonas sp”, Mircen Journal, 3: 33– 44 73 Priest (F.G), GOODFELLOW (M), SHUTE (LA) and BERKELEY (R.C.W) (1987), “B amyloliquefaciens sp Nov nom Rev”, Int, J Syst Bacteriol, 37, pp 69-71 74 Raioka, M.I.; Mahk, K.A (1997), “Enhanced production of celluloses by Cellumonas strains grown on different cellulosis réidues”, Folia Microbiol, 42(1), pp 59-64 75 Ray, A.K., Bairang I, K.S Ghosh and S.K Sen (2007), ”Optimization of fermentation conditions for cellulose production by B subtilis CY5 and B circulans TP3 is olated from fish gut”, Acta Ichthyologogica ET Piscatoria, 37 (1): 47-53 76 Richard J Roberts, Gary A Wilson & Frank E Young (1977), “Recognition sequence of specific endonuclease Bam HI from B amyloliquefaciens H”, Nature 265, pp 82-84 77 Shinke, R., H Nishira, and N Mugibayyashi (1974), “Isolation of amylase producing microorganisms”, Agr Biol Chem, 38 :665-666 β- 87 78 Stanier J Y, Ingraham J L, Wheellis M L, Paninter D, R (1990), General Microbiology, Macmilan Education Ltd Fith adition: 475 – 486 79 Sheremet, A S., et al (2011), “Enhancemet of extracellular purine nucleoside” Tài liệu từ Internet 80 http://www.sera.de/products/knowledge/061097.shtlm 81 http://www.kcpc.usyd.edu.au/discovery/9.2.2/9.2.2_CelulosetoEthene.htm 82 http://web.indstate.edu/theme/mwking/gene-regulation.html 83 http://www.smbs.buffalo.edu/bch/Courses/bms503/sinha_s_class1.pdf 84 http://www.uniprot.org/uniprot/P10475 85 http://vi.wikipedia.org/wiki/Cellulose 86 https://www.google.com.vn/search?hl=vi&q=structure+lactose+operon&bav on.2,or.r_gc.r_pw.r_qf.&biw=1346&bih=634&pdl=300&um=1&ie=UTF8&t bm=isch&source=og&sa=N&tab=wi&ei=hI9SUIbgFuqTiQeeoIHICw 87 http://www.fags.org/patencet/app/20110274673 88 http://www.ecocleanvn.com/MOI-TRUONG/2342289/21472/Nguon-thuc-anNito-cua-vi-sinh-vat.html 89 docs.4share.vn/Resources/Flashs/1/45326.swf 88 89 PHỤ LỤC Phụ lục Đường chuẩn glucose 0,1 0,2 0,3 0,4 0.5 0,6 Glucose (µg/ml) ΔOD (540nm) 0,000 0,201 0,365 0,587 0,733 0,904 1,059 90 0,001 y = 1.813x R² = 0.9964 OD 0,001 0,001 0,001 glucose 0,000 0,000 0,000 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 Nồng độ glucose Đồ thị đường chuẩn glucose Phụ lục Hoạt độ cellulase chủng VK tuyển chọn ∆OD Hoạt độ cellulase (UI/g) STT Kí hiệu chủng Pha loãng (lần) L1 L2 L3 L1 L2 L3 TB Sai số ĐM19.1 ĐM7.5 ĐM9.3 ĐM11.3 ĐM12.2 ĐM20.2 ĐS15.2 ĐS16.3 40 40 40 40 40 40 40 40 0,666 0,480 0,452 0,398 0,404 0,514 0,336 0,377 0,668 0,480 0,450 0,397 0,400 0,513 0,335 0,375 0,665 0,482 0,451 0,399 0,401 0,512 0,333 0,373 29,388 21,180 19,945 17,562 17,827 22,681 14,826 16,635 29,476 21,180 19,857 17,518 17,650 22,637 14,782 16,547 29,344 21,269 19,901 17,606 17,694 22,592 14,694 16,459 29,403 21,210 19,901 17,562 17,724 22,637 14,767 16,547 0,067 0,051 0,044 0,044 0,092 0,045 0,067 0,088 Phụ lục Ảnh hưởng loại chất đến hoạt độ cellulase chủng Bacillus Nguồn Kí hiệu chấ chủng Pha loãng (lần) ∆OD L1 L2 Hoạt độ cellulase (UI/g) L3 L1 L2 L3 TB Sai số 91 Đối ĐM19.1 chứng ĐM20.2 ĐM19.1 Lõi ngô ĐM20.2 ĐM19.1 Bã mía ĐM20.2 ĐM19.1 Rơm ĐM20.2 40 40 40 40 40 40 40 40 0,665 0,515 0,721 0,517 0,641 0,561 0,685 0,612 0,664 0,515 0,718 0,518 0,639 0,562 0,687 0,610 0,665 0,513 0,720 0,520 0,642 0,562 0,689 0,610 29,344 22,725 31,815 22,813 28,285 24,755 30,226 27,005 29,300 22,725 31,682 22,857 28,196 24,799 30,314 26,917 29,344 22,637 31,771 22,945 28,329 24,799 30,403 26,917 29,329 22,696 31,756 22,872 28,270 24,784 30,314 26,946 0,025 0,051 0,068 0,067 0,068 0,025 0,089 0,051 Phụ lục Ảnh hưởng nồng độ chất đến hoạt độ cellulase chủng Bacillus Nồng đ Pha Kí hiệu chấ loãng chủng (%) (lần) ĐM19.1 40 ĐM20.2 40 ĐM19.1 40 ĐM20.2 40 ĐM19.1 40 ĐM20.2 40 ĐM19.1 40 ĐM20.2 40 ĐM19.1 40 ĐM20.2 40 Hoạt độ cellulase (UI/g) ∆OD L1 L2 L3 L1 L2 L3 TB Sai số 0,712 0,620 0,830 0,671 0,791 0,584 0,738 0,565 0,657 0,520 0,712 0,618 0,830 0,670 0,789 0,582 0,740 0,562 0,656 0,519 0,713 0,618 0,831 0,673 0,790 0,584 0,740 0,564 0,656 0,521 31,418 27,358 36,624 29,608 34,903 25,769 32,565 24,931 28,991 22,945 31,418 27,270 36,624 29,564 34,815 25,681 32,653 24,799 28,946 22,901 31,462 27,270 36,669 29,697 34,859 25,769 32,653 24,887 28,946 22,990 31,433 27,299 36,639 29,623 34,859 25,740 32,624 24,872 28,961 22,945 0,025 0,051 0,026 0,068 0,044 0,051 0,051 0,067 0,026 0,045 Phụ lục Ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ cellulase chủng Bacillus Thời Pha Kí hiệu gian loãng chủng L1 (giờ) (lần) 12 ĐM19.1 40 0,580 ∆OD L2 0,581 Hoạt độ cellulase (UI/g) L3 L1 L2 L3 0,582 25,593 25,637 25,681 TB Sai số 25,637 0,044 92 24 36 48 60 72 ĐM20.2 ĐM19.1 ĐM20.2 ĐM19.1 ĐM20.2 ĐM19.1 ĐM20.2 ĐM19.1 ĐM20.2 ĐM19.1 ĐM20.2 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 0,261 0,677 0,312 0,839 0,634 0,830 0,673 0,669 0,485 0,602 0,446 0,263 0,675 0,312 0,840 0,633 0,830 0,671 0,670 0,485 0,603 0,445 0,261 0,677 0,313 0,839 0,634 0,829 0,673 0,668 0,483 0,601 0,445 11,517 29,873 13,767 37,022 27,976 36,624 29,564 29,520 21,401 26,564 19,680 11,605 29,785 13,767 37,066 27,932 36,624 29,608 29,564 21,401 26,608 19,636 11,517 29,873 13,811 37,022 27,976 36,580 29,697 29,476 21,313 26,520 19,636 11,546 29,844 13,782 37,037 27,961 36,609 29,667 29,520 21,372 26,564 19,651 0,051 0,051 0,025 0,025 0,025 0,025 0,051 0,044 0,051 0,044 0,025 Phụ lục Ảnh hưởng nguồn nitơ đến hoạt độ cellulase chủng Bacillus Pha Kí hiệu Nguồn nit loãng chủng (lần) ĐM19.1 Đối chứng ĐM20.2 ĐM19.1 Cao nấm me ĐM20.2 ĐM19.1 (NH ) SO ĐM20.2 ĐM19.1 NH NO ĐM20.2 40 40 40 40 40 40 40 40 ∆OD Hoạt độ cellulase (UI/g) L1 L2 L3 L1 L2 L3 TB Sai số 0,831 0,658 0,871 0,749 0,848 0,711 0,841 0,690 0,832 0,659 0,873 0,748 0,850 0,710 0,843 0,690 0,830 0,658 0,871 0,748 0,849 0,714 0,842 0,691 36,669 29,035 38,434 33,050 37,419 31,373 37,110 30,447 36,713 29,079 38,522 33,006 37,507 31,329 37,198 30,447 36,624 29,035 38,434 33,006 37,463 31,506 37,154 30,491 36,669 29,050 38,463 33,021 37,463 31,403 37,154 30,462 0,045 0,025 0,051 0,025 0,044 0,092 0,044 0,025 Phụ lục Ảnh hưởng hàm lượng nitơ đến hoạt độ cellulase chủng Bacillus Hàm Pha Kí hiệu lượng ̣ loãng chủng nitơ (% (lần) ĐM19.1 40 ∆OD L1 L2 0,877 0,876 Hoạt độ cellulase (UI/g) L3 L1 L2 0,877 38,698 38,654 L3 38,698 TB Sai số 38,683 0,025 93 ĐM20.2 ĐM19.1 ĐM20.2 ĐM19.1 ĐM20.2 ĐM19.1 ĐM20.2 ĐM19.1 ĐM20.2 40 40 40 40 40 40 40 40 40 0,755 0,923 0,798 0,969 0,880 0,874 0,760 0,816 0,731 0,754 0,925 0,797 0,969 0,881 0,875 0,759 0,815 0,731 0,754 0,925 0,797 0,968 0,881 0,874 0,760 0,817 0,733 33,315 40,728 35,212 42,758 38,831 38,566 33,536 36,007 32,256 33,271 40,816 35,168 42,758 38,875 38,610 33,491 35,962 32,256 33,271 40,816 35,168 42,714 38,875 38,566 33,536 36,051 32,344 33,286 40,787 35,183 42,743 38,860 38,581 33,521 36,007 32,285 0,025 0,051 0,025 0,025 0,025 0,025 0,026 0,045 0,051 Phụ lục Ảnh hưởng pH ban đầu đến hoạt độ cellulase chủng Bacillus pH 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 Kí hiệu chủng ĐM19.1 ĐM20.2 ĐM19.1 ĐM20.2 ĐM19.1 ĐM20.2 ĐM19.1 ĐM20.2 ĐM19.1 ĐM20.2 ĐM19.1 ĐM20.2 ĐM19.1 ĐM20.2 Pha loãng (lần) 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 Hoạt độ cellulase (UI/g) ∆OD L1 L2 L3 L1 L2 L3 TB Sai số 0,753 0,695 0,828 0,823 0,933 0,892 0,974 0,858 0,960 0,816 0,841 0,700 0,787 0,550 0,754 0,697 0,827 0,824 0,931 0,893 0,975 0,859 0,958 0,816 0,839 0,701 0,785 0,550 0,752 0,696 0,827 0,823 0,933 0,892 0,974 0,859 0,960 0,818 0,837 0,7 0,787 0,551 33,227 30,667 36,536 36,315 41,169 39,360 42,978 37,860 42,361 36,007 37,110 30,888 34,727 24,269 33,271 30,756 36,492 36,360 41,081 39,404 43,023 37,904 42,272 36,007 37,022 30,932 34,639 24,269 33,183 30,712 36,492 36,315 41,169 39,360 42,978 37,904 42,361 36,095 36,933 30,888 34,727 24,313 33,227 30,712 36,507 36,330 41,140 39,375 42,993 37,889 42,331 36,036 37,022 30,903 34,698 24,284 0,044 0,045 0,025 0,026 0,051 0,025 0,026 0,025 0,051 0,051 0,089 0,025 0,051 0,025 Phụ lục Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ cellulase chủng Bacillus Pha ∆OD Hoạt độ cellulase (UI/g) loãng L1 L2 L3 L1 L2 L3 TB Sai số (lần) ĐM19.1 40 0,881 0,879 0,879 38,875 38,787 38,787 38,816 0,051 Nhiệt Kí hiệu độ (0C chủng 25 94 30 35 40 45 50 ĐM20.2 ĐM19.1 ĐM20.2 ĐM19.1 ĐM20.2 ĐM19.1 ĐM20.2 ĐM19.1 ĐM20.2 ĐM19.1 ĐM20.2 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 0,801 0,982 0,872 0,960 0,899 0,876 0,809 0,825 0,716 0,711 0,658 0,802 0,981 0,873 0,960 0,900 0,875 0,810 0,825 0,715 0,711 0,657 0,801 0,982 0,873 0,962 0,901 0,875 0,812 0,824 0,716 0,712 0,657 35,345 43,331 38,478 42,361 39,669 38,654 35,698 36,404 31,594 31,373 29,035 35,389 43,287 38,522 42,361 39,713 38,610 35,742 36,404 31,550 31,373 28,991 35,345 43,331 38,522 42,449 39,757 38,610 35,830 36,360 31,594 31,418 28,991 35,360 43,316 38,507 42,390 39,713 38,625 35,757 36,389 31,579 31,388 29,006 0,025 0,025 0,025 0,051 0,044 0,025 0,067 0,025 0,025 0,026 0,025 Phụ lục 10 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ CPE B Pha pH loãng (lần) 500 500 500 500 500 500 ∆OD L1 0,039 0,594 0,190 0,155 0,082 0,068 L2 0,040 0,594 0,192 0,154 0,080 0,068 Hoạt độCPE B (UI/g) L3 L1 L2 L3 TB 0,041 107,56 110,31 113,07 110,31 0,595 1638,17 1638,17 1640,93 1639,09 0,193 523,99 529,51 532,27 528,59 0,155 427,47 424,71 427,47 426,55 0,081 226,15 220,63 223,39 223,39 0,067 187,53 187,53 184,78 186,62 Sai số 2,76 1,59 4,21 1,59 2,76 1,59 Phụ lục 11 Ảnh hưởng nồng độ chất đến hoạt độ CPE B Nồng ∆OD Pha độ loãng chất L1 L2 L3 (lần) (%) 0,5 500 0,062 0,061 0,064 Hoạt độ CPE B (UI/g) L1 L2 L3 TB Sai số 170,99 168,23 176,50 171,91 4,21 95 1,0 500 0,593 0,595 0,595 1635,41 1640,93 1640,93 1639,09 1,5 500 0,226 0,228 0,227 623,28 628,79 626,03 626,03 2,0 500 0,156 0,156 0,157 430,23 430,23 432,98 431,15 2,5 500 0,101 0,100 0,102 278,54 275,79 281,30 278,54 3,0 500 0,077 0,079 0,077 212,36 217,87 212,36 214,19 3,5 500 0,046 0,044 0,043 126,86 121,35 118,59 122,27 Phụ lục 12 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ CPE B 3,18 2,76 1,59 2,76 3,18 4,21 Pha ∆OD Hoạt độ CPE B (UI/g) Nhiệt loãng độ (0C (lần) L1 L2 L3 L1 L2 L3 TB Sai số 35 500 0,430 0,433 0,432 1185,88 1194,15 1191,40 1190,48 4,21 40 500 0,595 0,596 0,594 1640,93 1643,69 1638,17 1640,93 2,76 45 500 0,603 0,602 0,604 1662,99 1660,23 1665,75 1662,99 2,76 50 500 0,737 0,738 0,740 2032,54 2035,30 2040,82 2036,22 4,21 55 500 0,640 0,642 0,640 1765,03 1770,55 1765,03 1766,87 3,18 60 500 0,502 0,500 0,503 1384,45 1378,93 1387,20 1383,53 4,21 65 500 0,449 0,447 0,449 1238,28 1232,76 1238,28 1236,44 3,18 70 500 0,348 0,346 0,345 959,74 954,22 951,46 955,14 4,21 Phụ lục 13 Ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ CPE B Thời Pha ∆OD Hoạt độ cellulase (UI/g) gian loãng (phút) (lần) L1 L2 L3 L1 L2 L3 TB Sai số 500 0,396 0,398 0,399 1092,11 1097,63 1100,39 1096,71 4,21 10 500 0,737 0,737 0,738 2032,54 2032,54 2035,30 2033,46 1,59 15 500 0,747 0,745 0,746 2060,12 2054,61 2057,36 2057,36 2,76 20 500 0,775 0,773 0,776 2137,34 2131,83 2140,10 2136,42 4,21 25 500 0,850 0,850 0,852 2344,18 2344,18 2349,70 2346,02 3,18 30 500 0,923 0,922 0,923 2545,51 2542,75 2545,51 2544,59 1,59 35 500 0,940 0,940 0,943 2592,39 2592,39 2600,66 2595,15 4,78 40 500 0,656 0,655 0,658 1809,16 1806,40 1814,67 1810,08 4,21 96 97 [...]... nông nghiệp, cellulase được dùng trong xử lý đất để tăng độ màu mỡ Nhằm đa dạng hóa nguồn cung cấp enzyme cellulase từ VSV và nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp cellulase, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng cellulase ở một số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn Mục tiêu của đề tài Nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp cellulase của các chủng Bacillus phân lập từ đất vườn Nhiệm vụ... vườn Nhiệm vụ của đề tài 1 Phân lập được một số chủng Bacillus sinh enzyme cellulase từ đất vườn Từ đó, tuyển chọn ra chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao 2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái và một số đặc tính sinh học của các chủng đã chọn 3 Xác định nguồn cơ chất cảm ứng thích hợp cho sinh tổng hợp cellulase cao Khảo sát nồng độ cơ chất cảm ứng tối ưu cho sinh tổng hợp cellulase cao 4 Xác định các... có tính đa hướng và tính hợp đồng Đặc điểm này được thể hiện ở chỗ: một chất cảm ứng có thể cùng một lúc gây ra sự tổng hợp cảm ứng của một vài enzyme Chẳng hạn chất tổng hợp cảm ứng β-galactosidlactose (hoặc chất cảm ứng tương tự của nó) ngoài khả năng gây ra sự tổng hợp cảm ứng enzyme β-galactosidase còn đồng thời gây ra sự tổng hợp cảm ứng của hai enzyme khác nữa là galactosid permease (có tác dụng... MT nuôi cấy 22 1.3 Sự cảm ứng sinh tổng hợp enzyme 1.3.1 Hiện tượng cảm ứng Hiện tượng cảm ứng là hiện tượng làm tăng sự tổng hợp enzyme trong TB, khi bổ sung một chất nào đó vào MT nuôi cấy thì sự tổng hợp enzyme phân giải cơ chất đó sẽ tăng lên đáng kể Hiện tượng cảm ứng thường biểu hiện rất nhạy cảm ở VSV, hơn hẳn ở động vật, thực vật Hiện tượng cảm ứng có tính đa hướng và tính hợp đồng Đặc điểm... được khởi xướng bởi SrinivaSan và cs (1968) Năm 1971, người ta đã phân lập được một số loài VSV có khả năng phân giải cellulose trong dạ cỏ của động vật nhai lại Mandel (1960) đã nghiên cứu Sự cảm ứng tổng hợp enzyme cellulase của vi nấm bằng cellobiose” [62] 19 Năm 1991, Parminder và cộng sự đã nghiên cứu Sự sản xuất cellulase bởi chủng T reesei trên những nguồn cơ chất cellulose khác nhau ở các... Trần Thạnh Phong khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase từ Trichoderma reesei và Aspergilus niger trên môi trường lên men bán rắn [17] 20 Năm 2005, Lê Thị Hồng Nga nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng cellulase và pectinase của một số chủng nấm mốc [13] Năm 2006, Võ Thị Xuyến bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm cellulase từ một số chủng VSV và khả năng thủy phân cellulose [34] Năm 2012, Võ Hoài Bắc,... tính chất hợp đồng về số lượng Sự cảm ứng thường có tính chất dây chuyền Trong một hệ thống bao gồm nhiều phản ứng, cơ chất đầu tiên của hệ thống có thể cảm ứng quá trình tổng hợp tất cả các enzyme xúc tác cho quá trình chuyển hóa nó Điều này được thực hiện theo cơ chế sau: trước hết chất cảm ứng làm tăng quá trình tổng hợp enzyme tương ứng, sau đó sản phẩm của phản ứng này lại cảm ứng tổng hợp enzyme... cao 4 Xác định các điều kiện môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp cellulase 5 Phân loại đến loài 1 chủng Bacillus sinh tổng hợp cellulase có hoạt tính cao nhất 6 Xác định hiệu suất thu nhận của chế phẩm enzyme thô từ chủng cho hoạt tính cellulase cao nhất 7 Nghiên cứu một số đặc điểm của chế phẩm enzyme thô Thời gian và địa điểm nghiên cứu − Thời gian: từ tháng 11/2011 đến tháng 09/2012 − Địa điểm:... tính, tinh sạch, cố định và ứng dụng cellulose Một số công trình nghiên cứu về cellulose gần đây như: Nguyễn Thị Kiều Hoa, năm 2002, đã khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp cellulase ở Trichoderma reesei [6] Năm 2003, Lê Hồng Phú đã tiến hành nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme pectinase và cellulase trên vỏ cà phê của Aspergilus niger và ứng dụng trong sản xuất phân hữu cơ [18] Năm 2004,... sự nuôi cấy kết hợp hai chủng Aspergilus niger và T viridae” [56] Năm 2009, Abou –Taleb và cộng sự đã nghiên cứu “Các yếu tố ảnh hưởng đến dinh dưỡng và MT sản xuất cellulose của hai chủng trực khuẩn B alcalophilus S39 và B amyloliquefaciens C23” [35] Năm 2012, Afzal và cộng sự đã nghiên cứu “Đặc tính cellulase của B cereus MRLB1 phân lập từ đất [38]  Nghiên cứu trong nước Các nghiên cứu về cellulose ... cellulase số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn Mục tiêu đề tài Nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp cellulase chủng Bacillus phân lập từ đất vườn Nhiệm vụ đề tài Phân lập số chủng Bacillus sinh... PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thùy Dương NGHIÊN CỨU SỰ TỔNG HỢP CẢM ỨNG CELLULASE Ở MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VƯỜN Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC... chế tổng hợp cellulase Cao ngô, cao nấm men, pepton chất tăng sinh tổng hợp cellulase số chủng VSV, kìm hãm tổng hợp cellulase số chủng khác 1.3.4 Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzyme Sự tổng hợp