BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Phạm Thị Thu Ly KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA GIỐNG LAN DENDROBIUM MINI LAI TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS BÙI VĂN LỆ Thành phố Hồ Chí Minh – 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Ban Giám hiệu trường Đại học Sư phạm TP HCM, Phòng Đào tạo Sau đại học, Khoa Sinh học, tất thầy cô tận tình dạy dỗ, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian theo học trường - Thầy PGS TS Bùi Văn Lệ tận tình hướng dẫn, giảng dạy, bồi dưỡng kiến thức, đóng góp nhiều ý kiến quý báu tạo điều kiện tốt để em hoàn thành luận văn - ThS Hoàng Minh Tâm, ThS Đặng Thị Ngọc Thanh – thầy cô quan tâm, tận tình bảo cho em ý tưởng đề tài - Thạc sĩ Nguyễn Văn Vinh, Trạm huấn luyện thực nghiệm nông nghiệp Văn Thánh thuộc Trung tâm khuyến nông thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài - ThS Lê Minh Đức giúp đỡ hỗ trợ cho em công tác phòng thí nghiệm để em thực đề tài - Quý Thầy Cô ngành Sinh học khoa Sư phạm Khoa học Tự nhiên trường Đại học Sài Gòn tạo điều kiện thuận lợi để em học tập hoàn thành luận văn - Các bạn sinh viên ngành Sư phạm Sinh học trường Đại học Sài Gòn nhiệt tình giúp đỡ trình thực đề tài - Cảm ơn tất người thân, người bạn bên cạnh động viên suốt trình học tập - Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn ba mẹ, hai chị chồng yêu thương, động viên tạo điều kiện tốt cho hoàn thành qúa trình học tập Một lần xin chân thành cảm ơn TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2014 Phạm Thị Thu Ly MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược đặc điểm lan Dendrobium lan Dendrobium mini 1.1.1 Đặc điểm hình thái 1.1.2 Điều kiện sinh thái 1.1.2.1 Nhiệt độ 1.1.2.2 Độ ẩm chế độ tưới nước 1.1.2.3 Ánh sáng .8 1.1.2.4 Nhu cầu dinh dưỡng .8 1.1.3 Các phương pháp nhân giống lan Dendrobium Dendrobium mini tự nhiên 1.2 1.1.3.1 Giao phấn 1.1.3.2 Phương pháp tách chiết Sơ lược phương pháp nhân giống in vitro 1.2.1 Lược sử phát triển công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật 1.2.2 Tầm quan trọng phương pháp nhân giống in vitro .10 1.2.3 Điều kiện nhân giống in vitro 11 1.2.4 Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật 11 1.2.4.1 Giai đoạn 1: Chọn lựa khử trùng mẫu 11 1.2.4.2 Giai đoạn 2: Tạo thể nhân giống 11 1.2.4.3 Giai đoạn 3: Nhân giống in vitro 11 1.2.4.4 Giai đoạn 4: Tái sinh in vitro hoàn chỉnh 12 1.2.4.5 Giai đoạn 5: Chuyển vườm ươm 12 1.2.5 Những ưu điểm khó khăn nhân giống in vitro 12 1.2.5.1 Ưu điểm 12 1.2.5.2 Khó khăn 13 1.2.6 Sơ lược kỹ thuật dùng nuôi cấy mô thực vật .14 1.2.6.1 Nuôi cấy phôi .14 1.2.6.2 Nuôi cấy mô quan tách rời 14 1.2.6.3 Nuôi cấy mô phân sinh .15 1.2.6.4 Nuôi cấy bao phấn 15 1.2.6.5 Nuôi cấy tế bào đơn 15 1.2.6.6 Nuôi cấy protoplast 16 1.2.7 Các phương pháp nhân giống in vitro cho lan Denrdobium .17 1.2.7.1 Nhân giống chồi nách 17 1.2.7.2 Nhân giống chồi đỉnh 17 1.2.7.3 Nhân giống chồi bất định 17 1.2.7.4 Nhân giống qua nuôi cấy callus 17 1.2.7.5 Nhân giống đoạn giả hành 17 1.2.7.6 Nuôi cấy hạt lai 18 1.2.7.7 Dung hợp tế bào trần 18 1.3 Sơ lược phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) .18 1.4 Sơ lược phương pháp nuôi cấy tế bào môi trường lỏng lắc (nuôi cấy dịch treo tế bào) 19 1.5 Giới thiệu phôi soma protocorm like bodies (PLBs) 20 1.5.1 Giới thiệu phôi soma 20 1.5.2 Giới thiệu PLBs 21 1.6 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật 22 1.7 Một số chất hữu dùng nuôi cấy in vitro .23 1.8 Một số công trình nghiên cứu lan Dendrobium in vitro .24 1.8.1 Trong nước 24 1.8.2 Trên giới 24 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Vật liệu .26 2.1.1 Vật liệu nuôi cấy .26 2.1.2 Thiết bị dụng cụ 26 2.1.3 Hóa chất 26 2.2 Môi trường điều kiện nuôi cấy 26 2.3 Nội dung nghiên cứu 27 2.4 Phương pháp nghiên cứu 27 2.4.1 Nội dung 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu 27 Thí nghiệm 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu .27 2.4.2 Nội dung 2: Khảo sát loại môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai .29 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thành phần loại môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 29 2.4.3 Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 30 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng NAA BA đến khả cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 30 2.4.4 Nội dung 4: Khảo sát điều kiện nuôi cấy đến khả cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 31 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng đến khả cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 31 2.4.5 Nội dung 5: Khảo sát ảnh hưởng hợp chất hữu cơ: vitamin, đường, nước dừa, khoai tây, bánh dầu đến khả nhân nhanh chồi sinh trưởng giống lan Dendrobium mini lai 32 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ vitamin lên tăng sinh chồi môi trường lỏng lắc 32 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng bánh dầu đến khả sinh trưởng chồi giống lan Dendrobium mini lai 33 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu đến khả sinh trưởng chồi giống lan Dendrobium mini lai .35 Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu đến sinh trưởng giống lan Dendrobium mini lai giai đoạn tạo hoàn chỉnh 36 2.4.6 Xử lý, phân tích số liệu, kiện .37 2.5 Thời gian nghiên cứu 2.6 Nơi thực đề tài CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .38 3.1 Kết 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu 38 Thí nghiệm 1: Khảo sát phương pháp khử trùng mẫu .38 3.2 Kết 2: Khảo sát loại môi trường nuôi cấy cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 40 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng thành phần khoáng loại môi trường nuôi cấy đến cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 40 3.3 Kết 3: Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai .42 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng NAA BA đến khả cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 42 3.4 Kết 4: Khảo sát điều kiện nuôi cấy đến khả cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 47 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng ánh sáng đến khả cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 47 3.5 Kết 5: Khảo sát ảnh hưởng hợp chất hữu cơ: vitamin, đường, nước dừa, khoai tây, bánh dầu vitamin đến khả nhân nhanh chồi sinh trưởng giống lan Dendrobium mini lai 50 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ vitamin lên tăng sinh chồi môi trường lỏng lắc 50 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng bánh dầu đến khả sinh trưởng chồi giống lan Dendrobium mini lai 53 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu đến khả sinh trưởng chồi giống lan Dendrobium mini lai .59 Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu đến sinh trưởng giống lan Dendrobium mini lai giai đoạn tạo hoàn chỉnh 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .67 Kết luận 67 Kiến nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT NAA : α-naphthaleneacetic acid BA : 6-benzyl adenin ABA : abcisic acid IAA : indol acetic acid IBA : indolbutyric acid TDZ : thidiazuron MS : Murasgige Skoog WPM : Woody Plant Medium PLBs : Protocorm like bodies tTCL : Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào cắt theo chiều ngang lTCL : Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào cắt theo chiều dọc NT : Nghiệm thức DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Nồng độ javen thời gian khử trùng mẫu 27 Bảng 2.2 Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật bổ sung vào môi trường cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 30 Bảng 2.3 Điều kiện nuôi cấy nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật bổ sung vào môi trường cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 31 Bảng 2.4 Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật vitamin bổ sung vào môi trường ảnh hưởng đến tăng sinh chồi lan Dendrobium mini lai 33 Bảng 2.5 Nồng độ bánh dầu bổ sung vào môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng chồi lan Dendrobium mini lai 34 Bảng 2.6 Nồng độ cơm dừa bánh dầu bổ sung vào môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng chồi lan Dendrobium mini lai 35 Bảng 2.7 Nồng độ cơm dừa bánh dầu bổ sung vào môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng lan Dendrobium mini lai giai đoạn tạo hoàn chỉnh 36 Bảng 3.1 Kết ảnh hưởng nồng độ javen thời gian lắc mẫu lên trình khử trùng 38 Bảng 3.2 Ảnh hưởng thành phần khoáng loại môi trường nuôi cấy đến cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai 41 Bảng 3.3 Tỉ lệ mẫu sống ảnh hưởng BA NAA 43 Bảng 3.4 Tỉ lệ mẫu tạo PLBs ảnh hưởng BA NAA 43 Bảng 3.5 Tổng số chồi thu ảnh hưởng BA NAA 44 Bảng 3.6 Chiều cao chồi trung bình thu ảnh hưởng BA NAA 44 Bảng 3.7 Tỉ lệ mẫu sống ảnh hưởng BA NAA nuôi cấy điều kiện ánh sáng 47 Bảng 3.8 Tỉ lệ mẫu tạo PLBs ảnh hưởng BA NAA nuôi cấy điều kiện ánh sáng 48 Bảng 3.9 Tổng số chồi thu ảnh hưởng BA NAA nuôi cấy điều kiện ánh sáng 48 Bảng 3.10 Chiều cao chồi trung bình thu ảnh hưởng BA NAA nuôi cấy điều kiện ánh sáng 49 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nồng độ vitamin lên tăng sinh chồi lan môi trường lỏng lắc sau 49 ngày nuôi cấy 51 Bảng 3.12 Tỉ lệ nhân chồi lan ảnh hưởng bánh dầu 54 Bảng 3.13 Chiều cao trung bình ảnh hưởng bánh dầu 55 Bảng 3.14 Số trung bình thu ảnh hưởng bánh dầu 56 Bảng 3.15 Hình thái, màu sắc ảnh hưởng bánh dầu 57 Bảng 3.16 Tổng số chồi thu ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu 59 Bảng 3.17 Tỉ lệ nhân chồi ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu 60 Bảng 3.18 Chiều cao chồi trung bình thu ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu 60 Bảng 3.19 Số trung bình thu ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu 61 Bảng 3.20 Hình thái, màu sắc ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu 61 Bảng 3.21 Chiều cao trung bình thu ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu giai đoạn tạo hoàn chỉnh 63 Bảng 3.22 Số trung bình thu ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu giai đoạn tạo hoàn chỉnh 64 Bảng 3.23 Số rễ thu ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu giai đoạn tạo hoàn chỉnh 64 Bảng 3.24 Hình thái, màu sắc ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu giai đoạn tạo hoàn chỉnh 66 59 NT NT NT NT 10 NT 11 NT 12 Hình 3.9 Chồi lan Dendrobium mini lai loại môi trường bánh dầu khác sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức đến nghiệm thức 12 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu đến khả sinh trưởng chồi giống lan Dendrobium mini lai Nguồn chất hữu thành phần quan trọng bổ sung vào môi trường nuôi cấy in vitro, nghiên cứu môi trường nuôi cấy mô phong lan người ta bổ sung thêm nhiều loại thành phần hữu khác nhằm làm tăng hiệu nuôi cấy Sau 49 ngày nuôi cấy nghiệm thức khác nhau, khả sinh trưởng chồi lan Dendrobium mini lai thể qua kết sau: Bảng 3.16 Tổng số chồi thu ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu Nghiệm thức ngày 18 18 18 18 18 18 Chỉ tiêu theo dõi Tổng số chồi (chồi) 21 ngày 35 ngày 60 80 56 77 76 85 52 67 50 63 47 59 49 ngày 112 106 121 85 83 82 Các số trung bình cột với mẫu kí tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p = 0,05 60 Bảng 3.17 Tỉ lệ nhân chồi ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu Chỉ tiêu theo dõi Tỉ lệ nhân chồi Nghiệm thức ngày 21 ngày 35 ngày 49 ngày 1,00 ± 0,00 3,32 ± 0,34c 4,46 ± 0,09e 6,24 ± 0,14 1,00 ± 0,00 3,09 ± 0,12bc 4,28 ± 0,11d 5,87 ± 0,09b 1,00 ± 0,00 4,20 ± 0,09d 4,72 ± 0,06f 6,70 ± 0,12d 1,00 ± 0,00 2,87 ± 0,26ab 3,70 ± 0,18c 4,74 ± 0,14a 1,00 ± 0,00 2,76 ± 0,12ab 3,50 ± 0,09b 4,59 ± 0,12a 1,00 ± 0,00 2,59 ± 0,14a 3,26 ± 0,03a 4,54 ± 0,09a Các số trung bình cột với mẫu kí tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p = 0,05 Bảng 3.18 Chiều cao chồi trung bình thu ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu Chỉ tiêu theo dõi Chiều cao chồi trung bình (cm) Nghiệm thức ngày 21 ngày 35 ngày 49 ngày * 0,65 ± 0,01c 0,86 ± 0,01c 1,21 ± 0,01d * 0,67 ± 0,02c 0,95 ± 0,01d 1,34 ± 0,02e * 0,73 ± 0,02d 1,02 ± 0,01e 1,49 ± 0,02f * 0,58 ± 0,02b 0,79 ± 0,06b 1,15 ± 0,01c * 0,52 ± 0,01a 0,71 ± 0,01a 1,07 ± 0,03b * 0,51 ± 0,01a 0,70 ± 0,03a 0,88 ± 0,05a Các số trung bình cột với mẫu kí tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p = 0,05 61 Bảng 3.19 Số trung bình thu ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu Chỉ tiêu theo dõi Số trung bình (lá) Nghiệm thức ngày 21 ngày 35 ngày 49 ngày 2,07 ± 0,06a 2,57 ± 0,03bc 2,98 ± 0,03b 3,41 ± 0,09c 2,09 ± 0,03a 2,52 ± 0,03bc 2,96 ± 0,06b 3,35 ± 0,09c 2,09 ± 0,09a 2,74 ± 0,03d 3,65 ± 0,09c 4,02 ± 0,09d 2,06 ± 0,06a 2,48 ± 0,06b 2,72 ± 0,06a 3,13 ± 0,09b 2,04 ± 0,06a 2,59 ± 0,09c 3,02 ± 0,09b 3,48 ± 0,06c 2,04 ± 0,06a 2,22 ± 0,06a 2,65 ± 0,14a 2,93 ± 0,17a Các số trung bình cột với mẫu kí tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p = 0,05 Bảng 3.20 Hình thái, màu sắc ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu Chỉ tiêu theo dõi Nghiệm thức Hình thái, màu sắc ngày 21 ngày 35 ngày 49 ngày ++ +++ +++ +++ ++ ++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++ Các số trung bình cột với mẫu kí tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p = 0,05 Ghi chú: Rất nhỏ: * Lá đẹp, đều, xanh mướt: +++ Lá xanh, chồi không đều: ++ Lá xanh, không mướt, chồi không đều: + 62 Qua thực nghiệm 49 ngày nuôi cấy nhận thấy chồi nhân nhanh nghiệm thức cho tổng 121 chồi (Bảng 3.16) với tỉ lệ nhân chồi đạt 6,70 chồi/cây (Bảng 3.17), chồi có chiều cao trung bình 1,49 cm kích thước chồi đồng (Bảng 3.18, Hình 3.10) Các môi trường nuôi cấy chứa hàm lượng cơm dừa nhiều nghiệm thức 5, có tổng chồi thu được, tỉ lệ nhân chồi chồi có chiều cao thấp, chồi có kích thước không đồng Nghiệm thức môi trường chứa thành phần bản, không chứa cơm dừa bánh dầu sau trình nuôi cấy cho số cao số chồi tạo thành 112 chồi (Bảng 3.16), tỉ lệ nhân chồi 6,24 chồi/cây (Bảng 3.17), chiều cao chồi 1,21 cm đồng kích thước, chồi hình thành èo uột, chồi cao thấp (Bảng 3.18; Hình 3.10) Các hình thành nghiệm thức nuôi cấy xanh, nghiệm thức số trung bình thu 4,02 lá/cây cao hơn, mướt nghiệm thức 2,93 lá/cây (Bảng 3.19; 3.20; Hình 3.10) NT NT NT NT NT NT6 Hình 3.10 Lan Dendrobium mini lai môi trường MS có bổ sung cơm dừa bánh dầu xử lý nhiệt sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức đến nghiệm thức 63 Vậy môi trường nuôi cấy bổ sung 20 mg/l cơm dừa 50 mg/l bánh dầu qua xử lý nhiệt môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi giống lan Dendrobium mini lai Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu đến sinh trưởng giống lan Dendrobium mini lai giai đoạn tạo hoàn chỉnh Ở thí nghiệm chứng minh môi trường MS nuôi cấy lan Dendrobium mini có bổ sung thêm 20 mg/l cơm dừa 50 mg/l bánh dầu xử lý nhiệt số chất cần thiết khác than hoạt tính, khoai tây có khả ảnh hưởng mạnh đến khả sinh trưởng chồi giống lan Dendrobium mini lai so với nghiệm thức khác Tuy nhiên tiến hành thí nghiệm tìm hiểu ảnh hưởng cơm dừa bánh dầu đến sinh trưởng giống lan Dendrobium mini lai giai đoạn tạo hoàn chỉnh với nghiệm thức thí nghiệm kết khác thể qua bảng số liệu 3.21; 3.22; 3.23 3.24: Bảng 3.21 Chiều cao trung bình thu ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu giai đoạn tạo hoàn chỉnh Chỉ tiêu theo dõi Chiều cao trung bình (cm) Nghiệm thức ngày 21 ngày 35 ngày 49 ngày 3,18 ± 0,01a 3,37 ± 0,01a 3,63 ± 0,01a 3,87 ± 0,00a 3,26 ± 0,01b 3,49 ± 0,00b 3,76 ± 0,00b 4,04 ± 0,00c 3,34 ± 0,00d 3,59 ± 0,01e 3,85 ± 0,01d 4,11 ± 0,00e 4,35 ± 0,00e 4,56 ± 0,00f 4,82 ± 0,01e 5,04 ± 0,01f 3,34 ± 0,00d 3,58 ± 0,01d 3,83 ± 0,03c 4,09 ± 0,01d 3,33 ± 0,01c 3,52 ± 0,01c 3,75 ± 0,00b 3,99 ± 0,00b Các số trung bình cột với mẫu kí tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p = 0,05 64 Bảng 3.22 Số trung bình thu ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu giai đoạn tạo hoàn chỉnh Chỉ tiêu theo dõi Chiều cao trung bình (cm) Nghiệm thức ngày 21 ngày 35 ngày 49 ngày 4,09 ± 0,06bc 4,46 ± 0,09ab 4,94 ± 0,11bc 5,43 ± 0,03a 4,13 ± 0,03c 4,65 ± 0,09c 5,02 ± 0,09c 5,46 ± 0,06a 4,29 ± 0,03d 4,56 ± 0,11bc 4,98 ± 0,09bc 5,52 ± 0,09a 4,39 ± 0,06d 4,91 ± 0,03d 5,46 ± 0,03d 5,93 ± 0,12b 4,02 ± 0,03b 4,37 ± 0,03a 4,85 ± 0,03ab 5,43 ± 0,14a 3,87 ± 0,09a 4,35 ± 0,06a 4,79 ± 0,09 5,39 ± 0,06a Các số trung bình cột với mẫu kí tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p = 0,05 Bảng 3.23 Số rễ thu ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu giai đoạn tạo hoàn chỉnh Chỉ tiêu theo dõi Số rễ Nghiệm thức ngày 21 ngày 35 ngày 49 ngày * ** ** ** * ** ** ** * ** *** *** * ** *** *** * ** ** ** * ** ** ** Các số trung bình cột với mẫu kí tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p = 0,05 Ghi chú: Rất nhiều: *** Nhiều: ** Ít: * 65 Bảng 3.24 Hình thái, màu sắc ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu giai đoạn tạo hoàn chỉnh Chỉ tiêu theo dõi Hình thái, màu sắc Nghiệm thức ngày 21 ngày 35 ngày 49 ngày ++ ++ + + ++ ++ + + ++ ++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ + ++ ++ ++ + Các số trung bình cột với mẫu kí tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p = 0,05 Ghi chú: Lá đẹp, đều, xanh mướt: +++ Lá xanh, chồi không đều: ++ Lá xanh, không mướt, chồi không đều: + Từ kết thí nghiệm cho thấy lan Dendrobium mini lai giai đoạn tạo hoàn chỉnh sinh trưởng phát triển tốt môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm 30 mg/l cơm dừa 50 mg/l bánh dầu xử lý nhiệt (nghiệm thức 4) với chiều cao đạt sau 49 ngày nuôi cấy 5,04 cm (Bảng 3.21; Hình 3.11); số trung bình thu 5,93 lá/cây (Bảng 3.22; Hình 3.11); đẹp, đều, xanh chồi Trong đó, nghiệm thức môi trường nuôi cấy không bổ sung thêm cơm dừa bánh dầu nên kết lan Dendrobium mini lai sinh trưởng kém, cao 3,87 cm (Bảng 3.21; Hình 3.11), qua ngày nuôi cấy dần xấu đi, chồi không Các nghiệm thức lại thu kết tương đương nhau, nhiên nghiệm thức môi trường nuôi cấy bổ sung thêm hàm lượng cơm dừa nhiều nên lan bị ảnh hưởng không tốt cho sinh trưởng lan, cao 3,99cm (Bảng 3.21; Hình 3.11) 66 NT1 NT4 NT2 NT5 NT3 NT6 Hình 3.11 Lan Dendrobium mini lai giai đoạn tạo hoàn chỉnh môi trường MS có bổ sung cơm dừa bánh dầu xử lý nhiệt sau 49 ngày nuôi cấy 67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết thu nhận được, đề tài rút kết luận sau: Các mẫu cắt lát mỏng chồi lan non ngâm lắc với javen 60% 16 phút để tiêu diệt bào tử nấm mốc, vi khuẩn với tỉ lệ mẫu sống đạt 61,11% Môi trường khoáng tối ưu cho việc nhân giống lan Dendrobium mini môi trường MS với kết thu sau 60 ngày nuôi cấy tổng số chồi 92 chồi với chiều cao chồi trung bình đạt 0,56 cm số trung bình đạt 2,67 lá/cây Môi trường cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai tối ưu môi trường nghiệm thức có môi trường nuôi cấy bổ sung BA mg/l NAA 0,5 mg/l với tỉ lệ mẫu sống 62,96%, tỉ lệ tạo PLBs 59,82%, tổng số chồi tạo thành 261 chồi chiều cao chồi trung bình 0,59 cm Khi nuôi cấy lan Dendrobium mini lai môi trường bổ sung chất điều hòa sinh trưởng nồng độ khác điều kiện có ánh sáng cho kết cảm ứng tạo chồi lan tiêu cao nuôi cấy điều kiện ánh sáng; chồi có kích thước lớn Ở môi trường nuôi cấy có bổ sung BA mg/l NAA 0,5 mg/l thu kết tốt với tỉ lệ mẫu sống 62,96%, tỉ lệ tạo PLBs 59,82%, tổng số chồi tạo thành 261 chồi chiều cao chồi trung bình 0,59 cm Khi nuôi cấy mẫu điều kiện ánh sáng môi trường nuôi cấy bổ sung BA mg/l NAA 0,5 mg/l mẫu cấy có tỉ lệ sống cao sau 60 ngày nuôi cấy (59,26%) tổng số chồi cao với 204 chồi; tỉ lệ mẫu tạo PLBs (66,67%) chiều cao chồi (0,61 cm) đạt cao lại thu mẫu cấy môi trường có bổ sung BA mg/l NAA 0,5 mg/l Môi trường nuôi cấy bổ sung thêm vitamin với nồng độ mg/l giúp cho giống lan Dendrbium mini lai sinh trưởng phát triển tốt, sau 49 ngày nuôi cấy thu 68 chồi, tỉ lệ sống 100%, hình thái chồi thu mập, đồng đều, xanh đẹp Môi trường nuôi cấy bổ sung bánh dầu qua xử lí nhiệt với liều lượng 50 mg/l cho kết khả quan cho sinh trưởng chồi lan, phù hợp dùng tạo môi 68 trường nuôi cấy giúp nhân chồi tạo hoàn chỉnh, với tỉ lệ nhân chồi 1,54 chồi/cây; chiều cao 2,63 cm; số 3,90 lá; xanh, đẹp Sau 49 ngày nuôi cấy môi trường, khả sinh trưởng chồi thể tốt môi trường nuôi cấy có bổ sung 20 mg/l cơm dừa 50 mg/l bánh dầu qua xử lý nhiệt, số chồi tạo thành 121 chồi; tỉ lệ nhân chồi 6,70 chồi/cây; chồi có chiều cao trung bình 1,49 cm kích thước chồi đồng số trung bình 4,02 lá/cây với hình thái, màu sắc xanh, mượt, đẹp Lan Dendrobium mini lai giai đoạn tạo hoàn chỉnh sinh trưởng phát triển tốt môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm 30 mg/l cơm dừa 50 mg/l bánh dầu xử lý nhiệt, với chiều cao đạt sau 49 ngày nuôi cấy 5,04 cm; số trung bình thu 5,93 lá/cây; đẹp, đều, xanh chồi Kiến nghị - Tiếp tục khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng NAA BA đến khả cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai môi trường lỏng lắc - Tìm môi trường hạn chế việc tiết phenol cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào TCL - Tiếp tục thực phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào lTCL (lát cắt dọc) để cảm ứng tạo chồi lan Dendrobium mini lai môi trường thạch lỏng lắc - Tiếp tục áp dụng bánh dầu xử lí nghiệm thức với nồng độ khác để tìm môi trường thích hợp cho lan sinh trưởng phát triển, nhân nhanh chồi tạo hoàn chỉnh 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Thiên Ân (2002), Những phương pháp trồng lan, Nxb Mỹ Thuật, TP Hồ Chí Minh Trần Văn Bảo (1999), Kỹ thuật nuôi trồng phong lan, Nxb Trẻ, TP Hồ Chí Minh Bùi Bá Bổng (1995), Nhân giống phương pháp nuôi cấy mô, Sở Khoa Học công nghệ môi trường An Giang Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (2011), Hóa sinh học, Nxb Giáo dục Việt Nam Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2009), Nhân giống lanDendrobium anosmum, Dendrobium mini phương pháp nuôi cấy mô; Nghiên cứu loại giá thể trồng lan Dendrobium mini thích hợp cho hiệu cao, đề tài nghiên cứu, Trường ĐH An Giang Đỗ Đăng Giáp, Thái Xuân Du, Đoàn Thị Ái Thuyền (2009), Nghiên cứu phát sinh hình thái nuôi cấy lớp mỏng tế bào (thin cell layer) hồ tiêu (piper nigruml.), Đại học Quốc gia, TP Hồ Chí Minh Lê Văn Hoàng (2008), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Giáo trình, Đại học Đà Nẵng Trần Quang Hoàng (2005), Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến trình nuôi cấy in vitro hai giống lan Dendrobium Cymbidium, đề tài nghiên cứu Trần Hợp (1998, 2000), Phong lan Việt Nam Nxb Nông Nghiệp TP Hồ Chí Minh 10 Dương Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô thực vật (tập I,II,III), Nxb Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 11 Nguyễn Xuân Linh (2002), Điều tra thu thập đánh giá bảo tồn nguồn gen hoa cảnh khu vực miền bắc Việt Nam, Nxb Nông nghiệp 12 Vương Thị Hồng Loan (2012), Khảo sát khả nhân nhanh Protocorm like bodies tái sinh chồi lan Mokara vàng chanh hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời Rita, đề tài nghiên cứu 13 Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thuỷ Tiên (2006), Công nghệ tế bào, Nxb Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 70 14 Nguyễn Công Nghiệp (2004), Trồng hoa lan – In lần ba, Nxb Trẻ, TP Hồ Chí Minh 15 Trần Văn Minh (2007), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Giáo trình, Đại học Huế 16 Vũ Ngọc Phương cs ( 2007), Nhân giống vô tính phong lan in vitro điều kiện ánh sáng tự nhiên, Hội khoa học Công nghệ sinh học thực vật công tác nhân giống chọn tạo giống hoa, Nxb Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh 17 Huỳnh Văn Thới (2005), Cẩm nang nuôi trồng kinh doanh phong lan, Nxb Trẻ Hà Nội 18 Nguyễn Bảo Toàn (2004), Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật, Nxb trường Đại học Cần Thơ, khoa Nông Nghiệp 19 Nguyễn Thanh Tùng cộng (2010), Phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào nhân giống in vitro lan hoàng thảo thân gãy (Dendrobium aduncum), đề tài nghiên cứu 20 Nguyễn Vũ Thị Hoàng Uyên (2005), Nhân giống lan Dendrobium phương pháp gieo hạt in vitro, đề tài tốt nghiệp đại học Tiếng Anh 21 Joseph A (2001), Micropropagation of Orchids, volume I, developmetal and cell biology University of California Irvine, Blackwell Publishing 22 Nasiruddin K.M., Begun R., and Yasmin S., (2003), Protocorm like Bodies and Plantlet Regeneration from Dendrobium formosum Leaf Callus, Asian Journal of Plant Sciences (13): 955 - 957 23 Talukder S.K., Nasiruddin K.M., Yasmin S., Hassan L., and Begum R., (2003), Shoot Proliferation of Dendrobium Orchid with BAP and NAA, Journal of Biological Sciences 71 PHỤ LỤC Thành phần môi trường MS (Murashige – Skoog, 1962) Thành phần Nồng độ (mg/l) Đa lượng NH NO 1650 CaCl 2H O 440 MgSO 7H O 370 KNO 1900 KH PO 170 Vi lượng Na EDTA 37,3 FeSO 7H O 27,8 MnSO 4H O 22,3 H BO 6,2 ZnSO 4H O 8,6 KI 0,83 Na MoO 2H O 0,25 CuSO 5H O 0,02 CoCl 6H O 0,025 Vitamin Glycine 2,0 Pirydoxine 0,5 Meso-inositol 100 Nicotinic acid 0,5 Thiamin HCl 0,1 72 Thành phần môi trường B5 (Gamborg cs, 1976) Thành phần Nồng độ (mg/l) Đa lượng (NH ) SO 134 CaCl H O 150 MgSO 7H O KNO 246 2,528 Vi lượng H BO 3,0 CoCl 6H O 0,025 CuSO 5H O 0,025 FeSO 7H O 27,8 MnSO H O 10 KI 0,75 Na MoO 2H O 0,25 NaH PO 2H O 150 ZnSO 7H O 2,0 Na EDTA.2H O 37,2 Vitamin Pirydoxine 1,0 Meso-inositol 100 Nicotinic acid 1,0 Thiamin HCl 10 73 Thành phần môi trường WPM (Woody Plant Medium, 1980) Thành phần Nồng độ (mg/l) Đa lượng NH NO 400 Ca(NO ) 4H O 556 CaCl 2H O 96 MgSO 7H O 370 K SO 990 KH PO 170 Vi lượng H BO 6,2 ZnSO 7H O 8,6 Na EDTA.2H O 37,2 CuSO 5H O 0,25 FeSO 7H O 27,8 MnSO 4H O Na MoO 2H O 22,3 0,25 Vitamin Glycine 2,0 Pirydoxine 0,5 Meso-inositol 100 Nicotinic acid 0,5 Thiamin HCl 1,0 [...]... chồi lan Dendrobium mini lai tốt nhất - Xác định môi trường nhân chồi lan Dendrobium mini lai tối ưu trong điều kiện in vitro - Xác định môi trường tạo cây lan con Dendrobium mini lai hoàn chỉnh tốt nhất trong điều kiện in vitro  Đối tượng nghiên cứu Giống lan Dendrobium mini lai  Nội dung nghiên cứu Khảo sát quy trình khử trùng mẫu Khảo sát môi trường cảm ứng tạo chồi Khảo sát môi trường nhân chồi Dendrobium. .. nhân giống lan trên qui mô công nghiệp, các cây lan con được sản xuất hoàn toàn giống nhau từ một cây bố mẹ quí mới được lai tạo và được xem là có giá trị sau lần ra hoa đầu tiên Do đó, đề tài Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của giống lan Dendrobium mini lai trong điều kiện nuôi cấy in vitro được thực hiện  Mục tiêu của đề tài - Xác định được phương pháp khử trùng... Các yếu tố ngoại cảnh như ánh sáng, nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi nuôi cấy in vitro Thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ và ánh sáng thấp hơn phôi phát triển tự nhiên [7] 1.2.6.2 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời Wetmore (1946) nuôi cấy đỉnh chồi cây nho dại, cùng với một số tác giả khác, ông đã chứng minh các bộ phận của cây đều có thể nuôi cấy khi gặp điều kiện thuận lợi Lon và Ball... như vitamin (B1, B6, B3…) và các chất điều hòa sinh trưởng Muốn duy trì sinh trưởng và phát triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường mới Đối với nuôi cấy mô, ngoài những thành phần dinh dưỡng như đối với nuôi cấy cơ quan tách rời, cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạng acid amin, đường và inositol Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hòa sinh trưởng. .. chế) quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật Chính vì vậy, chúng có vai trò hết sức quan trọng trong nuôi cấy mô Các chất điều hòa sinh trưởng thường được sử dụng là: - Auxin: Loại auxin thường sử dụng là NAA, IBA, IAA Chúng có tác dụng nhiều mặt lên các quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sự sinh trưởng của quả, tạo... 1.2.6.3 Nuôi cấy mô phân sinh Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồi mới hình thành hay các cành non Đối với nuôi cấy mô phân sinh sự cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trưởng rất quan trọng Muốn kích thích tạo chồi cần bổ sung cytokinine hoặc tổ hợp cytokinine với auxin Muốn tạo rễ thì bổ sung các auxin như NAA, IAA… Nuôi cấy. .. trọng trong quá trình nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro 1.2.5 Những ưu điểm và khó khăn trong nhân giống in vitro 1.2.5.1 Ưu điểm Nhân giống in vitro có những ưu điểm sau: - Tạo các cây con đồng nhất và giống cây mẹ So với kiểu nhân giống thông thường (chiết cành, hom), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng... nhân chồi Dendrobium mini lai trong điều kiện in vitro Khảo sát môi trường tạo cây lan con Dendrobium mini lai hoàn chỉnh trong điều kiện in vitro  Thời gian nghiên cứu Từ tháng 01/12/2013 đến 31/01/2014: Viết và bảo vệ đề cương Từ tháng 2/2014 đến tháng 8/2014: Thu mẫu, thực nghiệm, lặp lại nghiệm thức Tháng 8/2014: Hoàn thành luận văn  Nơi thực hiện đề tài Phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học, trường Đại... 3.3 Lan Dendrobium mini lai nuôi cấy trên môi trường MS, Gamborg B5 và WPM sau 60 ngày 42 Hình 3.4 PLBs sau 60 ngày nuôi cấy trên nghiệm thức 1 đến nghiệm thức 8 46 Hình 3.5 PLBs sau 60 ngày nuôi cấy trên nghiệm thức 1 đến nghiệm thức 8 trong điều kiện không có ánh sáng 50 Hình 3.6 Sự tăng sinh chồi lan trong môi trường lỏng lắc sau 49 ngày nuôi cấy từ nghiệm thức 1 đến. .. trường chứa đường và khám phá ra một điều là nếu thiếu đường thì phôi không thể phát triển thành protocorm Raghavan (1976, 1980) đã công bố rằng phôi phát triển quan hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng Ở giai đoạn dị dưỡng (tiền phôi) cần có các chất điều hòa sinh trưởng để phát triển Trong giai đoạn tự dưỡng, sự phát triển của phôi không cần chất điều hòa sinh trưởng Đối với nuôi cấy phôi, như đã biết ... nghiệm 6: Ảnh hưởng bánh dầu đến khả sinh trưởng chồi giống lan Dendrobium mini lai 53 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng cơm dừa, bánh dầu đến khả sinh trưởng chồi giống lan Dendrobium mini lai ... vào môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng chồi lan Dendrobium mini lai 34 Bảng 2.6 Nồng độ cơm dừa bánh dầu bổ sung vào môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng chồi lan Dendrobium mini lai. .. Dendrobium mini lai tốt - Xác định môi trường nhân chồi lan Dendrobium mini lai tối ưu điều kiện in vitro - Xác định môi trường tạo lan Dendrobium mini lai hoàn chỉnh tốt điều kiện in vitro  Đối